Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter
Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie
These
Zur Erlangung des Grades eines
Philosophical Doctor - Ph.D. –
im Fachgebiet Pathologie
an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
von Stefan Schmidbauer aus Cham
Hannover 2003
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
Betreuungsgruppe: 1. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst 2. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Erstgutachter: 1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer, Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover 2. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst, Institut für Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover
3. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Zweitgutachter: Priv.-Doz. Dr. S. Rittinghausen, Abteilung für Toxikologie und Umwelthygiene, Fraunhoferinstitut für Toxikologie und
Aerosolforschung Hannover
Tag der mündlichen Prüfung:20.11.03
Meinen Eltern
als Dank und zur Freude
Teile dieser Arbeit wurden bei folgendem wissenschaftlichem Kongress vorgetragen:
SCHMIDBAUER, S.-M., A. D. GRUBER, M. VENNER und W. DROMMER (2003):
Kompensierte Überexpression der Kollagensynthese nach experimenteller Induktion eines akuten Alveolarschadens durch Perillaketon (1-(3-furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd.
46. Tagung der Fachgruppe Pathologie in der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, Bamberg, 10. Juni 2003
Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:
SCHMIDBAUER, S.-M., M. VENNER, G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, W.
DROMMER and A.D. GRUBER (2003):
Compensated overexpression of procollagens a1(I) and a1(III) after experimental perilla mint ketone-induced acute pulmonary damage in horses.
J. Comp. Pathol. (submitted)
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG UND ZIELE DER ARBEIT S. 11
2. LITERATURÜBERSICHT S. 13
2.1 Die Normalstruktur der Lunge S. 13
2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25
2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose S. 28
2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von
Apoptose und Nekrose S. 28
2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei diffusem Alveolarschaden S. 29
2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker S. 31
2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge S. 32
2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III S. 33
2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels S. 34 2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III
bei diffusem Alveolarschaden S. 37
2.6 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) S. 39 2.6.1 Struktur, Regulation und Signalbildung S. 39
2.6.2 Allgemeine Funktion S. 40
2.6.3 Einfluss von TGF-β auf den Kollagenstoffwechsel S. 42 2.6.4 Die Rolle von TGF-β im Entzündungsgeschehen S. 44 2.6.5 Rolle von TGF-β bei akutem Alveolarschaden S. 46 2.6.6 Bedeutung von TGF-β bei Rege neration und Reparation
nach akutem Alveolarschaden S. 48
2.7 Interleukin-1ß (IL-1ß) S. 50
2.7.1 Allgemein S. 50
2.7.2 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese
von IL-1ß S. 51
2.7.3 Interleukin-1 bei Wundheilung und entzündlichen
Lungenveränderungen S. 52 2.8 Perillaketon (PK) als lungentoxisches Agens S. 55
3 MATERIAL UND METHODEN S. 59
3.1 Untersuchungsmaterial S. 59
3.2 Allgemeine Versuchsplanung S. 61
3.3 Methoden S. 63
3.3.1 Fixierung und Archivierung der Lungenbiopsieproben S. 63 3.3.2 Paraffineinbettung und Schnittherstellung für
licht -mikroskopische und immunhistochemische
Untersuchungen sowie terminal dUTP nick-end labeling
(TUNEL) S. 63
3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen S. 64 3.3.3.1 Bestimmung der Zellproliferationsrate S. 64 3.3.3.2 Bestimmung des Anteils der Makrophagen-
und Granulozytenpopulation an der
Gesamtzellzahl der Lunge S. 64
3.3.4 Bestimmung der Zelluntergangs rate im
terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) -Assay S. 67 3.3.5 Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern
an den alveolären Septen S. 69
3.3.6 Licht - und transmissionselektronenmikroskopische
Untersuchung S. 70
3.3.7 Molekularbiologische Präparationen S. 71
3.3.7.1 Allgemeine Maßnahmen S. 71
3.3.7.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem
Lungengewebe S. 72
3.3.7.3 Reverse Transkription S. 73
3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) S. 74
3.3.8 Klinischer Score S. 79
3.4 Statistische Auswertung S. 80
4 ERGEBNISSE S. 81
4.1 Licht - und elektronenmikroskopische Untersuchungen S. 81 4.1.1 Biopsieproben vor der Applikation von Perillaketon S. 81 4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon S. 82 4.2 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen S. 99
4.2.1 Zellproliferationsrate S. 99
4.2.2 Zelluntergangsrate S. 102
4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und
Granulozyten an der Gesamtzellzahl S. 105 4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und
retikulären Fasern S. 107
4.3 Untersuchungen zur Genexpression S. 109 4.3.1 Kontrolle der mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese S. 110
4.3.2 Ergebnisse der qPCR S. 110
4.3.3 Expressionsrate von Interleukin-1β S. 111 4.3.4 Expressionsrate von TGF-β S. 113 4.3.5 Expressionsrate von Prokollagen a1(I) S. 115 4.3.6 Expressionsrate von Prokollagen a1(III) S. 117 4.4 Vergleich mit den klinischen Befunden S. 119
5 DISKUSSION S. 121
6 ZUSAMMENFASSUNG S. 139
7 SUMMARY S. 141
8 LITERATURVERZEICHNIS S. 143
9 ANHÄNGE S. 205
9.1 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen (Rohdaten) S. 205 9.2 Ergebnisse der Reverse-Transkriptase quantitativen
Polymerase-Kettenre aktion (Rohdaten) S. 213 9.3 Reaktionslösungen und Färbungen S. 228
8
Abkürzungsverzeichnis
A Adenosin
A-aDO2 Alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz AI-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ I AII-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ II ADC Active Cell Death
AIP Atypische Interstitielle Pneumonie ALI Acute Lung Injury
AP-1 Activator Protein-1
ARDS Acute Respiratory Distress Syndrom ATP Adenosin-5´-triphosphat
BALF Bronchioalveoläre Lavageflüssigkeit BALT Bronchus-associated Lymphatic Tissue bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BMP Bone Morphogenetic Protein bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin ca. cirka
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CD Cluster of Differentiation
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease CYP450 Cytrochrom P450
DAB Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid DAD Diffuse Alveolar Damage
DC Dendritic Cells DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic Acid DNase Desoxyribonuclease
dNTP 2´-Desoxyribonucleosid-5´-triphosphate dUTP 2´-Uracil-5´-triphosphat
EF-1a Elongationfactor-1a
EGF Epidermal Growth Factor ER endoplasmatisches Retikulum etc. et cetera
GSSG Glutathiondisulfid HE Hämalaun-Eosin
ICAM Intercellular Adhesion Molecule ICE Interleukin Converting Enzyme IFN Interferon
IGF Insulin- like Growth Factor IL Interleukin
ILD Interstitial Lung Disease IPF Idiopathic Pulmonary Fibrosis i.v. intra venam
K Kontrolle KG Körpergewicht LPS Lipopolysaccharide
LTGF Latent Transforming Growth Factor MHC Major Histocombatibility Complex MIS Mullerian Inhibitory Substance MOV Multisystemisches Organversagen mRNA Messenger-Ribonucleic Acid
NADPH Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide-Phosphate N-PCP III N-terminal Procollagenpeptide Type III
NSIP Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia NTC No Template Control
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1 PBS Phosphate Buffered Saline
PICP C-terminal Procollagenpeptide Type I PIIICP C-terminal Procollagenpeptide Type III PDGF Platelet Derived Growth Factor
PGE Prostaglandin E PK Perillaketon
Proa1(III) Prokollagen a1(III) Proa1(I) Prokollagen a1(I)
qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
ROI Reactive Oxygen Intermediates
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction s Standardabweichung
SARA Smad Anchor for Receptor Activation Smad Mother against decapentaplegic Homolog TdT Terminal desoxynucleotidyl Transferase TEM Transmissionselektronenmikroskopie TGF Transforming Growth Factor
TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinases TNF Tumor Necrosis Factor
tRNA Transfer-Ribonucleic Acid TUNEL terminal dUTP nick end labeling
U Uracil
V Variationskoeffizient x arithmetischer Mittelwert xg x Erdbeschleunigung
11
1 Einleitung und Ziele der Arbeit
Leistungsverluste bei Sportpferden stellen ein in zunehmendem Maße auftretendes Problem dar, wobei hierfür als eine wesentliche Ursache interstitielle Lungenerkrankungen anzusehen sind (BUERGELT et al., 1986, 1995; WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990).
Zentral im Krankheitsgeschehen steht als Folge zahlreicher, sehr heterogener Insulte ein initialer, akuter Alveolarschaden. Im anschließenden subakuten und chronischen Stadium laufen regenerative und reparative Prozesse ab, wobei unter günstigen Voraussetzungen eine vollständige Ausheilung möglich ist. Vielfach werden jedoch mehr oder weniger stark ausgeprägte, irreversible Veränderungen in Form einer Lungenfibrose beobachtet, die mit Ablagerung vor allem der Kollagentypen I und III im Bereich der alveolären Septen einhergeht (DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995;
BRUCE, 1995). Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr stark variieren, und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei relativ geringer Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare Leistungseinbußen (DIEKMANN et al., 1990).
Über die Pathogenese des akuten Alveolarschadens und der interstitiellen Pneumonie existieren bereits bei verschiedenen Spezies zahlreiche Untersuchungen. Im Besonderen fehlen jedoch beim Pferd kontinuierliche Untersuchungen über längere Zeiträume, die alle Phasen des Krankheitsverlaufs mit einschließen. Ein Modell der interstitiellen Pneumonie beim Pferd könnte daher einen großen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Pathogenese und zu einer Verbesserung der klinischen Diagnostik leisten. Es sollte daher an transkutan entnommenen Lungenbiopsieproben geklärt werden, ob eine einmalige intravenöse Applikation von Perillaketon (1-(3- furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd zur Induktion eines akuten Alveolarschadens und einer interstitielle Pneumonie geeignet ist. Diese Veränderungen können potenziellen Modellcharakter für Untersuchungen der Lungenfibrose besitzen.
Die Ziele der Arbeit waren:
1. Beschreibung der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen über einen Zeitraum von vier Wochen nach Applikation im Hinblick auf morphologische und strukturelle
Alterationen sowie auf die Expression Pathogenese-relevanter Gene (IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1)).
2. Ermittlung des Grades einer interstitiellen Fibrose als möglicher Spätschaden.
3. Beurteilung der prognostischen Relevanz der Genexpression von IL-1ß, TGF-ß, COL1A1 und COL3A1.
4. Bewertung des Verfahrens als Modell für interstitielle Lungenerkrankungen beim Pferd.
Die Entzündungsmediatoren IL-1ß und TGF-ß sowie die extrazellulären Matrixprotein- vorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) besitzen große Bedeutung in der Pathogenese akuter und chronischer Lungenerkrankungen. Weiterhin sollen in diesem Zusammenhang Parameter für die Kollagens ynthese aussichtsreiche Kandidaten für prognostische Faktoren quoad restitutionem und quoad vitam darstellen (WAYDHAS et al., 1993; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000, MIKUNIYA et al., 2000). Die Bestimmung der Genexpression von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) durch Reverse Transkriptase – quantitative Polymerasekettenreaktion könnte raschere und exaktere Ergebnisse liefern als die bisher überwiegend auf Proteinebene durchgeführten Untersuchungen. Zur Bearbeitung dieser Fragestellungen musste ein neues Verfahren etabliert werden, das die Quantifizierung dieser Parameter einschließlich der Genexpressionsraten intra vitam erlaubte. Für die Untersuchung der aus den Lungenbiopsieproben gewonnenen mRNA-Spezies stand mit der quantitativen Polymerasekettenreaktion eine moderne, hochspezifische und –sensitive Methode zur Verfügung, die auch für die Analyse von Minimalbiopsieproben geeignet war.
In der vorliegenden Arbeit erfolgten somit erstma lig zusammenhängende und umfassende Untersuchungen zur Pathogenese der interstitiellen Pneumonie des Pferdes in den verschiedenen Stadien der Erkrankung. Die innovative Kombination der verschiedenen Methoden und die Etablierung der Untersuchungsverfahren zur Genexpression von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) beim Pferd kann über die eigene Arbeit hinaus bei zukünftigen Fragestellungen eine große Hilfe sein. Parallel zu dieser Arbeit wurden umfassende Untersuchungen mittels erweiteter klinischer und sekretzytologischer Methoden sowie bildgebender Verfahren von Frau Dr. Venner durchgeführt, um den Krankheitsverlauf klinisch systematisch zu erfassen.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Normalstruktur der Lunge
Die Gliederung der Lunge in einzelne Lappen ist tierartlich unterschiedlich und unter den Haussäugetieren beim Pferd am wenigsten ausgeprägt. Unterschieden werden an jeder Lunge des Pferdes ein Lobus cranialis und ein Lobus caudalis, wobei dem Lobus caudalis pulmonis dexter der Lobus accessorius medial angefügt ist. Typisch für das Pferd ist auch die Aufzweigung des Bronchialbaumes. Der Bronchus cranialis teilt sich in beiden Lungen in einen cranialen und caudalen Bronchus segmentalis. Der craniale Segmentbronchus entlässt wiederum vie r bis fünf dorsale und ventrale Äste, während sich vom caudalen vier kräftige ventrale sowie fünf bis sieben kurze dorsale Bronchi segmentales abspalten (NICKEL u.
WILKENS, 1987).
2.1.1 Histologie, Ultrastruktur und Funktion
Allgemein
Im Anschluss an die terminalen Bronchioli, die den letzten Abschnitt des ausschließlich luftleitenden Systems der Lunge bilden, finden sich die Bronchioli respiratorii und Ductus alveolares. Die Wände der Alveolargänge bestehen aus dünnen spiralartig angeordneten Bändern aus kollagenen und elastischen Fasern, zwischen denen die ebenfalls spiralig angeordneten Mündungen der Alveoli liegen (WHIMSTER, 1970). Diese Anordnung entspricht den Windungen einer Feder und besitzt daher die Fähigkeit sich in Abhängigkeit von Inspiration und Exspiration zu dehnen und zusammenzuziehen. Die Alveolarwände setzen sich aus penta- oder hexagonalen Abschnitten zusammen und bilden ein Polyeder (ODERR, 1964). Das System der Alveolargänge und der polyedrischen Alveolen ist durch seine Anordnung in der Lage, sich optimal an die bei der Atmung erfolgenden Volumenänderungen anzupassen. Die Form der Alveolen, die Oberflächenspannung des alveolären Flüssigkeitsfilms und in geringerem Maße bindegewebige Komponenten wie
kollagene und elastische Fasern sind hauptverantwortlich für die Compliance der Lunge (HABER et al., 1983). Die Dehnungsfähigkeit der Lunge wird durch oberflächenaktive Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, erhöht. Insgesamt setzt sich die Lunge aus über 42 verschiedenen Zelltypen zusammen, über die bereits in den siebziger Jahren umfangreiche Übersichtsartikel verfasst wurden (JEFFEREY u. REID, 1975; BREEZE u.
WEEHLDON, 1977). Allein im Bereich der luftleitenden Wege finden sich zwölf unterschiedliche Typen von Epithelzellen.
Die interalveolären Septen
Die interalveolären Septen, Septa interalveolaria, bilden den Hauptteil des lufttauschenden Gewebes der Säugetierlunge. Diese Septen trennen benachbarte Lumina von Alveolen und sind aus dem Alveolarepithel, einem umfangreiche n Kapillarsystem und aus interstitiellem Bindegewebe aufgebaut, wobei Epithel und Endothel jeweils einen Anteil von ca. 30 % an der Ausbildung der Blut-Luft-Schranke haben und das interstitielle Bindegewebe etwa 40 % (WEIBEL u. KNIGHT, 1964). Auf der einen Seite der Alveolarwand sind die Kapillaren eng mit dem Alveolarepithel verbunden. Hier fusionieren die endo- und epitheliale Basalmembran. An der gegenüberliegenden Seite sind Epithel und Endothel durch schmale Bahnen interstitiellen Bindegewebes getrennt (CORRIN, 2000). Neben Endo- und Epithelzellen finden sich als weiterer wichtiger Zelltyp die Alveolarmakrophagen (RIESNER, 1978). Sehr früh konnte festgestellt werden, dass die Septen keine kontinuierlichen, lückenlosen Platten darstellen, sondern von Öffnungen unterbrochen sind (MACKLIN, 1936).
Diese so genannten Kohn´schen Poren stellen eine Verbindung zwischen benachbarten Alveolen her (KOHN, 1893) und sollen dem kolateralen Druckausgleich dienen (PARRA et al., 1978). Diese Öffnungen können außer beim Pferd (KAUP et al., 1990a) noch bei zahlreichen anderen Spezies wie Mensch, Ratte (GIL u. WEIBEL, 1969), Maus (RANGA u.
KLEINERMAN, 1980) und Hund (PARRA et al., 1978) beobachtet werden und sind von intaktem Alveolarepithel gesäumt. Es finden sich bis zu sieben Poren in einer Alveole, deren Durchmesser zwischen 2 und 13 µm liegt. Zum Zeitpunkt der Geburt sind diese Öffnungen noch nicht ausgebildet und entwickeln sich erst in den frühen Lebensabschnitten.
Das Alveolarepithel
Die Alveolaroberfläche besteht bei Mensch und Tier hauptsächlich aus zwei Zelltypen, den flachen, im Bereich der Alveolarsepten gelegenen Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI- Zellen) bzw. Pneumozyten Typ I und den größeren, vor allem in den alveolären Nischen gelegenen granulierten Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII- Zellen) bzw. Pneumozyten Typ II (BASKERVILLE, 1970; WEIBEL, 1973; WAGNER et al., 1973; WEIBEL et al., 1976).
Die Zellen an der Alveolaroberfläche sind über tight junctions miteinander verbunden und bilden so ein kontinuierliches Epithel (WEIBEL, 1973; SCHNEEBERGER et al., 1976), wobei die Typ I-Zellen mit ihren Zytoplasmaausläufern krakenartig benachbarte Typ II- Zellen überlappen. Der ultrastrukturelle Aufbau dieser Zellen ist bei allen bisher untersuchten Tierarten sehr ähnlich (z.B. Mensch (BARTELS, 1979), Hase (MOORE u. SCHOENBERG, 1964), Rind (RYBICKA et al., 1974), Hamster (KUHN, 1978), Ratte (WEIBEL et al., 1976;
KAUP, 1982), Pferd (KAUP et al., 1990a)).
Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI-Zellen)
Alveolarepithelzellen vom Typ I besitzen nur wenige Organellen und sind durch ihr flaches Zytoplasma gekennzeichnet, das sich ausgehend von der nukleären Zone über eine verhältnismäßig große Fläche ausdehnt. Sie bedecken beim Menschen im Schnitt eine Fläche von bis zu 5098 µm2, weisen jedoch nur eine Dicke von etwa 0,2 µm auf. Insgesamt beträgt ihr Anteil an der Gesamtzellpopulation der Lunge 8 %, sie bedecken jedoch ca. 95 % der inneren Oberfläche (CRAPO et al., 1982). AI- Zellen sollen auch in der Lage sein Alveolarwände zu penetrieren, so dass ein und dieselbe Zelle beide Seiten des Alveolarseptums bedecken kann (WEIBEL, 1973). Ihre Aufgabe besteht in der Ausbildung einer kontinuierlichen, aber sehr schmalen Auskleidung des weitaus größten Teils der Alveolaroberfläche und sie sind somit einerseits an der Bildung der Blut-Luft-Schranke beteiligt, andererseits dienen sie zusammen mit anderen Faktoren der Aufrechterhaltung der mechanisch-statischen Stabilität der Alveole (RADFORD, 1964). Von großer Bedeutung ist auch ihre Barrierefunktion zur Vermeidung eines übermäßigen Flüssigkeitsverlustes über die Lungenoberfläche. Typ I-Zellen sind untereinander und mit Typ II-Zellen über tight-junctions verbunden (KAUP et al., 1990a). Im Zytoplasma weisen sie zahlreiche Pinozytosevesikel auf, die der Resorption von Makromolekülen dienen (SCHNEEBERGER, 1976; LAUWERYNS
u. BAERT, 1977). Die dünnen Ausläufer der Typ I-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber zahlreichen exogenen schädigenden Einflüssen. Zusammen mit dem Kapillarendothel stellen sie die vulnerabelste Komponente der Lunge dar (CORRIN, 2000).
Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII-Zellen)
Zu den wichtigsten Funktionen der AII-Zellen gehören Synthese, Sekretion und Speicherung oberflächenaktiver Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, das der Herabsetzung der Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Luft und Alveolarwand dient. AII- Zellen stellen weiterhin die Stammzellpopulation für Alveolarepithelzellen vom Typ I dar.
Auf einen Alveolarschaden mit Verlust von AI-Zellen folgt eine Regeneration mit Proliferation von AII- Zellen und anschließender Differenzierung zu Typ I-Zellen (ADAMSON u. BOWDEN, 1974; MASON et al., 1977ab; SUTINEN et al., 1980). Der natürliche Turnover von AII-Zellen dauert etwa 25 Tage, während für die Differenzierung in AI-Zellen nur ca. 48 h nötig sind. Histologisch treten dabei Übergangsformen auf (EVANS et al., 1975). Weitere wesentliche Funktionen der AII-Zellen sind die Metabolisierung und Detoxifikation von Xenobiotika (DOMIN et al., 1986) und ihre Beteiligung an der Modulation der Hypophase des oberflächenaktiven Films (MASON et al., 1977ab) bzw. an der Resorption von Flüssigkeit und Elektrolyten aus der Hypophase und deren Weitertransport in das Interstitium. Sie halten in der wässrigen alveolären Hypophase ein konstantes Elektrolytverhältnis und einen pH von 6,8 aufrecht (VAN GOLDE et al., 1988).
AII-Zellen sezernieren auch Bestandteile der extrazellulären Matrix (z. B. Fibronektin, Prokollagen Typ IV, Thrombospondin, Laminin, Kollagen Typ V) (MASON et al., 1982;
SAGE et al., 1983; LWEBUNGA-MUKASA et al., 1984; CROUCH et al., 1987; SINGH et al., 1988), Proteine des klassischen und alternativen Komplementsystems (STRUNK et al., 1988) und bei der Ratte konnte auch die Produktion von Lysozym nachgewiesen werden (ADAMSON u. KING, 1985). Die Alveolarepithelzellen vom Typ II besitzen kubische Gestalt und werden hauptsächlich in den Nischen der Alveolen angetroffen. Sie machen nur 12-15 % der Gesamtzellpopulation der Lunge aus, stellen jedoch ca. 65 % des Gesamtzellgehaltes der Alveole und bedecken etwa 3 % der Alveolaroberfläche (WEIBEL et al., 1976; MORGENROTH u. KISSLER, 1980; HAIES et al., 1981). Untersuchungen an Ratten haben gezeigt, dass die AII-Zellen kurz nach der Geburt diffus über die Alveole verteilt sind, sich mit zunehmendem Alter der Tiere jedoch immer mehr in Bereich der
alveolären Nischen konzentrieren: Einen Tag nach der Geburt befinden sich etwa 30 % aller AII-Zellen in den alveolären Nischen, am dritten Tag 50 %, am 5. Tag 78 % und beim adulten Tier 81 % (SHAPIRO et al., 1989). Ultrastrukturell weist die Oberfläche der AII-Zellen zahlreiche 0,1 µm dicke Mikrovilli mit axialen Filamenten und Exkretionsöffnungen auf (KUHN, 1978; KAUP et al., 1990a). Das organellenreiche Zytoplasma enthält neben einem gut entwickelten Golgiapparat, rauem endoplasmatischen Retikulum sowie zahlreichen Multivesikulärkörperchen und Mitochondrien die für diese Zellen typischen rundlichen bis ovalen osmiophilen Granula. Diese von einer Membran umgebenen, ca. 0,5 bis 1 µm großen Organellen bestehen aus konzentrisch angeordneten Lamellen, die eine Periodizität von 4,2 bis 9,4 nm aufweisen (KAUP, 1982; DOUGLAS et al., 1975; STRATTON et al., 1980; POST et al., 1982) und in denen elektronendichte Bereiche mit einer Dicke von 2,6 nm mit elektronendurchlässigen mit einer Breite von 1,6 nm alternieren. Aufgrund dieser Innenstruktur werden sie als Lamellärkörperchen oder Lamellar Bodies bezeichnet (WEIBEL et al., 1976; KAUP, 1982). Es handelt sich bei diesen Einschlüssen um intrazelluläre Speicher- und Sekretionsorganellen oberflächenaktiver Substanzen (Surfactant) (ASKIN u.
KUHN, 1971; GIL u. REISS, 1973). Der Volumenanteil der Lamellärkörperchen am Zytoplasma beträgt ca. 18 bis 24 % (MASSARO u. MASSARO, 1975). Die durchschnittliche Anzahl dieser Einschlüsse pro AII-Zelle ist tierartlich unterschiedlich: Beim Pferd finden sich bis zu acht (GILLESPIE u. TYLER, 1967ab) und bei der Ratte bis zu 150 Lamellar Bodies pro Zelle (YOUNG et al., 1981). Auch die Größe der Lamellärkörperchen weist Unterschiede auf. Die des Menschen besitzen im Vergleich zur Ratte einen geringeren Durchmesser und zeigen häufig eine multizentrische Anordnung der Lamellen (MORGENROTH u. KISSLER, 1980; DOBBS, 1990).
Alveoläres Interstitium
Das Bindegewebsgerüst der Lunge wird von deren Interstitium gebildet. Es ist am stärksten ausgeprägt in der Umgebung von Luftwegen und Arteriolen im Zentrum der Läppchen sowie um die Venen in deren Peripherie. Auf Ebene der Alveolen sind diese beiden wesentlichen Lokalisationen des pulmonalen Bindegewebes durch feine Verzweigungen verbunden, die letztlich das alveoläre Interstitium bilden. Dieses ist zusammengesetzt aus kollagenen und elastischen Fasern, zwischen denen sich Fibroblasten, Myofibroblasten und Histiozyten befinden. In diesem Bereich zeigen sich auch spärlich Nerven und Nervenendigungen. Die
Myofibroblasten liegen in enger räumlicher Beziehung zu den Kapillaren und regulieren die alveoläre Perfusion (ADLER et al., 1989). Zu den weiteren im Interstitium gelegenen Zellen gehören eine Form von Histiozyten, die einen Intermediärtyp zwischen Blutmonozyten und Alveolarmakrophagen darstellt (CROWELL et al., 1992; SEBRING u. LEHNERT, 1992;
JOHANNSON et al., 1997), Mastzellen und lymphoide Elemente. Die Alveolarwände weisen keine Lymphgefäße auf. Die interstitielle Flüssigkeit wird über die größeren Bindegewebsansammlungen im Bereich der Luftwege, Arteriolen und Venen drainiert. Die eigentliche Bindegewebsmatrix der Septen besteht zu 60 % aus kollagenen Fasern, die etwa 20 % des Trockengewichts ausmachen, zu 35 - 40 % aus elastischen Fasern und zu 1 - 2 % aus Proteoglykanen (HANCE u. CHRYSTAL, 1975). Bei den Kollagenfasern des Bindegewebes handelt es sich überwiegend um die Typen I und III, der Fasertyp II tritt in den Knorpelgewebsstrukturen des Tracheobronchialbaumes auf und Typ IV ist ein integraler Bestandteil der Basalmembran (CLARK et al., 1983; AMENTA et al., 1988). Die elastischen Fasern finden sich nach SOBIN et al. (1974) vor allem in der Wand der Ductus alveolares und zwischen den sie umgebenden Blutgefäßen. Gelegentlich bilden sie fächerförmig aufgesplitterte Ausläufer, die bis in die Alveolarsepten reichen.
Alveoläre Kapillaren
Die kontinuierlichen, alveolären Kapillaren bilden ein stark verflochtenes Netzwerk aus sich überkreuzenden Gefäßen (GUNTHEROTH et al., 1982). Pro Alveole existieren etwa 1000 solcher Kapillarsegmente (WEIBEL, 1984), wobei jede Blutzelle, die die Lunge durchfließt, etwa 60 von ihnen passiert. Begleitet werden die Kapillaren von lang ausgezogenen, kontraktilen Perizyten, die zahlreiche zytoplasmatische Filamente enthalten und in der endothelialen Basalmembran liegen (WEIBEL, 1974). Die auskleidenden Endothelzellen besitzen einen abgeflachten Kern und ein schmales, weit ausgezogenes Zytoplasma, das in seiner Dicke etwa der der AI-Zellen entspricht und eine Lebensdauer von etwa 100 bis 180 Tage n. Die einzelnen Zellen sind durch tight junctions und gap junctions miteinander verknüpft, überlappen sich häufig unter Ausbildung marginaler Falten und formen einen geschlossenen Verband. Es finden sich zahlreiche Pinozytosevesikel mit einem Durchmesser von 60 – 70 nm, die sich sowohl luminal als auch basal als Caveolae öffnen können und als solche teilweise noch mit einem Diaphragma, bestehend aus einer einfachen Membran, verschlossen sind. Leukozyten besitzen im Vergleich zu Erythrozyten aufgrund ihrer weniger
ausgeprägten Verformbarkeit eine geringere Passagegeschwindigkeit durch die dünnen Alveolarkapillaren (MACNEE u. SELBY, 1990), wobei diese Verzögerung bei entzündlichen Prozessen noch verstärkt wird. Im Gegensatz zum großen Kreislauf, in dem die Migration neutrophiler Granulozyten auf Ebene der Venulen stattfindet, erfolgt sie in der Lunge in den Alveolarkapillaren (DOWNEY et al., 1993).
Lungenmakrophagen
Da die Lunge permanent einer großen Bandbreite an Umweltpathogenen ausgesetzt ist, stellt sie eine wichtige Eintrittspforte für Infektionskrankheiten dar. Alveolarmakrophagen spielen daher im Atmungstrakt eine wesentliche Rolle im Rahmen der körpereigenen Abwehr und sind in der Lage zahlreiche zytotoxische und immunregulatorische Substanzen, wie ROI (Reactive Oxygen Intermediates), TNFα oder Interleukine, zu bilden (LOHMANN- MATTHES et al., 1994). In Abhängigkeit von ihrer Lokalisation lassen sich die Lungenmakrophagen in verschiedene Untergruppen einteilen: Alveolarmakrophagen, interstitielle und intravasale Makrophagen (LOHMANN-MATTHES et al., 1994).
Alveolarmakrophagen besitzen aufgrund ihrer Lokalisation in der Interphase des alveolären Surfactantfilms eine einzigartige Stellung (JOHNSSON et al., 1986). Es handelt sich um die einzigen Makrophagen im Organismus, die physiologischerweise Kontakt zu atmosphärischer Luft besitzen. Sie bilden somit die erste Linie der körpereigenen Abwehr gegen inhalierte Pathogene und spielen eine große Rolle bei der Clearence aufgenommener Staubpartikel.
Hinsichtlich der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose zeigen alveoläre und interstitielle Makrophagen dieselbe Effektivität (CROWELL et al., 1992; LAVNIKOVA et al., 1993). In Bezug auf andere Funktionen weisen diese beiden Subpopulationen erhebliche Unterschiede auf. So besitzen Alveolarmakrophagen eine höhere Aktivität bei der Fc-Rezeptor- unabhängigen Phagozytose, der Bildung von Sauerstoffradikalen und diversen Cytokine n wie TNFα und IFN-α / β, weisen jedoch eine vergleichsweise geringere Expression von MHCII- Molekülen, von IL-1 und IL-6 auf (STEINMÜLLER et al., 2000). Alveolarmakrophagen besitzen unregelmäßige Umrisse und zahlreiche Pseudopodien als prominente, zytoplasmatische Ausstülpungen. Das Zytoplasma ist reich an dichten Vesikeln mit lysosomalen Enzymen, ebenso an Phagosomen und multilokulären Phagolysosomen (CORRIN et al., 1969). Alveolarmakrophagen sind normalerweise in dem die Alveolen auskleidenden Flüssigkeitsfilm lokalisiert, können jedoch im Zuge einer Immersionsfixierung
abgeschwemmt werden. Das die innere Oberfläche der Lunge auskleidende Material ist chemotaktisch für Alveolarmakrophagen (SCHWARTZ u. CHRISTMAN, 1979), deren Phagozytoseaktivität zudem durch Surfactant gesteigert wird (LAFORCE et al., 1973).
Gleichzeitig dienen sie unter anderem auch dem Abbau von sezernierten Surfactantbestandteilen (RAO et al., 1981). Die Herkunft der Alveolarmakrophagen ist Gegenstand zahlreicher Diskussionen. Es existieren höchstwahrscheinlich zwei wesentliche Mechanismen für die Aufrechterhaltung dieser Makrophagenpopulation. Hierzu gehört zum einen die chemotaktische Rekrutierung von Blutmonozyten, die wiederum dem Knochenmark entstammen und unter steady-state-Bedingungen sowie bei akuten entzündlichen Veränderungen in die Alveolen emigrieren (BLUSSE VAN OUD ALBAS u. VAN FURTH, 1979; ADAMSON u. BOWDEN, 1980; BOWDEN u. ADAMSON, 1980; BLUSSE VAN OUD ALBAS et al., 1983; TAKAHASHI et al., 1996). Zum anderen spielt, da sich auch teilende Makrophagen in den Alveolarlumina nachweisen lassen, die Proliferation ortsständiger Zellen eine Rolle (GOLDE et al., 1974; CHEN et al., 1988; LOHMANN- MATTHES et al., 1994). Es existieren Hinweise darauf, dass die Proliferation vor Ort den größten Anteil an der Aufrechterhaltung der Population der Alveolarmakrophagen besitzt (SHELLITO et al., 1987). Die Verweildauer der Alveolarmakrophagen in der Lunge beträgt beim Menschen etwa sieben Tage (BOWDEN u. ADAMSON, 1982). Danach wird der größte Teil der Zellen über die Luftwege abtransportiert und schließlich abgeschluckt oder ausgehustet, wobei die Atembewegungen diese Wanderung unterstützen. Auch eine Rückkehr der Alveolarmakrophagen in das Interstitium ist möglich. Da sie dazu neigen sich in den Lungenbläschen anzusammeln, die die relativ unbeweglichen bronchiovaskulären Strukuren im Zentrum der Lungenacini begrenzen, erfolgt der Übertritt vor allem in diesem Bereich (HARMSEN et al., 1985). Es wird in diesem Zusammenhang angenommen, dass die interstitielle Translokation von Makrophagen eine Rolle bei der Antigenpräsentation und der Einleitung immunologischer Reaktionen spielt (HARMSEN et al., 1985). Bei Lungenerkrankungen zeigt sich sowohl eine erhebliche Zunahme an Alveolarmakrophagen als auch an weniger differenzierten, im Interstitium befindlichen Makrophagen. Letztere können gelegentlich bei der Emigration in das Alveolarlumen beobachtet werden (VIJEYARATNAM u. CORRIN, 1972). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass bei entzündliche n Reaktionen eine biphasische Antwort erfolgt, mit einem Influx von Monozyten in den ersten 24 Stunden und einer späteren Proliferation von Makrophagen im Interstitium (ADAMSON u. BOWDEN, 1980). Kinetikstudien haben ergeben, dass die meisten Monozyten, die sich in Alveolarmakrophagen umwandeln, sehr rasch in die Alveolen
auswandern und nur ein geringer Prozentsatz sich zuerst im Interstitium differenziert (ADAMSON u. BOWDEN, 1980, 1982). Die Reifung von Monozyten geht einher mit einer Zunahme an Zytoplasma, einer Abnahme der Myeloperoxidaseaktivität und der Entwicklung charakteristischer Lysosomen. Bei erhöhtem Bedarf können in den Alveolen aber auch unreife Makrophagen mit nur spärlichen Lysosomen beobachtet werden. Bei den verschiedenen Subpopulationen an Alveolarmakrophagen, die aufgrund unterschiedlicher Dichte getrennt werden können, handelt es sich vermutlich um einzelne Reifungsstadien (NAKSTAD et al., 1989).
Tabelle 1: Anteil von Makrophagen an der Gesamtzellzahl der Lunge bei verschiedenen Spezies
Mensch (CRAPO et al., 1982)
Pavian (CRAPO et al., 1994)
Ratte (CRAPO et al., 1980) Gesamtzellzahl / Lunge (x109) 230 ± 25 48 ± 5 0,89 ± 0,04 Anteil von Makrophagen an der
Gesamtzellpopulation (%)
9,4 ± 2,2 2,3 ± 0,7 3,0 ± 0,3
Lymphozyten
B- und T-Lymphozyten, wobei letztere in zwei Subpopulationen (Th1- und Th2-Zellen) unterteilt werden können, sind wesentlich an humoraler und zellulärer Immunabwehr sowie an Überempfindlichkeitsreaktionen beteiligt (Corrin, 2000). Sie spielen jedoch nur bei einem Teil der entscheidenden zellulären Interaktionen in Rahmen der primären und sekundären Immunreaktionen eine Rolle und müssen in enger Nachbarschaft zu antigenpräsentierenden Zellen lokalisiert sein. Es wird angenommen, dass auch im Körper zirkulierende und in die Lunge eingewanderte Lymphozyten aus dem Gastrointestinaltrakt nach oraler Immunisierung eine Rolle bei der pulmonalen Immunabwehr spielen. Lymphozyten finden sich sowohl im Bereich von Epithel und Lamina propria der luftführenden Wege, im Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe (BALT), im Lungenparenchym und den bronchioalveolären Räumen.
Zudem existiert ein pulmonaler intravaskulärer Pool, der sich in seiner Zusammensetzung aus den verschiedenen lymphozytären Subpopulationen vom peripheren Blut unterscheidet (Übersicht in PABST u. TSCHERNIG, 1995). Beim Pferd existieren vergleichsweise wenige
Untersuchungen über Verteilung und Anteile der einzelnen Subpopulationen in der Lunge.
Beim Menschen überwiegen im trachealen und bronchialen Epithel zytotoxische T-Zellen (CD8+) gegenüber T-Helferzellen (CD4+) (FOURNIER et al., 1989), B-Lymphozyten werden hier kaum angetroffen, während in der bronchialen Lamina propria CD4+-Zellen vorherrschen (HUNNINGHAKE et al., 1981). Stichprobenartige Untersuchungen von Lungenbiopsieproben (WATSON et al., 1997) weisen auf ähnliche Verhältnisse beim Pferd hin. Bei Patienten mit Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia (NSIP) und Lungenfibrose finden sich nach YAMADORI et al. (2000) B-Lymphozyten hauptsächlich im Bereich von Lymphfollikeln, CD4+-Lymphozyten sind in deren Peripherie und in den verbreiterten Wänden fibrotischer Alveolen lokalisiert, während CD8+-Zellen eher diffus verteilt sind. Bei diesen klinischen Entitäten zeigt sich auch eine Zunahme von Lymphozyten in der BALF. Die Rolle von Lymphozyten bei der Entstehung fibrotischer Veränderungen in Zusammenhang mit verschiedenen Lungenerkrankungen ist unterschiedlich. Aufgrund von Tierversuchsergebnissen vermuten MAJESKI et al. (2003), dass T-Lymphozyten von wesentlicher Bedeutung bei der Entwicklung einer intraluminalen Fibrose bei Bronchiolitis Obliterans Organizing Pneumonia sind, nicht jedoch bei ARDS. Nach DAVIS et al. (2001) existieren starke Hinweise darauf, dass Lymphozyten eine Rolle bei der Entstehung der silikoseinduzierten Lungenfibrose spielen, während IRIFUNE et al. (2003) bei chronischer Hypersensitivity Pneumonitis lediglich eine Beteiligung von TH1-Zellen an der Ausbildung einer reversiblen Alveolitis beschreibt, eine fibrogene Wirkung jedoch verneint. Beim Pferd lässt sich in Zusammenhang mit Chronischer Obstruktiver Bronchopneumonie (COB) eine erhebliche Zunahme an CD4+-Zellen und des CD4/CD8-Verhältnisses im peripheren Blut nachweisen (WATSON et al., 1997).
Dendritische Zellen (DC)
Beim Pferd existieren nahezu keine Untersuchungen über pulmonale, dendritische Zellen, während die Verhältnisse bei anderen Tierarten (z. B. Ratte (HOLT et al., 1990), Maus und Meerschwein (SCHOON-HEGRAD et al., 1991)) und beim Menschen (HOLT et al., 1989) ausführlich beschrieben sind. Sie besitzen eine nur kurze Lebensdauer, und die biologische Erneuerung, die innerhalb eines Zeitraums von 7 - 10 Tagen stattfindet, erfolgt, verglichen mit mehr als 21 Tagen bei epidermalen Langerhans-Zellen, sehr rasch. Sie reagieren auf bakterielle oder virale Infektionen mit einer raschen Proliferation (HOLT u. STUMBLES,
2000). Dendritische Zellen sind primär für Antigenprocessing, Antigenpräsentation und T- Zell- Aktivierung verantwortlich. Sie bestimmen maßgeblich das Ausmaß, die Kinetik und die Art einer adaptiven Immunreaktion (Übersicht in PEEBLES u. GRAHAM, 2001), sie sind jedoch auch über die Ausschüttung von IL-10 an der Ausbildung einer Toleranz gegenüber inhalierten Antigenen beteiligt (ABCARI et al., 2001). Ganz allgemein werden dendritische Zellen aufgrund ihres Reifegrades und ihrer Lokalisation eingeteilt (Übersicht in LIPSCOMB u. MASTEN, 2002):
- DC-Vorläufer in Knochenmark und Blut,
- unreife DC außerhalb lymphatischer Organe, z. B. im Trachealepithel,
- reifende DC nach Aufna hme von Antigenen, wie sie z. B. in afferenten Lymphgefäßen anzutreffen sind,
- reife, antigenpräsentierende DC in Lymphknoten.
In der humanen Lunge sind zwei verschiedene Arten von dendritischen Zellen beschrieben:
Follicular Dendritic Cells als Bestandteil des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes und S100-positive Interdigitating Dendritic Cells (HANCE, 1993; VANHAARST et al., 1994). Beide leiten sich von Stammzellen aus dem Knochenmark ab und erreichen die Lunge auf hämatogenem Wege. Interdigitating Dendritic Cells finden sich in Lymphknoten und sind weit verbreitet im Bindegewebe der Lunge, im Bereich der Wände von Bronchien, Bronchioli und Alveolen, interlobulären Septen und der Pleura anzutreffen. Sie besitzen lange zytoplasmatische Ausläufer, bilden an der Epithelbasis in den luftführenden Wegen ein Netzwerk und nehmen somit für die Erkennung inhalierter Antigene eine ideale Position ein.
Beide Typen von dendritischen Zellen dienen der Antigenpräsentation gegenüber T- Lymp hozyten. Die Antigenpräsentation erfolgt über deren Oberfläche in Assoziation mit dem HLA-DR-Histokompatibilitätskomplex. Auch größere antigentragende Partikel, wie Konidien oder Hyphen von Pilzen, werden phagozytiert. Langerhans-Zellen, die sich zwar überwiegend in der Epidermis, jedoch auch in geringer Anzahl in der Lunge finden, stellen eine Subpopulation dendritischer Zellen dar. Ebenso wie dendritische Zellen sind sie in der unveränderten Lunge in der Regel nicht im Alveolarlumen anzutreffen. Sie zeichnen sich durch die so genannten Birbeck-Granula aus (BIRBECK et al., 1961), die im Zuge der Ingestion oberflächengebundener Antigene im Zytoplasma entstehen. Bemerkenswert ist, dass sich pulmonale Langerhans-Zellen bei Patienten mit fibrotischen Lungenveränderungen nicht nur im Bronchialepithel, sondern auch im Epithel von Alveolen mit proliferierenden AII-
Zellen nachweisen lassen (KAWANAMI et al., 1981). Die Anzahl dendritischer Zellen steigt aufgrund ihrer Aufgabe an, Antigene im Rahmen von Immunreaktionen gegenüber Lymphozyten zu präsentieren (MCWILLIAM et al., 1994). DC können in diesem Zusammenhang aus dem Bereich des Epithels in die regionären Lymphknoten auswandern (HOLT et al., 1994). Dort sind in dendritischen Zellen MHC II / Antigen–Komplexe noch über längere Zeit nachweisbar (VU et al., 2002). Die Lebensdauer der dendritischen Zellen ist, wie bereits erwähnt, begrenzt und ihr Verbleib in den Lymphkno ten daher terminiert.
2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD)
Der Begriff Diffuse Alveolar Damage (DAD) ist in der Humanmedizin die Bezeichnung für ein Syndrom, das durch einen diffusen Schaden des Alveolarepithels und des Kapillarendothels im distalen Lungenparenchym hervorgerufen wird und gleicht in Ätiologie, Pathogenese und Verlauf dem Wesen der interstitiellen Pneumonie, wie sie in der Veterinärmedizin aufgefasst wird. Die klinischen Symptome als Folge dieser Veränderungen werden unter dem Begriff Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) zusammengefasst und sind charakterisiert durch respiratorische Insuffizienz, Zyanose und arterielle Hypoxämie, die letztlich zu einem extrapulmonalen Multisystemischen Organversagen (MOV) und zum Tod führen können. Klassischerweise wird der Ablauf der interstitiellen Pneumonie in drei Phasen eingeteilt: initiale Entzündung / exsudative Phase, fibroproliferative Phase und schließlich Regeneration oder interstitielle und interalveoläre Fibrose (ZAPOL et al., 1979;
KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Die Ergebnisse jüngerer Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, dass entzündliche und fibrotische Prozesse nicht wie ursprünglich angenommen nacheinander ablaufen, sondern parallel (ASHA et al., 1997; CHESNUTT et al., 1997b; MARSHALL et al., 2000). Wie weit interstitielle Pneumonien bei Pferden verbreitet sind, ist nicht genau geklärt. Zwar wiesen nach Untersuchungen von WINDER und VON FELLENBERG (1987) an 115 Schlachtpferden bereits 15,6 % der Tiere das histopathologische Erscheinungsbild einer interstitiellen Pneumonie auf, es wird jedoch noch zusätzlich mit einer erheblichen Dunkelziffer gerechnet. Nach der Auswertung von 4255 Sektionsfällen in Kentucky zwischen den Jahren 1993 und 1996 waren interstitielle Pneumonien mit 12,5 % aller Fälle die zweithäufigste Erkrankung der unteren Atemwege beim Pferd (WILLIAMS, 1997).
Das wesentliche pathohistologische Kriterium einer interstitiellen Pneumonie ist eine diffuse oder unregelmäßig verteilte Schädigung der alveolären Septen, die vorrangig zu einer initialen exsudativen Reaktion führt, gefolgt von proliferativen und / oder fibrotischen Prozessen (KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Dieser Zustand kann durch verschiedene Insulte herbeigeführt werden, zu denen neben infektiösen Ursachen (z. B. Influenza equi, Equines Arteriitis Virus, Pneumocystis carinii), anorganischen Stäuben (z. B. Silikose) Toxinen (Pyrrolizidinalkaloide, Crofton Weed, Perillaketon), Hypersensitivitätsreaktionen und akuter Pankreatitis auch Schock und Septikämie gehören, wobei die Ursache beim Pferd nur selten festgestellt werden kann (MOORE et al., 1981; TURK et al., 1981; BUERGELT et al., 1986;
DIEKMANN et al., 1990; BRUCE, 1995; BUERGELT, 1995; PERRON-LEPAGE et al., 1999; DEL PIERO, 2000). Auch die toxische Wirkung durch die therapeutische Applikation hochkonzentrierten Sauerstoffs ist eine mögliche Ursache (JUBB, 1991). Das Fehlen einer bevorzugten Orientierung der Schäden im Bereich kleiner luftführender Wege unterscheidet die interstitielle Pneumonie von der Bronchopneumonie. Im Allgemeinen treten die Veränderungen disseminiert auf, oft jedoch akzentuiert in den dorsokaudalen Lungenabschnitten. In den meisten Fällen sind die auslösenden Insulte für die Alveolarschäden hämatogenen Ursprungs, was zu einem ausgedehnten oder unregelmäßigen Verteilungsmuster der Schäden in den Azini führt, wohingegen sie bei aerogener Irritation zentroazinär lokalisiert sind. Es gibt jedoch auch Ausnahmen von dieser für den Ursprung der Noxen typischen Verteilung. Ebenso wie in anderen Organen sind die morphologisch fassbaren Reaktionen auf viele unterschiedliche Agentien sehr ähnlich und nicht spezifisch für die jeweilige Ätiologie. Unabhängig davon, ob die Ursachen toxischer, metabolischer oder infektiöser Natur sind, verursachen sie Schäden an Alveolarepithelzellen vom Typ I und am alveolären Kapillarendothel. Art, Eintrittspforte und Intensität einer Noxe bestimmen jedoch die zeitliche Reihenfolge, ob als Erstes Epithel- oder Endothelschäden auftreten. Aufgrund ihrer fehlenden Regenerationsfähigkeit sind Alveolarepithelzellen vom Typ I in der Regel am stärksten betroffen (JUBB, 1991). In einem frühen Stadium zeigen AI-Zellen Vesikelbildung im Zytoplasma, gefolgt von Zelluntergang, Ablösung und Freilegung der Basalmembran.
Auch an kapillären Endothelzellen findet sich eine Vesikelbildung, aufgrund ihres besseren Regenerationsvermögens lassen sich jedoch bloßgelegte endotheliale Basalmembranen nur sehr selten beobachten (CORRIN u. VIJEYARATNAM, 1975; BACHOFEN u. WEIBEL, 1977). Während dieser akuten Phase können serofibrinöses Exsudat, Stauung und Ödeme der Alveolarwände beobachtet werden. Fibrin, andere Serumproteine und Zelldebris kondensieren dabei häufig zu hyalinen Membranen (HILL et al., 1976; KATZENSTEIN et al., 1976).
Zudem finden sich im alveolären Exsudat für gewöhnlich Leukozyten und Erythrozyten sowie eine gemischtzellige, interstitielle Infiltration. Der Ersatz degenerierter AI- Zellen erfolgt durch Proliferation und Differenzierung von AII-Zellen, wobei die intakte Basalmembran als Leitschiene dient. Alveolen, gesäumt von kubischen AII-Zellen, sind ein typisches Zeichen für subakute bis chronische interstitielle Pneumonien (ADAMSON u. BOWDEN, 1974).
Nach Regression der Entzündung und bei fehlender Fibrose der Alveolarwände ist eine vollständige Heilung möglich. Die Proliferation der AII-Zellen markiert den Übergang von der exsudativen in die proliferative Phase. Beginnende fibrotische Veränderungen zu diesem Zeitpunkt sind mögliche und sehr kritische Prozesse. Bereits 72 h nach einem DAD kann die
Proliferation von Fibroblasten eintreten und unreife Fibroblasten können innerhalb von drei Tagen nach hochgradiger Exsudation in den Alveolarlumina beobachtet werden. Fibrotische Prozesse können also sowohl interalveolär als auch intraalveolär ablaufen, wobei deren Umfang vom Ausmaß der Entzündungsreaktion abhängt (MEDURI u. CHINN, 1994). Bei überlebenden Tieren heilen akute interstitielle Pneumonien mit mehr oder weniger stark ausgeprägter Narbenbildung ab. Ähnlich der kutanen Wundheilung sind auch in der Lunge Myofibroblasten mit in reparative Vorgänge einbezogen (PACHE et al., 1998). Chronische, progressive Entzündungen sind nur selten zu beobachten und stehen in Zusammenhang mit einer dauerhaften oder wiederholten Exposition gegenüber dem auslösenden Agens. Die chronische interstitielle Pneumonie ist durch die intraalveoläre Akkumulation mononukleärer Zellen - in erster Linie Makrophagen - durch Proliferation und Persistenz von AII-Zellen, interstitielle lymphozytäre Infiltrate und Zubildung von Bindegewebe charakterisiert (JUBB, 1991).
2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose
2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von Apoptose und Nekrose
Beim Zelluntergang ist grundsätzlich zwischen einem passiven und einem aktiv durch die Zelle selbst herbeigeführten Zelltod zu unterscheiden. Die Nekrose ist ein pathologisch bedingtes Absterben von Zellen infolge einer Noxe, wie z. B. Anoxie, chemischen oder physikalischen Einflüssen etc., die zu einer irreparablen Schädigung führen. Der Zelltod durch Apoptose wird durch zelleigene Proteine und energieabhängige Syntheseprozesse von der sterbenden Zelle aktiv vollzogen (GREEN et al., 1994), weshalb viele Autoren die Bezeichnung Active Cell Death (ADC) vorziehen (GREEN et al., 1994; SCHULTE- HERMANN et al., 1994).
Tabelle 2: Morphologische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose (THOMPSON et al., 1992)
Apoptose Nekrose
Absterben einzelner Zellen Absterben von Zellgruppen Vesikelbildung an der Zellmembran ohne
Integritätsverlust
Verlust der Membranintegrität
intakte Lysosomen Auflösung der Lysosomen
homogene Kondensation des Chromatins inhomogene Clusterbildung des Chromatins
cell shrinkage und Zerfall in apoptotische Körperchen
Zellschwellung und Lyse Phagozytose durch Nachbarzellen und
Makrophagen
Phagozytose durch Makrophagen fehlende entzündliche Reaktion entzünd liche Reaktion
Tabelle 3: Biochemische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose (THOMPSON et al., 1992)
Apoptose Nekrose
feinregulierter Prozess mit Synthese- und Aktivierungsschritten
Verlust der Regulation der Ionenhomöostase de novo Transkription von Genen fehlende de novo Transkription von Genen energieabhängiger Prozess energieunabhängiger Prozess
abhängig von der Synthese essentieller Makromoleküle
unabhängig von Protein- oder Nukleinsäuresynthese
geordnete Fragmentierung der DNA in Oligonukleosomen (180 – 200 bp)
ungeordnete Verdauung der DNA
2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei akutem Alveolarschaden
DAD-Patienten weisen erhebliche Schäden des Alveolarepithels auf, die eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen (WARE u. MATTHAY, 2000). Diese stellen eine Reaktion auf eine Vielzahl möglicher Noxen dar, die in diesem Zusammenhang nicht direkt zur Nekrose führen, sondern den Active Cell Death einleiten (HENGARTNER, 2000).
Aufgrund der Signalwege die hier eine Rolle spielen, kann grob zwischen einer rezeptorvermittelten, Fas-abhängigen und einer mitochondrienabhängigen Apoptose unterschieden werden (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Der erste Weg, der vor allem im Bereich entzündlicher Veränderungen anzutreffen ist, geht mit der verstärkten Sekretion des proapoptotischen Moleküls FasL einher, das über die Bindung an spezifische Rezeptoren die Caspasekaskade aktiviert (WALCZAK u. KRAMMER, 2000). Die zweite Möglichkeit führt über die Zerstörung der Mitochondrienmembran zur Freisetzung von Cytochrom C in das Cytosol und in der Folge ebenfalls zum Ablauf der Caspasekaskade (VAN DER HEIDEN, 1999; KROEMER u. REED, 2000). Die mitochondrienabhängige Apoptose ist im Gegensatz zur Fas-abhängigen eine Reaktion auf viele verschiedene Stimuli, zu denen neben oxidativem Stress, Chemotherapeutika und Strahlung (BUDINGER u. CHANDEL, 2001) möglicherweise auch mechanische Überbeanspruchung gehört (EDWARDS et al., 1999). In der BAL- Flüssigkeit von ARDS-Patienten finden sich deutlich erhöhte FasL-Konzentrationen, deren apoptosefördernde Wirkung auf Zellkulturen durch neutralisierende Antikörper gehemmt werden kann (MATUTE-BELLO et al., 1999). Auch zeigt sich in vitro nach periodischer mechanischer Überdehnung von AII- Zellmonolayern ein Anstieg von Apoptosemarkern (EDWARDS et al., 1999). Eine IL-6 induzierte verstärkte Bcl-2-Expression kann über die Stabilisierung der Mitochondrienmembran Lungenzellen vor Apoptose als Folge hyperoxischer Einwirkung schützen (WARD et al., 2000). Eine Bcl-2 Überexpression übt jedoch keinen Einfluss auf die FasL- oder TNF- mediierte Apoptose aus (WALCZAK u.
KRAMMER, 2000). Zusammengefasst kann man aufgrund einer mittlerweile großen Anzahl von Studien vermuten, dass bei ARDS sowohl der Fas- als auch der mitochondrienabhängige Active Cell Death große Bedeutung besitzen (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Historisch ging man davon aus, dass die Mechanismen des Zelltodes sich bei Zellen mit den morphologischen Erscheinungen von Apoptose bzw. Nekrose unterscheiden. Nach neueren Untersuchungen wird jedoch eine etwas andere Betrachtungsweise vorgeschlagen. Die verschiedenen morphologischen Veränderungen sind möglicherweise nur in einem unterschiedlichen ATP-Gehalt der betroffenen Zellen zum Zeitpunkt einer
Caspaseaktivierung begründet. Da die Caspasekaskade ATP-abhängig ist, kann bei einer vorliegenden ATP-Depletion oder einer Caspasehemmung ein weniger geordneter
„nekrotischer“ Zelltod ablaufen (EGUCHI et al., 1997; HIRSCH et al., 1997). Bei der eher geordneten „apoptotischen“ Form des Zelltodes könnte pharmakologisch die Überlebensrate von Zellen und somit die Prognose bei ARDS verbessert werden, während bei den minderregulierten Formen derartige Therapieversuche wohl erfolglos bleiben würden (BUDINGER u. CHANDEL, 2001).
2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker
Ki-67 ist ein kernständiges Nicht-Histon Protein, das sehr eng mit der Proliferation von somatischen Zellen verknüpft (ENDL u. GERDES, 2000) und in allen aktiven Phasen des Zellzyklus nachweisbar ist (GERDES et al., 1984). Die Expression beginnt bei vorher ruhenden Zellen in der späten G1-Phase, steigt in der S-Phase an und erreicht das Maximum in der G2- und M-Phase (SASAKI et al., 1987). Nach der Mitose fällt sie sofort ab. Sich kontinuierlich teilende Zellen zeigen während der gesamten G1-Phase eine positive Reaktion für Ki-67. Die G0-Phase ist regelmäßig Ki-67-negativ (GERDES et al., 1984). Während des größten Teils der Interphase in vitro proliferierender Zellen wird Ki-67 hauptsächlich in den Nukleoli und dort insbesondere in deren Peripherie vorgefunden (TAKAGI et al., 1999). In der Mitose findet sich Ki-67 bei Mensch und Maus als Netzwerk an der Oberfläche kondensierter Chromosomen (VERHEIJEN et al., 1989; TAKAGI et al., 1999). Sehr bald nach dem Austritt aus der Mitose, in der frühen G1-Phase, ist Ki-67 über viele kleine nukleäre Foci verteilt, die später in der G1-Phase in und um den neu gebildeten Nukleolus und die Heterochromatinbezirke des Kerns kondensieren (KREITZ et al., 2000). Nach Sequenzierung der cDNA des Ki-67 Proteins durch SCHLÜTER et al. (1993) ist eine breite Palette an monoklonalen Antikörpern (z. B. MIB 1-3, MIB 5, IND.64, JG-67-2a) gegen rekombinante Teile des Ki-67-Antigens erhältlich (KUBBUTAT et al., 1994). Das Gen besitzt eine Länge von etwa 30.000 bp und enthält 15 Exons. Die Transkription und anschließende Prozessierung führen zur Entstehung verschiedener Splicingvarianten des Proteins, zu denen auch die beiden prominenten Formen gehören, die auf Proteinebene nachgewiesen werden. Die Tatsache, dass Ki-67 ausschließlich während der Mitose exprimiert wird, macht die Markierung dieses Proteins durch spezifische Antikörper zu einem wichtigen und mittlerweile sehr verbreiteten Instrument zur Beurteilung der Zellproliferation (SCHOLZEN u. GERDES, 2000). Auch beim Pferd wurde die Markierung von Ki-67 bereits von verschiedenen Autoren in Zusammenhang mit zahlreichen Fragestellungen verwendet und die Kreuzreaktivität, insbesondere von MIB-1, mit equinem Material gesichert (MARTENS et al., 2000; ROELS et al., 2000; WATSON u. AL-ZI`ABI, 2002). Trotz der zahlreichen Untersuchungen über Ki-67 ist dessen genaue Funktion des Proteins jedoch bislang noch unbekannt.
2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge Allgemein
Zur Familie der Kollagene gehören bislang 20 bekannte eng verwandte Mitglieder, die grob in sieben verschiedene Gruppen eingeteilt werden (HULMES, 1992). Eine achte Gruppe besteht aus Proteinen, die teilweise typische tripelhelikale Domänen besitzen, jedoch nicht zu den Kollagenen gezählt werden. Die fibrillären Formen, zu denen auch Kollagen Typ I und III gehören, stellen die in der Lunge am häufigsten auftretende Gruppe dar (KIRK et al., 1984).
Prinzipiell besitzen alle Kollagene die gleiche Grundstruktur (KÜHN, 1986). Sie setzen sich aus jeweils drei Polypeptid-α-Ketten zusammen, die entweder identische oder verschiedene AS-Sequenzen besitzen können (VAN DER REST u. GARRONE, 1991; BIENKOWSKI u.
GOTKIN, 1995). Diese bilden höhermolekulare Vorstufen, die so genannten Prokollagene, die zusätzlich globuläre N- und C-terminale Extensionspeptide besitzen und aus denen letztlich reife Kollagenproteine entstehen. In Verbindung mit den 20 Isotypen wurden bislang 33 verschiedene α-Ketten entdeckt. Die Extensionspeptide sollen unter anderem eine intrazelluläre Fibrillogenese verhindern, da die tripelhelikalen Kollagenmonomere eine starke Tendenz zum self-assembly besitzen (CROUCH, 1990). Im Rahmen der Fibrillogenese lagern sich drei proα-Ketten an ihren C-terminalen Bereichen aneinander, um in N-terminaler Richtung fortschreitend eine rechtsgewundene Tripelhelix mit einem Durchmesser von etwa 1,5 nm zu bilden (KÜHN, 1986). Zur Stabilisierung der helikalen Struktur erfolgt die posttranslationale Hydroxilierung etwa der Hälfte aller Prolinreste. Nach Sekretion des Proteins werden die Extensionspeptide der proα-Ketten durch teilweise membranständige Proteasen abge spalten und durch das endständige und laterale Aneinanderlagern von Kollagenmonomeren entstehen Fibrillen. Man ging lange Zeit davo n aus, dass einmal gebildetes Kollagen inert sei und keinem weiteren Stoffwechsel unterliege. Tatsächlich hat sich jedoch gezeigt, dass sich Kollagene ebenso wie andere Proteine durch ständige Auf- und Abbauvorgänge in einem dynamischen Gleichgewicht befinden. Man vermutet, dass bei jungen erwachsenen Ratten pro Tag etwa 10 % des gesamten Kollagengehaltes der Lunge umgesetzt werden (MCANULTY u. LAURENT, 1987). Diese Umbauraten sind bei wachsenden Tieren größer und nehmen mit fortschreitendem Alter ab. Der permanente Turnover von Kollagen bleibt jedoch zeitlebens auf einem gewissen Level erhalten (MAYS et al., 1989; MAYS et al., 1991).
2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III
Das in der menschlichen Lunge befindliche Kollagen besteht zu 90 % aus den interstitiellen Fasertypen I und III, die beim Erwachsenen in der unveränderten Lunge in einem Verhältnis von etwa 2:1 vorliegen (KIRK et al., 1984b) und sich außer im Interstitium noch in großen Bronchien und Blutgefäßen finden. Fibroblasten, die etwa 40 % aller Lungenzellen ausmachen, stellen die Hauptproduzenten der Kollagentypen I und III dar (HANCE et al., 1976), wobei jedoch auch Endothelzellen (MACARAK, 1984), Epithelzellen (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995), Mesothelzellen (RENNARD et al., 1984) und glatte Muskelzellen zu deren Synthese in der Lage sind (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995). Kollagen Typ I ist aus drei so genannten α(I)-Ketten aufgebaut, die sich vor allem durch ihren hohen Prolingehalt von bis zu 20 % auszeichnen, der die helikale Struktur der Ketten bedingt, und durch ihre Primärstruktur mit Glycin in jeder dritten Position. Bei einem Kollagen Typ I-Molekül handelt es sich in der Regel um ein Heterotrimer aus zwei α1(I)- und einer α2(I)-Kette. Bei Mangel an α2(I)-Ketten können auch α1(I)-Homotrimere gebildet werden (BIENKOWSKI u.
GOTKIN, 1995). Die Gene für die proα1(I)- und proα2(I)-Ketten - COL1A1 und COL1A2 - befinden sich beim Menschen auf den Chromosomen 17 bzw. 7 (SANDEL u. BOYD, 1990).
Obwohl die mRNA-Konzentrationen normalerweise ein recht stabiles Verhältnis von 2:1 aufweisen, kann die Transkription der Gene unabhängig voneinander erfolgen (FINE et al., 1989; FINE et al., 1990). Kollagen Typ III ist in Struktur und Zusammensetzung dem Kollagen Typ I sehr ähnlich, wobei es jedoch im Unterschied dazu ein Ho motrimer aus α1(III)-Ketten darstellt. Beide Formen finden sich vorrangig im Interstitium (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995), wobei diese interstitiellen Kollagenfibrillen Kopolymere dieser beiden Kollagentypen darstellen (FLEISCHMAJER et al., 1990; XU et al., 1993). Kollagen Typ I und III können aber auch in Verbindung mit dem von glatten Muskelzellen und Fibroblasten sezernierten Kollagen Typ IV im Interstitium feine Fasern bilden (AMENTA et al., 1988).
2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels
Es existieren zahlreiche Mechanismen zur Regulation des Kollagenstoffwechsels. Diese schließen die Migration von Fibroblasten zu einem aktiven Fokus ein, Fibroblastenproliferation und klonale Selektion von Fibroblastensubtypen sowie Modulation der zellulären Kollagensynthese und -degradierung (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).
Zahlreiche endokrine, parakrine und autokrine Mediatoren sind in der Lage, die Funktion von Fibroblasten zu beeinflussen (CROUCH, 1990). So sind Fibrinogen und Endothelin 1 aus endo- und epithelialen Zellen Stimuli für Fibroblastenmigration und -proliferation (BITTERMAN et al., 1983; AKIYAMA et al., 1989). Die vermutlich größte Rolle spielen jedoch Cytokine – Interleukine, Interferon und Polypeptid-Wachstumsfaktoren – als hochpotente Modulatoren des Zellstoffwechsels. Sie werden von Bindegewebs- und Entzündungszellen gebildet und sind zudem in der Lage ihre eigene Synthese zu stimulieren (ZHANG et al., 1993). Da sie mit Oberflächenrezeptoren unterschiedlicher Spezifität reagieren (PARTANEN et al., 1993) und verschiedene Signaltransduktionswege in unterschiedlichen Zellen aktivieren (z. B. cAMP (ZHANG et al., 1993), Tyrosinkinasen (DARNELL et al., 1994)), können sie gegensätzliche Effekte hervorrufen (YAN et al., 1994).
Daher sind viele dieser Substanzen in der Lage, mehrere Funktionen gleichzeitig zu übernehmen. So regen Mediatoren wie IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) und IL-1 (Interleukin-1) Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation an, wobei monozytäres IL-1 gleichzeitig auch einen extrazellulären Kollagenabbau durch verstärkte Kollagenase- ausschüttung induziert (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).
Die Regulation der Kollagensynthese erfolgt gleichzeitig an mehreren Stellen des Stoffwechselweges auf transkriptionaler, translationaler und posttranslationaler Ebene. Die Transkription der codierenden Gene wird durch zahlreiche Agentien beeinflusst, zu denen neben Prostaglandine n vom E-Typ insbesondere Cytokine - vor allem IL-1α, -1β und TGF-ß (Transforming Growth Factor-β) - gehören. Posttranskriptional wird die Kollagensynthese über die Stabilität der gebildeten mRNA und die Effektivität der Translation beeinflusst (MAKELA u. VUORIO, 1986). Nach GEESIN et al. (1988) spielt hier unter anderem Ascorbinsäure eine Rolle. Darüber hinaus existieren Feedbackmechanismen, wobei vor allem die N- und C-terminalen Telopeptide der Prokollagene in der Lage sind, die Kollagenneusynthese zu beeinflussen (WIESTNER et al., 1979). Das N-terminale Propeptid führt in diesem Zusammenhang zu einer unspezifischen Hemmung der Translation
(GOLDENBERG u. FINE, 1985), Fragmente des C-terminalen Propeptides können sowohl inhibitorisch als auch stimulierend wirken (KATAYAMA et al., 1991).
Die posttranslationale Regulation erfolgt vor allem durch den Abbau von Kollagen auf zwei verschiedenen Ebenen:
1. Ein erheblicher Anteil des im Bindegewebe gebildeten Kollagens wird bereits vor seiner Sekretion degradiert (BIENKOWSKI, 1985). Der basale Level dieses intrazellulären Kollagenabbaus in Lungenfibroblasten liegt bei etwa 15 % (BARILE et al., 1990) des neugebildeten Prokollagens (KEHRER, 1985; PICKRELL et al., 1987), steigt jedoch bei vermehrter Bildung strukturell abnormalen Kollagens oder unter Einfluss von PGE1 an (BIENKOWSKI et al., 1978; BARILE et al., 1988). Über die Lokalisation des Abbaus existieren unterschiedliche Ansichten. BERG et al. (1980) beschreiben eine lysosomale Proteolyse, während RIPLEY et al. (1993) von einer Degradierung in einem distalen Kompartiment des Sekretionsweges ausgehen. Ob derartige Vorgänge, wie bei anderen Proteinen bekannt, bereits auf der Ebene des endoplasmatischen Retikulums ablaufen, ist unklar (FRA u. SITIA, 1993).
2. Das bereits sezernierte Kollagen unterliegt einer extrazellulären Proteolyse, die durch spezifische Enzyme und deren Inhibitoren reguliert wird (MATRISIAN, 1990; MURPHY u. DOCHERTY, 1992). Sowohl die Enzyme als auch ihre Inhibitoren unterliegen wiederum der Regulation durch zahlreiche Mediatoren.
Eine Steigerung der Kollagenbildung ist auch indirekt durch verstärkte Fibroblasten- proliferation oder Chemotaxis möglich. Zahlreiche Mediatoren verschiedener Zelltypen, wie Makrophagen, Monozyten, Lymphozyten, Fibroblasten, epi- und endotheliale Zellen, spielen hierbei eine Rolle. Daneben existieren noch frei zirkulierende Faktoren. Weiterhin setzt sich die Fibroblastenfraktion in den einzelnen Organen aus mehreren Subpopulationen mit unterschiedlichen Eigenschaften zusammen (HURUM et al., 1982; KONDO et al., 1985) und es existieren Hinweise darauf, dass in von Patienten mit Lungenfibrose gewonnenen Fibroblastenlinien Zellklone mit einer überdurchschnittlich hohen Teilungsrate vorliegen (JORDANA et al., 1988).
-OH AAA
Mannose- und Scavengerrezeptoren
Kollagenfibrillen
Kernmembran
Hydroxilierung
Bildung der Tripelhelix Transcrip tion Factor Antagonists
Sekretion
Zellmembran
Abspaltung der Propeptide
C-Propeptidase N-Propeptidase
Lysyloxidaseinhibitoren
-O-Gal-Glc
Gal-O- Gal-O-
-OH
-OH HO-
-OH
Translation
-OH
Matrixmetalloproteinasen
Tissue Inhibitors of Metalloproteinase MMP-Aktiva toren
Zellkern
Transkription
Quervernetzung
Intrazelluläre Degradierung N- und C-
terminale Propeptide
Abb. 1: Schematische Darstellung der Kollagenbiosynthese (CROUCH, 1990; BIENKOWSKI u.
GOTKIN, 1995; SCHUPPAN et al., 1999)
2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III bei diffusem Alveolarschaden und interstitieller Pneumonie
Nach allgemeiner Auffassung besteht die erste akute Phase von DAD und interstitieller Pneumonie in einer massiven Steigerung der alveolären Permeabilität, die zu einer Akkumulation proteinreicher Ödemflüssigkeit in Interstitium und Alveolarlumina führt.
Diesem Frühstadium folgt im Rahmen einer konsekutiven interstitiellen Pneumonie (JUBB, 1991) eine fibroproliferative Phase, die entweder die Regeneration der Alveoli einleitet oder aber auch zu einer progressiven Obliteration der interstitiellen und alveolären Lungenkompartimente führen kann (BITTERMAN, 1992). Die dabei ablaufenden Vorgänge umfassen Proliferation von Endothelzellen, Proliferation und Migration von Fibroblasten, Angiogenese sowie die Neubildung von extrazellulären Matrixproteinen (MEDURI et al., 1998). Unter anderem beschreiben ZAPOL et al. (1979) eine Verdreifachung neu gebildeten Kollagens als Folge von ARDS gegenüber unveränderten Lungen. Das ansonsten sehr stabile Verhältnis von Kollagen Typ I zu Typ III in der Lunge von 2:1 kann auf bis zu 4:1 ansteigen (LAST et al., 1983). Ähnlich wie bei der kutanen Wundheilung sind auch bei der Lunge Myofibroblasten mit in die Regeneration / Reparation einbezogen (MARINELLI et al., 1990).
Die fibroproliferative Reaktion stellt einen limitierenden Faktor bei der Wiederherstellung der normalen Lungenfunktion dar und beeinflusst wesentlich die Prognose sowohl quoad valitudinem als auch quoad vitam. Verschiedene Autoren verwenden in diesem Zusammenhang biologische Marker für die Kollagensynthese als mögliche diagnostische und prognostische Parameter (KIRK et al., 1984a; HORSLEV-PETERSEN, 1990). Mehrere Arbeitsgruppen (WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; MEDURI et al., 1998) nutzten hierfür den Gehalt des N-terminalen Prokollagen-Typ III-Peptids (N- PCP-III) in bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) oder Trachealaspiraten und konnten bemerkenswerterweise bereits in den ersten 24 h nach der klinischen Diagnose eine verstärkte Kollagensynthese feststellen sowie einen Zusammenhang zwischen der Peptidmenge und der Mortalität der untersuchten ARDS-Patienten: Der Anstieg der N-PCP-III-Konzentration über 1,75 U / ml im Trachealaspirat ging mit einer Verdoppelung des Todesrisikos einher. Bei kardiogen oder hydrostatisch bedingten Lungenödemen hingegen lagen keine erhöhten Werte vor. Histologisch oder immunhistochemisch fanden sich nachweisbare Kollagenablagerungen erst nach mehreren Tagen. Andere Studien zeigen zudem, dass innerhalb von 24 h in BALF und Plasma von ARDS-Patienten ebenfalls deutlich erhöhte Konzentrationen von Cytokinen und Wachstumsfaktoren vorliegen, die Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation
