3 Material und Methoden
4.1 Licht - und elektronenmikroskopische Untersuchungen
4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon
Pferd 1 und Pferd 2 aus dem Vorversuch zeigten nach einer einmaligen, intravenösen Appli-kation von 5 mg Perillaketon / kg KG nur gering ausgeprägte histomorphologische Verände-rungen. Daher wurde die verabreichte Menge im Hauptversuch auf 6 mg / kg KG erhöht, wo-durch eine stärkere Reaktion ausgelöst werden konnte. Somit lagen bei der Auswertung der Proben eine niedrige und eine höhere Dosisgruppe vor. Bei den Versuchstieren 3, 4, 5, 6, 7 und 8 des Hauptversuchs waren durchweg gleichartige und sehr ausgeprägte Veränderungen mit nahezu identischer Chronologie zu beobachten, die sich in drei verschiedene Phasen ein-teilen ließen. Grundsätzlich konnten am selben Entnahmetag an den verschiedenen Biopsielo-kalisationen der einzelnen Pferde gleiche Befunde erhoben werden. Die Zahl der untersuchten Biopsien pro Tag und Pferd war damit ausreichend und eine gemeinsame Untersuchung der Proben eines Entnahmetages mit den molekularbiologischen Methoden gerechtfertigt.
Phase 1 (Tag 1 - 4 post applicationem):
Die Tiere der niedrigeren Dosisgruppe wiesen während dieses Zeitraums im Vergleich zu den Kontrollproben keine Veränderungen auf.
Am ersten Tag unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon ließen sich bei den Pferden der höheren Dosisgr uppe nur geringfügige lichtmikroskopisch erkennbare Veränderungen gegenüber den Kontrollproben nachweisen. Neben einer leichten Zunahme an Makrophagen und bei den Pferden 3 und 5 auch an neutrophilen Granulozyten sowie proliferierenden AII-Zellen fand sich in wenigen Lokalisationen geringgradig fibrinreiches Exsudat (Abb. 19 +
20). Elektronenmikroskopisch zeigten AI-Zellen bei allen Tieren - besonders ausgeprägt je-doch bei Pferd 3 und Pferd 5 - über weite Strecken eine zum Teil erhebliche Vakuolisierung des Zytoplasmas (Abb. 18). Vereinzelte Kerne befanden sich im Frühstadium der Pyknose mit Wandhyperchromasie, tiefen Invaginationen der Kernmembran und zeigten mitunter einem prominenten Nukleolus. Zahlreiche Endothelzellen wiesen eine deutliche Schwellung auf (Abb. 17). Gleichzeitig fanden sich aber auch in geschwollenen Endothelzellen und auch von solchen mit unveränderter Dicke zahlreiche sehr gut umschriebene Abschnitte, die von außer-ordentlich abgeflachten Endothel-zellausläufern bedeckt waren. Erst bei starker Vergrößerung (50.000x) konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die endotheliale Basalmembran in diesen Bereichen nicht entblößt war (Abb. 20 + 21). Zu allen Zeitpunkten des Versuchs waren in den untersuchten Bereichen die Verbindungen zwischen benachbarten Endothelzellen in-takt. Die lichtmikroskopisch festgestellten vermehrten Makrophagen und neutrophilen Gra-nulozyten waren vor allem intrakapillär und interstitiell lokalisiert. Weiterhin konnten im In-terstitium multifokal durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte Kollagenfaserbündel be-obachtet werden (Abb. 24) und es fanden sich vereinzelt Mastzellen (Abb. 23). Lichtmikro-skopisch ließ sich vom 3. – 4. Tag bei den Tieren der höheren Dosisgruppe im Vergleich zu den Kontrollproben ein abschnittsweise variierendes, geringgradig stärker ausgeprägtes al-veoläres Ödem feststellen. Es fanden sich auch geringgradig vermehrt alveoläre-, interstitielle und intrakapilläre Makrophagen und in mehreren Lokalisationen in den Alveolarlumina ge-ringgradig fibrinreiches Exsudat. Als Reaktion auf den Verlust von AI- Zellen war multifokal eine gering- bis mittelgradige Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II zu beob-achten. Die alveolären Septen wiesen abschnittsweise eine geringfügige Ödematisierung auf und die Kapillaren waren mäßig gestaut, wodurch es in einigen Bereichen zu einer geringen Verbreiterung der Alveolarwände kam. Im Interstitium waren geringgradig vermehrt Mastzellen zu beobachten. Elektronenmikroskopisch lagen weiterhin über große Strecken AI-Zellen mit ausgeprägter Vakuolisierung des Zytoplasmas vor und darüber hinaus zahlreiche Lokalisationen mit entblößter Basalmembran nach Desquamation von AI-Zellen (Abb. 22).
Als Folge dieser Defekte zeigte sich multifokal eine Proliferation von AII-Zellen. Diese wie-sen teilweise ein sehr prominentes und mitunter dilatiertes, glattes endoplasmatisches Reti-kulum auf, und es fanden sich im Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen verschiedene Übergangsformen mit einer Abnahme bis hin zum völligen Verschwinden von Lamellarkör-perchen und einer unterschiedlich starken Abflachung des Zytoplasmas. Der Mikrovillibesatz der Zellmembran war auch bei sehr weit differenzierten Zellen noch vorhanden. Mitunter fan-den sich von ihrer Form her noch kubische AII-Zellen, die jedoch mit langen, sehr schmalen
und mit Mikrovilli besetzten Ausläufern die angrenzende Basalmembran bedeckten. In eini-gen Bereichen zeigten ihre Zellkerne einen sehr prominenten Nukleolus, der zusammen mit dem ausgeprägten glatten ER auf eine verstärkte Stoffwechselleistung hinwies. An mehreren Lokalisationen konnten teilweise an der Basalmembran gelegene und teilweise frei im Al-veolarlumen befindliche große, kubische und organellenarme Zellen beobachtet werden, mit geringen Mengen an überwiegend rauem ER, einzelnen Mitochondrien und einem gering aus-geprägten Golgiapparat. Sie enthielten auch wenige, sehr kleine Lamellarkörperchen, wiesen zum Teil einen geringen, lückenhaften Mikrovillibesatz auf und konnten somit als AII-Zellen interpretiert werden (Abb. 25), sofern sie keinen Kontakt mehr zur Basalmembran besaßen, im Zustand nach Desquamation. In den Alveolarlumina lagen auch Makrophagen und Zellde-tritus vor. Vereinzelt fanden sich in intrakapillär gelegenen Makrophagen phagozytierte La-mellarkörperchen, was die Vermutung nahe legte, dass es sich dabei um ursprüngliche Al-veolarmakrophagen handelte, die nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren ausgewandert waren. Im Interstitium konnten neben Makrophagen und neutrophilen Granulo-zyten auch Mastzellen festgestellt werden sowie durch Ödemflüssigkeit auseinander ge-drängte Kollagenfaserbündel. Das Endothel wies ebenso wie am ersten Tag sowohl Schwel-lungen als auch Bereiche auf, die nur durch sehr schmale Zytopla smaausläufer bedeckt wur-den. Darüber hinaus ließen sich einzelne Endothelzellen mit hoher Elektronendichte als Aus-druck degenerativer Veränderungen beobachten. Nach den licht- und elektronenmikroskopi-schen Befunden entsprach dieses erste Versuchstadium mit Nachweis eines akuten Alveolar-schadens der exsudativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Zwar waren keine hyalinen Membranen wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitiellen Pneumonien feststell-bar, jedoch fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Es konnte kein exakter Zeitpunkt des Wechsels der exsudativen zur proliferativen Phase festgelegt werden, da sich hier sowohl Exsudat als auch Schäden der Alveolarwand gleichzeitig zusammen mit einer Proliferation von AII-Zellen beobachten ließen, die den Beginn der zweiten Phase der interstitiellen Pne umonie darstellt. Es kann also ein fließender Übergang zwischen exsudati-ver und proliferatiexsudati-ver Phase angenommen werden.
Phase 2 (Tag 4 - 11 post applicationem):
Bei den Versuchstieren der niedrigeren Dosisgruppe (5 mg / kg KG) konnten in diesem Zeit-raum lichtmikroskopisch und durch immunhistochemische Markierung von Ki-67 bzw. MAC
387 lediglich eine geringgradig verstärkte AII-Zellproliferation und bei Pferd 2 eine gering-gradige Zunahme an Makrophagen festgestellt werden.
In dieser Phase ließen sich an den Tieren der höheren Dosisgruppe die stärksten Veränderun-gen beobachten, die am 8. bis 11. Tag post applicationem ihr Maximum erreichten und bei den Pferden 3 und 5 im Vergleich zu den Pferden 4, 6, 7, und 8 noch ausgeprägter waren.
Aufgrund der hochgradigen klinischen Erscheinungen mussten Pferd 5 am 9. und Pferd 3 am 11. Versuchstag euthanasiert werden. Es zeigte sich ein im Vergleich zu den Kontrollproben mittelgradiges alveoläres Ödem und eine mittelgradige Zunahme von Makrophagen (Abb.
13), die - wie in der immunhistochemischen Darstellung mit MAC 387 erkennbar - sowohl in den alveolären Septen lokalisiert waren und ebenso als Alveolarmakrophagen auftraten. Die Anzahl an großen, rundkernigen und organellenarmen Zellen mit wenigen, kleinen Lamellar-körperchen, die elektronenmikroskopisch als AII-Zellen zum Teil nach Desquamation inter-pretiert wurden, stieg drastisch an. In einzelnen Lokalisationen füllten sie zusammen mit Alveolarmakrophagen die alveolären Lumina vollständig aus, wobei dieser Eindruck jedoch durch die entnahmebedingte Kompression des Gewebes verstärkt wurde. Als Reaktion auf den Epitheldefekt zeigte sich eine disseminierte, abschnittsweise variierende mittel- bis hoch-gradige Proliferation von AII-Zellen, die zusammen mit der Einlagerung von Ödemflüssigkeit zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke führte (Abb. 3). In diesem Stadi-um lag vor allem bei den euthanasierten Pferden 3 und 5 unmittelbar ante mortem ubiquitär eine nahezu vollständige Auskleidung der Alveolen mit AII- Zellen vor, die dem Lungenge-webe ein adenoides Erscheinungsbild verliehen. Am Höhepunkt der Veränderungen fanden sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe, am stärksten ausgeprägt bei Pferd 3 und Pferd 5, multifokal- herdförmige intraalveoläre Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten (Abb. 4) und eine deutliche Leukozytostase. Ausschließlich in dieser Phase konnte neben gra-nulohistiozytären Infiltraten lichtmikroskopisch auch eine geringgradige Zunahme von Lym-phozyten beobachtet werden. Bei der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 ließen sich nicht nur an der luminalen Seite der Septen proliferierende Zellen feststellen, die mitun-ter die gesamte Alveole auskleideten, sondern auch plumpkernige, im Inmitun-terstitium gelegene Zellen. Vereinzelt lagen auch im Alveolarlumen Ki-67-positive Zellen vor (Abb. 9). Elektro-nenmikroskopisch fanden sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe in diesem Versuchs-stadium die größte Anzahl an AII-Zellen und Übergangsformen. Bei den angetroffenen AI-Zellen war die Vakuolisierung im Vergleich zu Phase 1 erkennbar geringer ausgeprägt. Es zeigten sich eine Ödematisierung und eine Infiltration des Interstitiums mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, die auch in den Alveolarlumina anzutreffen waren. Ebenso ließen
sich interstitielle Mastzellen beobachten. Die Schwellung des Endothels war, wenn auch ge-ringer ausgeprägt, noch vorhanden und es konnten einzelne, sehr elektronendichte Endothe lzellen festgestellt werden. Hochgradig abgeflachte Endothelzellausläufer fanden sich in den untersuchten Bereichen jedoch nicht mehr. Mitunter waren im Interstitium Fibroblasten mit hochgradig dilatiertem endoplasmatischem Retikulum anzutreffen. Nach den licht- und elektronenmikroskopischen Befunden entsprach dieses zweite Versuchsstadium mit dem Nachweis einer ausgeprägten Proliferation nicht nur epithelialer sondern auch interstitieller Zellen und einer deutlichen Infiltration mit Entzündungszellen der proliferativen Phase der interstitiellen Pneumonie.
Phase 3 (Tag 11 – 18 post applicationem)
In der letzten Phase zeigte sich eine Regression der Veränderungen. Bei der lichtmikroskopi-schen Betrachtung erfolgte ein Rückgang der entzündlichen zellulären Infiltrate, des alveolä-ren und interstitiellen Ödems sowie auch der Proliferation von AII- Zellen. Damit in Überein-stimmung standen die Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung granulohis tiozytä-rer Zellen und proliferierender Zellen. Während jedoch eine Abnahme MAC 387-positiver Zellen auf das Ausgangsniveau zu erkennen war, blieb die Anzahl Ki-67 positiver Zellen noch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums erhöht. In der Spezialfärbung für kollagene und retikuläre Fasern nach Heidenhain konnte im Vergleich mit der Ausgangssituation kein vermehrtes Bindegewebe beobachtet werden. Bei den Pferden 1, 2 und 4 waren ab dem 15.
Tag und bei den Pferden 6, 7 und 8 ab dem 18. Tag post applicationem gegenüber den Kon-trollen keine abweichenden Befunde mehr zu erheben. Dieses letzte Versuchsstadium ent-sprach aufgrund der morphologischen Befunde mit Ausnahme der euthanasierten Tiere 3 und 5 der Phase der Ausheilung der interstitiellen Pneumonie. Bei den Pferden 1, 2, 4, 6, 7 und 8 wurden weiterhin bis insgesamt acht Wochen nach Versuchsbeginn Biopsieproben entno m-men und pathohistologisch untersucht. Es konnten keine Hinweise auf fibrotische Verände-rungen angetroffen werden. Nach Ende dieser acht Wochen wurden die Tiere mit Ausnahme der Pferde 3 und 5 euthanasiert und die Lungen explantiert. Während je eine Lunge eines Versuchstieres an der Klinik für Pferde für computertomographische Untersuchungen ve r-wendet wurde, erfolgte eine umfassende pathohistologische Untersuchung an der verbliebe-nen Lunge. Hier konnten in acht definierten Lokalisatioverbliebe-nen (Kraniallappen, craniale, caudale, mediale, laterale, dorsale, ventrale und zentrale Abschnitte des Hauptlappens) an mit HE-gefärbten Paraffinschnitten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen gefunden werden.
Abb. 2 (Pferd 3, Kontrolle): Normal strukturierte Lunge: Alveolarlumen (AL), alveoläre Septen ( ), entnahmebedingte, extravasale Erythrozyten ( * ) und Kompression von Alveolen ( + )(HE, 350x)
AL
AL
*
*
Abb. 3 (Pferd 3, Tag 8, proliferative Phase): Massive Verbreiterung der alveolären Septen durch hochgradige, disseminierte Proliferation von Alveo-larepithelzellen vom Typ II ( ) und ein interstitielles Ödem ( + );
gemischtzellige, alveoläre und interstitielle Infiltrate ( * ) (HE, 350x)
*
* +
+
* +
* *
+
+
Abb. 4 (Pferd 5, Tag 8, proliferative Phase): Herdförmige, intraalveoläre Infiltration mit polymorphkernigen, neutrophilen Granulozyten und Alveo-larmakrophagen ( ), alveoläres Ödem ( * ) (Semidünnschnitt, Toludin-blau, 350x)
*
Abb. 5 (Pferd 8, Kontrolle): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau dargestellte kollagene und retikuläre Fasern vor Versuchsbeginn als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)
*
Abb. 6 (Pferd 8, Tag 29): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau darge-stellte kollagene und retikuläre Fasern 11 Tage nach Ende der Ausheilungs-phase als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)
Abb. 7 (Pferd 8, Kontrolle): Expression von Ki-67: Proliferierende Zellen im unveränderten Lungengewebe vor der Applikation von Perillaketon (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)
Abb. 8 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67:
Hochgradige Zunahme proliferierender Zellen in der proliferativen Phase ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)
Abb. 9 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67: Ki-67-positive Zellen säumen nicht nur die Alveolen, sondern finden sich auch im Interstitium ( * ) und frei im Alveolarlumen ( ); massive Verbreiterung der alveolären Septen ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 570x)
*
Abb. 10 (Pferd 5, Kontrolle): Vereinzelte Zelluntergänge im Rahmen der physiologischen Zellmauser der Lunge ( ) (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)
Abb. 11 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): Vermehrte Zelluntergänge bei Pferd 5 unmittelbar ante mortem ( ); die Kompression der Alveolarlumi-na ist entAlveolarlumi-nahmebedingt (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)
Abb. 12 (Pferd 7, Kontrolle): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens:
Überwiegend im Bereich der Septen lokalisierte DAB-positive Zellen mit der Morphologie von Makrophagen ( ) (MAC 387, Gegenfärbung mit
Hämalaun, 175x)
Abb. 13 (Pferd 7, Tag 8, proliferative Phase): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens: Zunahme von intraalveolären ( ) und interstitiellen ( ), granulohistiozytären Infiltraten (MAC 387, Gegenfärbung mit
Hämalaun, A: 175x, B: 350x)
A B
Abb. 14 (Pferd 1, Kontrolle): Übersicht über die normale Ultrastruktur der Lunge: Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzellen vom Typ I ( ), Kapillar-endothel ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyten (E) (TEM, 1.600x)
AL
KL
E
E
Abb. 15 (Pferd 1, Kontrolle): Normalstruktur der Blut-Luft-Schranke: intra-alveoläre Ödemflüssigkeit ( * )Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI), Basalmembran (BM), Endothelzelle (EZ), Endothelzell-verbindung ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)
AL
AI BM
EZ
E
KL
KL
AL
*
Abb. 16 (Pferd 1, Kontrolle): Normales Stützgerüst der Lunge im Bereich der alveolären Septen: Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI); kollagene Fasern (KF), Endothelzelle (EZ), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)
Abb. 17 (Pferd 2, Tag 1, exsudative Phase): Ausgeprägte Schwellung des Kapillarendothels: Alveolarepithelzelle vom Typ I ( ), Endothelzelle (EZ), geschlossene Endothelzellverbindungen ( ), Kapillarlumen (KL) (TEM, 5.000x)
EZ
E EZ
KF
AI
KL
Abb. 18 (Pferd 7, Tag 1, exsudative Phase): degenerierende
Alveolar-epithelzelle vom Typ I (AI) mit hochgradig vakuolisiertem Zytoplasma ( );
Alveolarlumen (AL); kollagene Fasern (KF); Mastzelle (MZ) (TEM, 6.300x)
AI
AL KF
Abb. 19 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): frei im Alveolarlumen gelegenes Fibrin ( ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI); Endothelzelle (EZ) (TEM, 6.300x)
AI EZ
MZ
Abb. 20 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Abschnitte im Endothelzell-verband, die nur durch außerordentlich dünne Zytoplasmaausläufer über-brückt werden ( ); ödematisierte Endothelzelle (EZ); intraalveoläre Ödem-flüssigkeit mit Fibrin ( * ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI) (TEM, 8.000x)
* AI
EZ
Abb. 21 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Ausschnittsvergrößerung von Abb. 20: stark abgeflachter Endothelzellausläufer ( ); Kapillarlumen (KL);
Basalmembran (BM); Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI) (TEM, 50.000)
KL
BM
AI
*
Abb. 22 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): entblößte Basalmembran nach Desquamation von Alveolarepithelzellen Typ I ( ); Alveolarlumen (AL);
Erythrozyt (E), Endothelzelle (EZ); Kapillarlumen (KL) (TEM, A: 6.300x, B: 25.000x)
A
AL AL
EZ
EZ
KL
KL
B
E
Abb. 23 (Pferd 7, Tag 4, exsudative Phase): Entzündliche, zelluläre, interstitielle Infiltrate: Mastzelle (MZ), polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt (PMN); durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF) (TEM, 6.300x)
MZ
PMN
KF
Abb. 24 (Pferd 4, Tag 4, exsudative Phase): proliferierende Alveolarepithel-zellen vom Typ II ( ) mit intrazytoplasmatischen Lamellarkörperchen (LK); durch interstitielle Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF); Alveolarlumen (AL); Fibroblast mit dilatiertem,
endoplasmatischem Retikulum ( * ) (TEM, 6.300x)
LK KF AL
LK
Abb. 25 (Pferd 3, Tag 8): Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII): im Rahmen der Differenzierung zu Alveolarepithelzellen vom Typ I lassen sich nur noch sehr kleine zytoplasmatische Lamellarkörperchen nachweisen ( ); Nukleolus (N) (TEM, 2.500x)