Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

ersten beiden Wirkungen für die cDNA-Erststrangsynthese von Bedeutung sind. Während die RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität zur Transkription der RNA-Vorlage in komplementäre DNA dient, degradiert das Enzym durch seine Funktion als Exoribonuklease RNA in RNA-DNA Hybriden, während freie RNA nicht beeinflußt wird, und verbessert dadurch die Sensitivität der nachfolgenden quantitativen PCR. Reagenzien und Gesamt-RNA wurden auf Eis aufgetaut, kurz auf einem Vortexer gemischt und zentrifugiert. Bei einem Reaktionsvolumen von 20 µl für jede RNA-Sammelprobe wurden pro Ansatz folgende Komponenten zu einem Mastermix zusammenpipetiert und gut gemischt:

Tabelle 5: Komponenten des Reaktionsansatzes für die reverse Transkription

Buffer RT (10x) * 2 µl

dNTP Mix (5 mM pro dNTP) * 2 µl

Random Hexamer-Primer (250 µg / ml) (Fa. Promega, Madison, USA, Best.Nr. C1181)

1 µl RNase-Out (10 U / µl) (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Best.-Nr. 10777-019) 1 µl

Omniscript Reverse Transcriptase (4 U) * 1 µl

RNase-freies Wasser 6 µl

* vom Hersteller mitgeliefert

Pro Ansatz wurden 13 µl des Mastermix in ein 500 µl-Reaktionsgefäß gegeben und 7 µl in DEPC-behandeltem Wasser gelöste Gesamt-RNA hinzugefügt. Die Reaktion erfolgte in einem programmierbarem Thermocycler T3 (Fa. Biometra, Göttingen) bei 25°C für 10 min, 37°C für 60 min und zur Inaktivierung des Enzyms bei 93°C für 5 min. Das Produkt wurde direkt in der qPCR eingesetzt oder bei -20°C gelagert.

3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

Untersucht wurde die Genexpression der Cytokine TGFß und Interleukin-1ß sowie der extrazellulären Matrixproteine Prokollagen a1(I) und a1(III). Als „Housekeeping-Gen“ diente der Elongationsfaktor-1a (EF-1a), der sich durch eine extrem konstante Expressionsrate auszeichnet (GRUBER u. LEVINE, 1997). Zu diesem Zweck wurde die bislang beim Pferd noch nicht bekannte Sequenz von EF-1a ermittelt und GenBank (Genbank-Nr.: AY237113)

zur Verfügung gestellt. Die Quantifizierung der cDNA erfolgte in einem Fluoreszenzdetektor mit integriertem Thermocycler und 96-Loch-Mikrotiterplatte Mx4000 Multiplex QPCR System der Firma Stratagene (LaJolla, USA). In einer PCR-Reaktion wurden neben den Sammelproben der Lungenbiopsien eines jeden Entnahmetages stets Negativkontrollen und die Verdünnungsreihe eines entsprechenden DNA-Mengens tandards gemessen. Der Mengenstandard wurde aus equiner mRNA mittel RT-PCR gewonnen, wobei die Primer für deren Amplifikation in der PCR ein Fragment begrenzten, das das Fragment der Sonden-Primer-Paare der quantitativen PCR sowohl in 5´-, als auch in 3´-Richtung deutlich überragte.

Bei den Negativkontrollen handelte es sich um no template controls (NTCs), bei denen die cDNA durch DEPC-behandeltes Wasser ersetzt wurde. Die Proben zur Bestimmung der Expression der untersuchten Gene, des „Housekeeping-Gens “ und die Negativkontrollen wurden in zwei identischen Messdurchgängen als Triplikate gemessen, die einzelnen Standardverdünnungen als Duplikate. Diese Mehrfachmessungen dienten der Sicherung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Zur Etablierung der qPCR wurden verschiedene Annealing- Temperaturen, MgCl2- und Sondenkonzentrationen an einer Standard-verdünnungsreihe getestet, bis die für das verwendete Sonden-Primer-Paar besten Bedingungen ermittelt waren. Die Auswahl der verwendeten Primer und Sonden erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms BeaconDesigner^® 2.03 der Firma Premier Biosoft International (Palo Alto, USA) (Tabelle 6). Die Primersynthese wurde von den Firmen Invitrogen (Karlsruhe) und Applied Biosystems (Weiterstadt) durchgeführt, die Herstellung der Oligonukleotidsonden (TaqMan-Sonden) von der Firma Applied Biosystems (Weiterstadt). Bei allen Sonden wurde TAMRA als Quencherfarbstoff verwendet, als Reporterfarbstoff dienten FAM bzw. VIC. Die Komponenten für einen Reaktionsansatz mit einem Volumen von 25 µl stammten bis auf das DEPC-behandelte Wasser aus Brilliant Core Reagent Kits der Firma Stratagene (LaJolla, USA, Best.-Nr. 600530) (Tabelle 7).

Tabelle 6: Nukleotidsequenzen und Schmelzpunkte verwendeter Primer und TaqMan-Sonden

Primer 59,2°C TACTAGTGCTGACG CCTGGC

Reverse

Primer 59,1°C TTCCGCTTCACCAG CTCCAT

Transforming Growth Factor 1β (AF175709)

TaqMan-Sonde 68,9°C CCGCCGGACTGTCC

ACCTGCAAGA

VIC-5´-…

79 bp

Forward

Primer 59,3°C GGCTGCACTTCACT GTTGTCTA

Reverse

Primer 59,5°C CTGAGGATTGGCTC TGGGAAAC

Primer 59,2°C CACAACAGGAAGTT GCTGAAGGA

Reverse

Primer 59,1°C CATATTATGTCATC GCAGAGAACAGATC

Primer 59,2°C GCTGGAATTCCGTG CCTGG

Reverse

Primer 58,4°C GCCTTGGAAACCTT GGGGAC

Prokollagen a1(I) (AF034691)

TaqMan-Sonde 68,9ºC TCCTTCTGGTCCTCG TGGTCTCCCTGG

Primer 60°C CAAAAACGACCCAC

CAATGG

Reverse

Primer 62°C GGCCTGGATGGTTC

AGGATA

Tabelle 7: Konzentrationen und Volumina der einzelnen Komponenten eines Reaktions-ansatzes

* vom Hersteller mitgeliefert

Die einzelnen Komponenten wurden entsprechend der Anzahl an Reaktionen auf Eis zusammenpipettiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach dem Aliquotieren erfolgte die Zugabe von 1 µl gelöster cDNA, bzw. bei den Negativkontrollen von 1 µl DEPC-behandeltem Wasser. Das Zeit-Temperatur-Profil der nachfolgenden Zweistufen-PCR mit 40 Zyklen wurde entsprechend der zuvor durchgeführten Etablierungsarbeiten der jeweiligen Sonde gewählt (Tabelle 8).

Komponenten Spezifität eingesetztes Volumen Endkonzentration Core Reagent Buffer (10x)* 2,5 µl

dNTP (je 5mM)* 1 µl 200 µM

TGFß 2,78 µl 5 mM

IL-1ß 4,17 µl 7,5 mM

Proa1(III) 2,78 µl 5 mM

Pro1(I) 2,78 µl 5 mM

MgCl2 (50 mM)*

EF-1a 2,78 µl 5 mM

ForwardPrimer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM

Reverse Primer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM

TGFß 0,1 µl 200 nM

IL-1ß 0,05 µl 100 nM

Proa1(III) 0,1 µl 200 nM

Pro1(I) 0,1 µl 200 nM

TaqMan-Sonde

EF-1a 0,1 µl 200 nM

Referenzfarbstoff (ROX)* 0,38 µl 76 nM

Surestart TaqPolymerase (5 U / µl)*

0,13 µl 0,0025 U / µl DEPC-behandeltes Wasser ad 25 µl

Tabelle 8: Zeit-Temperatur-Profile der Zweistufen-PCR

TaqMan-Sonde Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing und Extension Transforming Growth

Factorβ

95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min

Interleukin-1ß 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min Prokollagen a1(III) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min Prokollagen a1(I) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min Elongationsfaktor-1α 95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min

Aus dem Quotienten der Fluoreszenzsignale von Reporter- (FAM oder VIC) und passivem Referenzfarbstoff (ROX) wurde automatisch ein normalisiertes Reportersignal (Rn-Wert) berechnet. Die Rn(+)-Werte stellten das relative Reportersignal der zu messenden Proben und die Rn(-)-Werte das der Leerkontrollen dar. Aus der Differenz des Rn(-)-Wertes (Hintergrundfluoreszenz) und des Rn(+)-Wertes der ersten Zyklen ergab sich der ∆Rn-Wert (dRn), der logarithmisch in einem Koordinatensystem an der Abszisse aufgetragen wurde, und mit dessen Hilfe eine Amplifikationskurve erstellt wurde. Diese Amplifikationskurve entspricht der graphischen Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Zunahme an Produkt im jeweiligen Reaktionsgefäß. Aus den Fluoreszenzdaten in einem schwankungsarmen Bereich von mindestens 5 der ersten 12 Zyklen konnte eine Basislinie abgeleitet werden, die zur Ermittlung eines Messgrenzwertes (sog. threshold) diente. Der threshold sollte dabei in einem Bereich ≤ 0,015 dRn liegen. Der Thresholdcycle (CT), der die Grundlage für die Berechnung der Ausgangskopienzahl bildete, stellte den Schnittpunkt des thresholds mit der Amplifikationskurve dar. Zur Quantifizierung der zu messenden Proben wurde anhand der mitgeführten definierten Verdünnungsreihe (DNA-Kopienstandard) automatisch eine Standardkurve der logarithmierten CT-Werte erstellt. Durch Interpolation der CT-Werte der Proben aus dem Tierversuch konnte so die der in der jeweiligen Probe vorhandene ursprüngliche Kopienzahl ermittelt werden.

Im Dokument Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie (Seite 74-79)