Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen

Für die exakte Erfassung der in den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen erhobenen Befunde und um eine Grundlage für den Vergleich des Verlaufs der Lungenveränderungen mit den durch qPCR ermittelten Genexpressionsdaten zu schaffen, erfolgte eine morphometrische Quantifizierung von verschiedenen Parametern für regenerative, degenerative, entzündliche und reparative Prozesse. Hierfür wurden die Zellproliferationsrate durch immunhistochemische Markierung von Ki-67, die Zelluntergangsrate im TUNEL-Assay und der Umfang infiltrierender Granulozyten und Makrophagen als Maß für die ablaufende entzündliche Reaktion durch immunhistochemische Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens bestimmt. Die Infiltration mit Lymphozyten wurde rein lichtmikroskopisch beurteilt. Zudem diente die phasenanalytische Bestimmung des Gehalts an kollagenen und retik ulären Fasern anhand der Heidenhainschen Azanfärbung auf Ebene der alveolären Septen der Beurteilung möglicher fibrotischer oder auch erosiver Prozesse.

4.2.1 Zellproliferationsrate

Um das Ausmaß ablaufender regenerativer und reparativer Vorgänge beurteilen zu können, wurden proliferierende Zellen durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67 dargestellt. Durch die Bestimmung ihres Anteils an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen Zeitpunkten der Biopsieprobenentnahme konnte die Proliferationsrate ermittelt werden. Im Vergleich der Immunhistochemie mit den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen hatte sich gezeigt, dass es sich bei den Ki-67-positiven Zellen weitaus überwiegend um Alveolar-epithelzellen vom Typ II handelte, jedoch fanden sich auch im Interstitium gelegene, plumpkernige, proliferierende Zellen mit fibroblastenähnlicher Morphologie.

Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (Pferde 1 + 2) zeigte sich im Durchschnitt ab Tag 1 ein Anstieg des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,1 % (± 0,4) in den Kontrollen um den Faktor 3,8 bis auf 4,2 % (± 0,9) am 7. Versuchstag. Zwar fanden sich bei den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen keine Hinweise auf das Vorliegen von Alveolarschäden, dennoch spricht die Zunahme für den Ablauf regenerativer Prozesse. Nach Erreichen des Maximalwertes erfolgte eine Regression bis zu Tag 14 und im

Weiteren sogar eine Überkompensation mit einem Absinken der Zellproliferationsrate auf unter 50 % des Ausgangswertes (Abb. 26, Anhänge Tabelle 11).

Bei den Tieren der höheren Dosisgruppe (Pferde 3, 4, 5, 6, 7 und 8) zeigte sich in der exsudativen Phase bereits unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon eine durchschnittliche Zunahme des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 4,5

% (± 3,9) auf 10,9 % (± 8,4) an Tag 1 und 8,7 % (± 4,3) an Tag 4. Danach konnte ein sprunghafter Anstieg beobachtet werden, der am 8. Tag mit 25,6 % (± 7,5) seinen Höchstwert erreichte und als wesentliches Kennzeichen des Übergangs von der exsudativen zur proliferativen Phase aufgefasst wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium zeigte sich eine kontinuierliche Abnahme bis zu Tag 18, jedoch blieb die Zellproliferationsrate auch nach einer Versuchsdauer von 22 Tagen mit durchschnittlich 9,6 % (± 4,0) um 215 % signifikant erhöht. Grundsätzlich sank die Zellproliferationsrate bis Ende des Beobachtungszeitraums bei keinem Pferd der höheren Dosisgruppe zurück auf die Ausgangswerte (Abb. 27, Anhänge Tabellen 11 + 12). Die an Tag 29 gemessene durchschnittliche Zellproliferationsrate von 10,0

% (± 5,2) war noch immer etwa doppelt so hoch wie die der Kontrollen. Es ist also davon auszugehen, dass noch längere Zeit nach dem Ausheilungsstadium regenerative und / oder reparative Prozesse abliefen, die durch rein lichtmikroskopische Betrachtung nicht erfasst werden konnten.

Auffällig war auch eine vorübergehende Abnahme der Zellproliferationsrate in der exsudativen Phase bei den Pferden 4, 6 und 7.

0 Anteil Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (%) 2

Versuchstag Abb. 26: Zellproliferationsrate (Vorversuch)

Anteil Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (%)

Abb. 27: Zellproliferationsrate (Hauptversuch)

**

**

Versuchstag

* Kontrolle

** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

4.2.2 Zelluntergangsrate

Um das Ausmaß des Perillaketon- induzierten Zelluntergangs zu beurteilen, wurden nekroti-sche und apoptotinekroti-sche Zellen durch terminal dUTP nick end labeling (TUNEL), einem seit langem bekannten und gut etablierten Verfahren, dargestellt. Mit der Bestimmung des Anteils TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen Zeitpunkten der Biopsie-probenentnahme konnte die Rate untergehender Zellen ermittelt werden. Ultrastrukturell fan-den sich in diesem Zusammenhang bei Alveolarepithelzellen vom Typ I morphologische Kor-relate zur Nekrose. Veränderungen, wie sie bei Apoptose beobachtet werden können, waren zwar nicht anzutreffen, da jedoch der Anteil TUNEL-positiver Zellen mit Ausnahme der Pferde 3 und 5 unmittelbar vor der Euthanasie bei unter 2 % lag, ist es nicht unwahr-scheinlich, dass apoptotische Zellen bei der punktuellen elektronenmikroskopischen Untersuchung nicht erfasst wurden.

Der Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl bei den Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch zeigte ausgehend von durchschnittlich 0,4 % (± 0,1) zunächst einen geringen Abfall, stieg von Tag 3 bis Tag 14 gegenüber den Kontrollen um 91 % auf 0,7 % (± 0,1) an und fiel ab Tag 17 wieder auf das Ausgangsniveau (Abb. 28, Anhänge Tabelle 13). Aufgrund der Tatsache, dass dieser Prozess erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon abläuft, ist ein direkter kausaler Zusammenhang nicht gesichert und indirekte Mechanismen sind zu diskutieren. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine Zunahme der Pro-liferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu einem ablaufen-den Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren Zelluntergangsrate wies auch die höhere Zellproliferationsrate auf.

Im Hauptversuch zeigten die Tiere interindividuell sehr unterschiedliche Reaktionen. Die stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5. Hier erfolgte unmittelbar vor dem Tod am Übergang von der exsudativen zur proliferativen Phase eine erkennbare Zuna hme TUNEL-positiver Zellen. Ausgehend von 1,9 % lag bei Pferd 3 ein Anstieg um den Faktor 2,2 auf 4,1 % bis zum 8. Tag vor und bei Pferd 5 ausgehend von 0,5 % um das 5,7fache auf 3,0 % bis zum 4. Tag. Diese vergleichsweise massiven Defekte können den moribunden Zustand der Tiere erklären. Lediglich noch bei Pferd 8 zeigte sich immerhin eine Steigerung der Zelluntergangsrate gegenüber dem Ausgangswert von 0,9 % um den Faktor 1,7 auf 1,6 % von Tag 1 bis Tag 8, um bis zum 15. Tag wieder abzufallen. Bei diesem Tier konnten am 4. Versuchstag keine Lungenbiopsieproben gewonnen werden. Bei den Pferden 4, 6 und 7 waren keine signifikanten Abweichungen zu beobachten, obwohl auch hier Epitheldefekte und als Folge davon eine deutlich erhöhte AII-Proliferation nachgewiesen

werden konnten. Ein Effekt der möglicherweise in Betracht gezogen werden muss, ist, dass untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis bereits desquamiert und durch die Mechanismen der bronchioalveolären Clearance abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß untergehender Zellen erfasst (Abb. 29, Anhänge Tabellen 13 + 14).

0,00

Abb. 29: Zelluntergangsrate (Hauptversuch)

Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (%)

Abb. 28: Zelluntergangsrate (Vorversuch)

Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (%)

Versuchstag

* Kontrolle

** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

**

**

Versuchstag

*

*

4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und Granulozyten an der Gesamtzellzahl

Entzündungszellen spielen eine große Rolle bei der Expression von Cytokinen und nehmen dadurch erheblichen Einfluss nicht nur auf die Kollagensynthese, sondern auch auf zahlreiche andere Prozesse im Rahmen eines Entzündungsgeschehens. Als Maß für die ablaufende Entzündungsreaktion und um ihren Einfluss auf die mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion bestimmte Expression von TGF-β, Interleukin-1β, Prokollagen a1(I) und a1(III) beurteilen zu können, wurden Granulozyten und Makrophagen immunhistochemisch durch die Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens dargestellt und ihr Anteil an der Gesamtzellzahl bestimmt. Aufgrund ihrer Morphologie handelte es sich dabei überwiegend um diffus verteilte Makrophagen, während Granulozyten in geringerem Umfang vertreten waren und zu herdförmigen Ansammlungen neigten.

In der niedrigeren Dosisgruppe zeigte Pferd 1 über den gesamten Beobachtungszeitraum keine signifikanten Änderungen der Makrophagen- und Granulozytenpopulation, während bei Pferd 2 ab dem ersten Versuchstag eine kontinuierliche Zunahme ausgehend von einem Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,6 % vor Versuchsbeginn auf 4,8 % an Tag 7 erfolgte. Von Tag 7 bis Tag 10 konnte eine Abnahme etwa bis auf das Ausgangsniveau beobachtet werden (Abb. 30, Anhänge Tabelle 15).

In der höheren Dosisgruppe erfolgte bei Pferd 5 und 6 in der exsudativen Phase bereits 24 h nach der Applikation von Perillaketon, bei den anderen Pferden der Gruppe erst ab Tag 1 eine deutliche Zunahme MAC 387-positiver Zellen. Die durchschnittliche Infiltration mit Makrophagen und Granulozyten erreichte gleichzeitig mit der Zellproliferationsrate in der proliferativen Phase ihren Höhepunkt. Ausgehend von 2,5 % (± 0,6) MAC 387-positiven Zellen in den Kontrollen zeigte sich ein Anstieg um den Faktor 3,6 bis zu einem Maximum von 9,1 % (± 1,8) am 8. Tag. Eine Ausnahme bildete hier Pferd 5, das bereits nach 5 Tagen euthanasiert wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium konnte im Gegensatz zur Zellproliferationsrate ein völliges Abklingen der Entzündungsreaktion bis Tag 15 beobachtet werden (Abb. 31, Anhänge Tabellen 15 + 16). Eine geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate ließ sich lichtmikroskopisch lediglich in der proliferativen Phase beobachten.

0

Abb. 30: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Vorversuch)

Anteil an der Gesamtzellzahl (%)

Versuchstag

Abb. 31: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Hauptversuch)

Anteil an der Gesamtzellzahl (%)

Versuchstag

**

**

* Kontrolle

** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und retikulären Fasern

Um mögliche fibrotische oder erosive Prozesse beurteilen zu können, die mit einer Zunahme bzw. Verringerung des Gehalts der alveolären Septen an extrazellulärer Matrix einhergehen, erfolgte die computergestützte phasenanalytische Auswertung der in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern bis zum 29. Versuchstag.

In der niedrigen Dosisgruppe zeigte sich auch nach einer Versuchsdauer von 28 Tagen keine signifikante Änderung des Gehalts kollagener und retikulärer Fasern (Abb. 32, Anhänge Ta-belle 17).

Bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 aus der höheren Dosisgruppe konnte während des gesamten Beobachtungszeitraums von 29 Tagen keine signifikante Änderung der Menge der in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten extrazellulären Matrixbestandteile nachgewiesen werden. Lediglich bei Pferd 8 ließ sich ein geringer Anstieg der linearen Trendlinie beobachten, wobei jedoch der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an Tag 29 mit 14,8 % nur unwesentlich über dem Ausgangswert von 12,5 % lag. Die Pferde 3 und 5 wurden aufgrund der kurzen Versuchsdauer von nur 7 bzw. 11 Tagen nicht in die Messung einbezogen (Abb. 33, Anhänge Tabellen 17 + 18).

0

Abb. 32: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Vorversuch)

Anteil an der Gesamtfläche der alveolären Septen (%)

Versuchstag

Abb. 33: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Hauptversuch)

Anteil an der Gesamtfläche der alveolären Septen (%)

Versuchstag

*

*

* Kontrolle