Vergleich mit den klinischen Befunden

Als Grundlage für den Vergleich der in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse mit dem klinischen Verlauf wurde der von Frau Dr. Venner anhand der semiquantitativen Erfassung klinischer Befunde erhobene klinische Score herangezogen (Venner et al., 2003).

Entsprechend dieses Bewertungsschemas zeigte sich bereits ab der Applikation von Perillaketon ein kontinuierlicher Anstieg des durchschnittlichen klinischen Scores in der höheren Dosisgruppe, der am 5. Tag mit 8,5 Punkten sein Maximum erreichte und damit für eine hochgradige, lebensbedrohende Lungenerkrankung sprach. Bis zum 15. Versuchstag erfolgte eine stetige Abnahme bis zu einer mittleren Scorepunktezahl von 1. Dieser Wert blieb bis zum 32. Tag konstant und kehrte zwischen Tag 35 und 40 wieder auf den Ausgangswert zurück. Im Vergleich dazu erreichten die durchschnittliche Zellproliferationsrate und die Infiltrationsrate mit Granulozyten und Makrophagen erst mit einer Verzögerung von 3 Tagen am 8. Versuchstag ihr Maximum also zu einem Zeitpunkt, an dem der klinische Score bereits wieder abnahm. Die Zellproliferationsrate blieb ebenfalls zusammen mit dem klinischen Score noch nach dem lichtmikroskopisch festgestellten Ende der Ausheilungsphase erhöht, während der durchschnittliche Anteil granulohistiozytärer Infiltrate an der Gesamtzellzahl an Tag 15 zusammen mit dem klinischen Score das Niveau des Kontrollwertes erreichte. Die durchschnittlichen Genexpressionen von Prokollagen a1(III) und a1(I) erreichten ihr Maximum verglichen mit dem klinischen Score deutlich verzögert an Tag 11 bzw. an Tag 18, also zu Zeitpunkten, an denen der Grad der klinischen Symptome bereits wieder deutlich abgenommen hatte. Ein Zusammenhang des Verlaufs der klinischen Symptomatik mit der Expression von IL-1ß und TGFß konnte nicht beobachtet werden.

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Abb. 42: Klinischer Score (Vorversuch) ¹

Kopienzahl / 102 Kopien EF-1α

Versuchstag

Abb. 43: Klinischer Score (Hauptversuch) ¹

Kopienzahl / 102 Kopien EF-1α

Versuchstag

* Kontrolle

** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

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**

*

*

1 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. M. Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover)

5 Diskussion

Interstitielle Lungenerkrankungen sind eine häufige Folge zahlreicher, sehr heterogener Insulte und werden bei Sportpferden als eine wesentliche Ursache für eine in zunehmendem Maße auftretende verminderte Leistungsfähigkeit betrachtet (BUERGELT et al., 1986;

WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990; BUERGELT, 1995). Initial steht dabei im Krankheitsverlauf ein akuter Alveolarschaden im Zentrum, gekennzeichnet durch Defekte des Alveolarepithels und –endothels mit fibrinreicher Exsudation in die Alveolarlumina, der mit einem Funktionsverlust der alveolo-kapillären Einheiten einhergeht. Es folgen im subakuten und chronischen Stadium regenerative und reparative Prozesse, zu denen vor allem eine reaktive Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II, aber auch von Fibroblasten gehört. Unter günstigen Voraussetzungen ist eine vollständige Ausheilung möglich, vielfach werden jedoch als Konsequenz mehr oder weniger stark ausgeprägte irreversible Veränderungen in Form von Lungenfibrose beobachtet. Hier erfolgt zwar grundsätzlich eine deregulierte, überschießende Ablagerung aller extrazellulären Matrixproteine, im Vordergrund steht jedoch die Akkumulation vor allem der Kollagentypen I und III (DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995; BRUCE, 1995).

Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr stark variieren, und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei relativ geringer Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare Leistungseinbußen. Aber auch bei der Nutzung von Pferden aus der Hobby- und Freizeithaltung können sie eine Rolle spielen (DIEKMANN et al., 1990). Ein Tiermodell der interstitiellen Pneumonie des Pferdes könnte daher als wertvolles Instrument sowohl für eine Verbesserung der klinischen Diagnostik und Prognosestellung genutzt werden, als auch zu einem besseren Verständnis der Pathogenese führen.

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Darstellung der pathomorphologischen Lungenveränderungen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene sowie durch immunhistochemische Methoden an transkutan gewonnenen Biopsieproben zu klären, ob experimentell über einen akuten Alveolarschaden durch eine einmalige intravenöse Applikation von Perillaketon (1-(3- furyl)4-Methylpentaton) das Bild einer interstitiellen Pneumonie beim Pferd induziert werden kann. Der Versuchsansatz wurde dabei in Anlehnung an bereits bestehende Tiermodelle etabliert, in denen Perillaketon zur Induktion

nichtkardiogener Lungenödeme und Diffuse Alveolar Damage (DAD) beim Schaf (BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; HWANG et al., 2001) oder restriktiver Lungenerkrankungen beim Pony (BREEZE et al., 1984) verwendet wurde. Nach der Bestätigung dieser Hypothese, schloss sich als zweite Fragestellung an, welche Rolle die Genexpressionen der Cytokine Interleukin-1ß und TGF-ß sowie der extrazellulären Matrixproteinvorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) im Krankheitsverlauf spielen. Von diesen Faktoren ist bekannt, dass sie große Bedeutung bei akuten und chronischen Lungenerkrankungen besitzen und aussichtsreiche Kandidaten als prognostische Parameter für verschiedene Lungenerkrankungen, vor allem für DAD beim Menschen, darstellen. In den bisherigen in diesem Zusammenhang stehenden Veröffentlichungen über IL-1ß, TGF-ß und Parametern für die Kollagensynthese beim Menschen wurden Untersuchungen überwiegend auf Proteinebene an bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit und an Trachealaspiraten durchgeführt (KIRK et al., 1984b; HORSLEV-PETERSEN, 1990;

WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; DEHEINZELIN et al., 1997; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000; MIKUNIYA et al., 2000).

Bei dem in der vorliegenden Arbeit zur Induktion einer interstitiellen Pneumonie eingesetzten Perillaketon handelt es sich um das wichtigste toxische Agens der Purpurminze (GARST et al., 1984). Es ist seit langem bekannt, dass die Aufnahme der Pflanze bei Weidetieren zur Entstehung einer interstitiellen Pneumonie führt (KERR et al., 1986). Die nach einem Verfahren von GARST und WILSON (1984) und GARST et al. (1985) synthetisierte Reinsubstanz wurde bereits auch von mehreren Autoren in Tierversuchen zur Erzeugung eines akuten Alveolarschadens eingesetzt (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al., 1988; BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et al., 2001). Im Unterschied zu diesen Untersuchungen wurde in der vorliegenden Arbeit der Beobachtungszeitraum mit 29 Tagen deutlich länger gewählt und nach 60 Tagen eine abschließende Sektion geplant, um auch das Stadium der Ausheilung oder - sofern sie sich bei nur einmaliger Exposition gegenüber dem toxischen Agens einstellen sollte - die Entstehung einer Lungenfibrose mit erfassen zu können. Grundsätzlich müssen bei der Verwendung von Pferden im Tierversuch das Fehlen definierter Laborstämme und die hohen Kosten bei der Anschaffung in Betracht gezogen werden sowie der große Aufwand bei Monitoring, Unterbringung und Versorgung im Rahmen von einem Untersuchungszeitraum von mehreren Wochen. Zudem sind im Zusammenhang mit Studien wie sie hier durchgeführt wurden nur

lungengesunde Tiere einsetzbar, wodurch die Auswahl geeigneter Tiere erheblich eingeschränkt wird. In der vorliegenden Arbeit konnte daher nur eine relativ geringe Anzahl von Tieren eingesetzt werden. Das heterogene Tiermaterial muss zudem als Ursache für die zum Teil sehr starken interindividuellen Schwankungen der Ergebnisse diskutiert werden. Da an den Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch nach einer Dosierung von 5 mg Perillaketon / kg KG als Bolusinjektion nur gering ausgeprägte histomorphologische Alterationen beobachtet werden konnten, wurden bei den folgenden Tieren 6 mg Perillaketon / kg KG eingesetzt.

Hierdurch konnten ausgeprägtere Veränderungen herbeigeführt werden. Im Vergleich dazu sind bei Versuchen zur Erzeugung nichtkardiogener Lungenödeme beim Schaf Dosierunge n von 15 bis zu 30 mg PK / kg KG beschrieben, die anästhesierten oder wachen Tieren als Dauertropfinfusion verabreicht wurden (COGGESHALL et al., 1987; ABERNATHY et al., 1992). Auch BREEZE et al. (1984) verwendeten zur Induktion restriktiver Lungenveränderungen beim Pony 18 mg PK / kg KG wobei die Applikation ebenfalls über Dauertropfinfusion erfolgte. Da die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Versuchspferde nach der intravenösen Applikation von 6 mg PK / kg KG als Bolusinjektion hochgradige, zum Teil lebensbedrohliche klinische Symptome zeigten, war eine Steigerung auf die beim Schaf und Pony beschriebenen Dosierungen nicht sinnvoll. Diese abweichenden Reaktionen können auf rasse- und speziesspezifische Unterschiede und auch auf die Applikationsform zurückzuführen sein.

Zur Gewinnung von Lungengewebe kam mit der durchgeführten transkutanen Entnahme von Biopsieproben mittels der halbautomatischen Biopsiepistole Pro-Mag 2.2 (Fa. USBiopsy engineered medical products, Franklin, USA) ein für diese Zwecke neuartiges Verfahren zum Einsatz, das gegenüber der Anwendung einer herkömmlichen True-Cut Nadel hinsichtlich Probenqualität und Nebenwirkungen für das Pferd deutliche Vorteile besitzt (VENNER et al., im Druck). Da von den einzelnen Bioptaten mehrere Teilproben gewonnen wurden, die jeweils für die morphologischen, morphometrischen und molekularbiologischen Untersuchungen herangezogen wurden, konnte ein direkter Vergleich zwischen dem Verlauf der morphologischen Veränderungen und der Expressionsrate der ausgewählten mRNA-Spezies gezogen werden. Diese Kombination verschiedener Methoden, die an intra vitam gewonnenem Probenmaterial durchgeführt wurden und eine unmittelbare Gegenüberstellung der jeweiligen Ergebnisse ermöglicht, besitzt Modellcharakter für zukünftige ähnliche Untersuchungen. Insbesondere mit der Reverse Transkriptase - quantitativen Polymerase-kettenreaktion wurde ein hochspezifisches und -sensitives Verfahren etabliert, das sich bei der

Auswertung sehr kleiner Gewebemengen wie den hier vorliegenden Minimalbiopsieproben eignet.

Bei der lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Auswertung der Kontrollbiopsieproben, die vor Versuchsbeginn von verschiedenen Lokalisationen entnommen wurden, konnte nur normal strukturiertes Lungengewebe festgestellt werden. Es fand sich physiologischerweise auftretendes und zum Stützgerüst der Lunge gehörendes kollagenes Bindegewebe. Aufgrund des bei der Gewinnung der Biopsien verursachten Traumas wurden verschiedene entnahmebedingte Artefakte beobachtet, die grundsätzlich bei der Beurteilung der Proben mit in Betracht gezogen werden mussten. Es handelte sich dabei auf lichtmikroskopischer Ebene um eine unterschiedlich starke Kompression des Lungengewebes bis hin zu subtotaler oder totaler Atelektase, ein graduell variierendes, überwiegend sehr gering ausgeprägtes alveoläres Ödem und intraalveolär gelegene Erythrozyten. In sehr wenigen Fällen - bezogen auf alle gewonnenen Proben - fanden sich in den Randbereichen der Bioptate Lipidtröpfchen und versprengtes quergestreiftes Muskelgewebe, die eine Kontamination mit Material aus Unterhautfettgewebe und Interkostalmuskulatur als Folge der transkutanen Entnahmetechnik darstellten. Elektronenmikroskopisch konnte vereinzelt in einigen Bereichen auch eine Schwellung des Kapillarendothels beobachtet werden sowie eine ziehharmonikaartige Faltung der alveolären Septen. Nach der einmaligen intravenösen Applikation von Perillaketon in einer Dosis von 6 mg / kg KG konnten die hervorgerufenen Lungenveränderungen anhand ihrer licht- und elektronenmikroskopisch dargestellten Morphologie in drei verschiedene Phasen eingeteilt werden, die in ihrem Erscheinungsbild den einzelnen der von JUBB (1991) beschriebenen Stadien der interstitiellen Pneumonie entsprachen: initiale exsudative Phase (1.

bis 4. Tag post applicationem), proliferative Phase (4. bis 11. Tag post applicationem) und bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 Ausheilung (11. bis 18. Tag post applicationem). Pferd 3 und Pferd 5 mussten am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert werden. Mit der angewandten transkutanen Entnahmetechnik konnten nicht von allen Lungenarealen Proben gewonnen werden, sondern nur aus einem begrenzten oberflächlichen Abschnitt der beiden Hauptlappen bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 – 2 cm. Da jedoch in den unterschiedlichen Biopsielokalisationen des gleichen Entnahmetages stets übereinstimmende morphologische Befunde erhoben wurden, konnte man davon ausgehen, dass die Lungenveränderungen systemisch auftraten. Die im ersten Stadium angetroffenen Veränderungen der Alveolarwand mit endothelialen und epithelialen Schäden, interstitiellem und intraalveolärem Ödem und entzündlicher zellulärer Infiltration entsprechen dem Bild der in der Literatur beschriebenen exsudativen Phase. Zwar waren keine hyalinen Membranen

wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitieller Pneumonie darstellbar, jedoch fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Interzellularspalten, wie sie bei in vitro-Versuchen unter Einfluss von Perillaketon an bovinen aortalen Endothelzellen gefunden wurden (WATERS et al., 1993), oder Unterbrechungen des Endothelzellverbandes mit Verlust von Endothelzellen bei in vivo-Studien (K ERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al., 1988) konnten nicht beobachtet werden. Zwar zeigten sich gut umschr iebene, hochgradig ausgedünnte Bereiche im Zytoplasma von ödematisierten Endothelzellen, kapillarseitig entblößte Abschnitte der Basalmembranen waren jedoch nicht zu beobachten. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Abschnitte der Blut-Luft-Schranke, bei denen die Basalmembran kapillarseitig nur noch von extrem dünnen Endothelzellbrücken bedeckt war, neben der Degeneration von Endothelzellen und dem Verlust von AI-Zellen eine Rolle bei der Permeabilitätssteigerung der Blut- Luft-Schranke spielen. Grundsätzlich können nach Angaben verschiedener Autoren kapillarseitig entblößte Basalmembranen bei alveolären Schäden aufgrund der Regenerationsfähigkeit von Endothelzellen nur selten beobachtet werden. Zudem werden degenerierende Endothelzellen vor ihrer Ablösung häufig von Zytoplasmaausläufern benachbarter Zellen unterminiert, um nach deren Verlust eine Kontinuitätsunterbrechung des Zellverbandes zu vermeiden (CORRIN u. VIJEYARATNAM, 1975; BACHOFEN u. WEIBEL, 1977; JUBB, 1991). Vereinzelt angetroffene intrakapilläre Makrophagen mit phagozytierten Lamellarkörperchen lassen darauf schließen, dass ursprüngliche Alveolarmakrophagen nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren ausgewandert sind. Die pathomorphologischen Veränderungen des zweiten Stadiums vom 4.

bis 11. Tag entsprachen dem Bild der proliferativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Der Übergang dieser beiden Phasen ist klassischerweise durch die beginnende Proliferation von AII-Zellen gekennzeichnet (JUBB, 1991). Grundsätzlich lag jedoch in der vorliegenden Arbeit ein fließender Übergang vor, und es konnten in beiden Phasen in unterschiedlichem Ausmaß sowohl Epitheldefekte als auch proliferierende AII-Zellen nachgewiesen werden. Die Einteilung der einzelnen Stadien der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen erfolgte daher vor allem aufgrund des Umfangs der AII-Zellproliferation. Die immunhistochemische Markierung von Ki-67 hat zudem gezeigt, dass sich proliferierende Zellen - wie für dieses Stadium der Erkrankung typisch - nicht nur an der luminalen Seite der Alveolen befanden, bei denen es sich elektronenmikroskopisch um AII-Zellen und deren Übergangsformen im Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen handelte, sondern auch im verbreiterten Interstitium. Diese plumpkernigen Zellen glichen in ihrem Erscheinungsbild Fibroblasten.

Zudem fanden sich elektronenmikroskopisch Fibroblasten mit dilatiertem, endo-plasmatischem Retikulum als Ausdruck erhöhter Stoffwechselaktivität. Diese Befunde können in diesem Stadium in Zusammenhang mit der verstärkten Expression von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) gesehen werden. Die hochgradige Vermehrung von Alveolarepithelzellen vom Typ II, die den meisten Alveolen ein adenoides Aussehen verlieh, führte zusammen mit dem ebenfalls beobachteten interstitiellen Ödem und der Schwellung von Endothelzellen zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke, wodurch die in dieser Phase auftretende respiratorische Insuffizienz erklärbar ist. Nach Erreichen des Höhepunktes der Proliferation von AII-Zellen erfolgte in der dritten Phase von Tag 11 bis 18 post applicationem bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 eine Rückbildung der Veränderungen, bis rein lichtmikroskopisch im Vergleich zu den Kontrollen keine abweichenden Befunde mehr erhoben werden konnten. Bei der, mit Ausnahme der Pferde 3 und 5, fortgeführten Auswertung von Biopsieproben am HE-gefärbten Paraffinschnitt und am Semidünnschnitt bis zur 8. Woche nach Versuchsbeginn und der anschließenden, pathohistologischen Untersuchung einer Lunge pro Pferd konnten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen gefunden werden. Die angetroffenen pathohistologischen und ultrastrukturellen Veränderungen in der akuten und subakuten Phase entsprechen prinzipiell den Beschreibungen experimenteller, Perillaketon- induzierter Lungenveränderungen bei Schafen und Pferden anderer Autoren (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al., 1988;

BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et al., 2001). Sie sind auch vergleichbar mit der bei Rindern beobachteten interstitiellen Pneumonie nach spontaner Vergiftung durch Aufnahme von Purpurminze beim Weidegang (KERR et al., 1986) und mit Veränderungen wie bei Chronisch Obstruktiver Bronchitis (COB) des Pferdes auf alveolärer Ebene (KAUP et al., 1990bc). Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (5 mg PK / kg KG) fanden sich in allen Phasen, sofern überhaupt nachweisbar, im Vergleich mit der höheren Dosisgruppe (6 mg PK / kg KG) deutlich geringer ausgeprägte Erscheinungen, was für eine geringe toxische Breite von Perillaketon spricht.

Um das Aus maß und den genauen zeitlichen Verlauf der festgestellten Veränderungen zu erfassen, wurden die wesentlichen pathomorphologischen Parameter anhand geeigneter Methoden dargestellt und morphometrisch quantifiziert. Diese Daten dienten auch als Grundlage für den Vergleich des zeitlichen Ablaufs der morphologischen Veränderungen mit den Ergebnissen der Genexpressionsstudien.

Folgende Parameter wurden gemessen:

1. die Zellproliferationsrate als Maß für ablaufende regenerative und reparative Prozesse, bestimmt durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67,

2. die Perillaketon- induzierte Zelluntergangrate, bestimmt durch terminal dUTP nick end labeling,

3. die Infiltrationsrate von Granulozyten und Makrophagen als Parameter für die ablaufende entzündliche Reaktion, bestimmt durch die immunhistochemische Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens und

4. der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen als Parameter für fibrotische oder erosive Prozesse, phasenanalytisch bestimmt in der Heidenhainschen Azanfärbung.

Betrachtet man die Zellproliferationsrate, so ließen sich bei den Tieren aus dem Hauptversuch sehr einheitliche Reaktionen feststellen. Bereits in der exsudativen Phase zeigten sich durch die Verdoppelung Ki-67-positiver Zellen bis zum 4. Tag in zunehmendem Umfang ablaufende regenerative Prozesse. Sie erreichten in der proliferativen Phase am 8.

Versuchstag ihr Maximum. Da es sich dabei aufgrund der elektronenmikroskopischen Untersuchung im Wesentlichen um Alveolarepithelzellen vom Typ II und deren Übergangsformen handelte, kann dieser hohe Wert nur durch zuvor erfolgte Desquamation von Alveolarepithelzellen vom Typ I erklärt werden. Der sprunghafte Anstieg der Zellproliferationsrate von Tag 4 bis Tag 8 unterstützte die in der lichtmikroskopischen Untersuchung getroffene Festlegung des Übergangs von der exsudativen Phase in die proliferative. Im anschließenden Ausheilungsstadium erfolgte zwar eine Regression, der Anteil proliferierender Zellen blieb jedoch auch noch nach dessen Ende an Tag 18 bis zum Abschluss der Untersuchungen an Tag 29 auf doppeltem Niveau der Ausgangswerte. Daher muss davon ausgegangen werden, dass über die lichtmikroskopisch festgestellte Ausheilungsphase des Perillaketon- induzierten akuten Alveolarschadens hinaus eine überkompensierende Defektheilung und / oder kompensierte reparative Prozesse ablaufen.

Wie in der Auswertung MAC 387-positiver Zellen festgestellt, findet sich keine gleichzeitige, über die Ausheilungsphase hinaus fortgesetzte entzündliche Reaktion. Bei den beiden Tieren

der niedrigeren Dosisgruppe waren licht- und elektronenmikroskopisch keine Veränderungen im Sinne einer exsudativen Phase zu beobachten, es zeigte sich aber trotzdem von Tag 1 bis Tag 7 eine Zunahme der Proliferationsrate durchschnittlich um den Faktor 3,8 verglichen mit den Kontrollen, was auch hier für den Ablauf regenerativer Prozesse spricht. Der bei mehreren Pferden in der exsudativen Phase beobachtete zeitlich begrenzte Abfall der Zellproliferationsrate ist eine mögliche Folge der Behandlung mit Methylprednisolon.

Die Perillaketon- induzierte Zelluntergangsrate wurde durch terminal dUTP nick end labeling, einem seit langem bekannten und gut etablierten Verfahren, als Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl bestimmt. Mit dieser Methode ist zwar eine Differenzierung zwischen Apoptose und Nekrose nicht möglich und nicht alle nekrotischen Zellen können erfasst werden, jedoch ist sie für eine Abschätzung des Umfangs untergehender Zellen durchaus geeignet. Elektronenmikroskopisch waren nur nekrotische Veränderungen von Alveolarepithelzellen vom Typ I anzutreffen und typische Hinweise auf Apoptose fehlten.

Aufgrund des verhältnismäßig geringen Anteils der Zelluntergänge kann grundsätzlich jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass bei der ultrastrukturellen Auswertung Apoptosen nicht erfasst wurden. Die stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5, die bereits nach wenigen Tagen in moribundem Zustand euthanasiert werden mussten. Hier konnte ab dem ersten Versuchstag eine signifikante Zunahme der Zelluntergangsrate festgestellt werden.

Diese vergleichsweise massiven Defekte können den moribunden Zustand der Tiere erklären.

Die übrigen Tiere dieser Gruppe zeigten keine erkennbaren Abweichungen, obwohl auch hier die deutlich erhöhte AII-Proliferation auf die Regeneration von Epitheldefekten hinweist.

Auch in anderen Tierversuchen in denen Perillaketon zur Induktion eines akuten Alveolarschadens eingesetzt wurde, konnten Untergänge von Alveolarepithelzellen vom Typ I und Epitheldefekte beobachtet werden, dort jedoch bereits in den ersten Minuten bis zu zwei Stunden (GARST et al., 1985; KERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al., 1988). Eine mögliche Erklärung kann darin liegen, dass untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis bereits desquamiert und durch die Mechanismen der bronchioalveolären Clearance abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß von Apoptose und Zellnekrose erfasst. Bemerkenswerterweise konnte auch bei den Tieren der niedrigen Dosisgruppe, die die am wenigsten ausgeprägten morphologischen Veränderungen aufwiesen, eine durchschnittliche Zunahme der Nekrose- und Apoptoserate von Tag 3 bis Tag 14 um 91 % gegenüber den Kontrollen beobachtet werden. Die Tatsache, dass dieser Prozess erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon abläuft, macht einen

Zusammenhang unwahrscheinlich. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine Zunahme der Proliferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu einem ablaufenden Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren Zelluntergangsrate wies auch die höhere Zellproliferationsrate auf.

Betrachtet man die Rate granulohistiozytärer Infiltrate, gemessen am Anteil MAC

Betrachtet man die Rate granulohistiozytärer Infiltrate, gemessen am Anteil MAC