Zur Beendigung der Synchronisation wurden Aufzeichnungsmedien mit verschiedenen Palmitatkonzentrationen sowie eine Kontrollbedingung ohne Palmitat auf die Zellen gegeben. Das Aufzeichnungsmedium enthielt in allen Versuchen 0,5 mM D-Luziferin. Die 96-Loch-Mikrotiterplatten wurden generell im äußersten Ring mit Isolationspuffer befüllt.
Die verschiedenen Konzentrationen wurden in Reihen abwechselnd auf der Platte verteilt, um systematische Fehler zu minimieren. Nach Hinzugabe des Aufzeichnungsmediums wurde die Platte mit einer luftdurchlässigen Membran zugeklebt. Die Messungen wurde nach entsprechender Protokolleinstellung (Temperatur: 32,5 °C) in dem SpectraMax L Microplate Luminometer (Hersteller: Molecular Devices) begonnen.
21 2.5 Molekulargenetische Methoden
2.5.1 RNA-Extraktion
Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden die benötigten Arbeitsmaterialen und Oberflächen für die RNA-Isolierung zunächst mit RNA-Dekontaminationsflüssigkeit gesäubert, und es wurde unter einem Abzug gearbeitet. Die Proben wurden während der RNA-Isolation auf Eis gelagert. Die Zellen wurden mit 500 µl TRIzol pro Vertiefung einer Sechs-Well-Plate (9,5 cm2 Fläche) durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren gelöst und homogenisiert. Die Suspension wurde in Reaktionsgefäße (1,5 ml der Firma Eppendorf) überführt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Folgend wurden zu jeder Probe 100 µl Chloroform hinzugegeben und durch Invertieren der Reaktionsgefäße vermischt. Die Proben wurden 5 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend wurden sie mit 15.294 rcf bei 4 °C für 15 Minuten zentrifugiert. Es entstanden drei Phasen: Eine untere organische Phase mit Proteinen, eine Interphase mit DNA und eine obere, wässrige Phase mit RNA. Es wurde die obere wässrige Phase vorsichtig abpipettiert und in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt, ohne die Interphase oder die untere visköse Phase zu tangieren. Nach Hinzugabe von 1 µl GlycoBlue und 250 µl Isopropanol oder alternativ 250 µl 75 % Ethanol wurden die Proben invertiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 17.949 rcf und 4 °C für 30 Minuten. Der Überstand wurde abpipettiert und die Niederschläge wurden zweifach mit je 500 ml 75 % Ethanol gewaschen. Zwischen den Waschschritten vor erneutem Abpipettieren des Überstands wurden die Proben bei 20.817 rcf und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand nach dem zweiten Waschen abpipettiert worden war, wurden die RNA-Niederschläge für 5 Minuten luftgetrocknet. Anschließend wurden die Niederschläge in je 20 µl Nuklease-freiem Wasser gelöst. Die Lagerung der RNA-Proben erfolgte bei -80 °C.
2.5.2 cDNA-Synthese
Für die cDNA-Synthese wurde das High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) genutzt. Die RNA-Proben wurden auf Eis aufgetaut. Die RNA-Konzentrationen wurden mit dem Epoch Microplate Spectrophotometer (Hersteller: Bio Tek) bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm gemessen. Es wurde das Programm „Nucleid Acid Quantification“ mit dem Probentyp RNA genutzt. Das Probenvolumen für die Messungen betrug 2 µl. Als Leerwert wurde eine äquivalente Menge Wasser genutzt. Die RNA-Reinheit
22 wurde anhand des 260 nm / 280 nm-Quotienten beurteilt, welcher zwischen 2,0 und 2,2 sein sollte.
Der RNA-Gehalt jeder Probe wurde entsprechend der vorherigen Konzentrationsbestimmung mit Nuklease-freiem Wasser verdünnt, sodass äquivalente Gesamtmengen an RNA in jedem Probenansatz für die RT-Reaktion bereitstanden. Die RNA-Konzentration wurde auf 1 µg/µl eingestellt. Für das Ansetzen des Reverse Transkriptase-Mastermixes (Tab. 3) wurden die benötigten Substanzen (mit Ausnahme der MultiScribe RT) auf Eis aufgetaut. Danach wurde der Mastermix angefertigt. Es wurden 10 µl RNA mit 10 µl Mastermix in ein PCR-Röhrchen pipettiert. Nach kurzem Durchmischen und Abzentrifugieren der Proben wurden diese im Thermozykler Biometra TRIO (Hersteller:
Analytik Jena) in cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Proben wurden mit Nuklease-freiem Wasser 1:20 verdünnt und anschließend bei -20 °C eingefroren.
Tabelle 3: Mastermix für Reverse Transkriptase-Reaktion (Ansatz je Probe)
10 x RT Puffer 2 µl
25 x dNTP Mix (100 mM) 0,8 µl 10 x RT random primer 2 µl MiltiScribe RT (50 U/µl) 1 µl Nuklease-freies Wasser 4,2 µl
Total 10 µl
Tabelle 4: Programm des Thermozyklers für die Reverse Transkriptase-Reaktion
25 °C 10 min
37 °C 120 min
85 °C 5 min
4°C ∞
2.5.3 Quantitative Echtzeit-PCR
Zur Bestimmung der Expression spezifischer Uhrengene wurden die cDNA und die Primer auf Eis aufgetaut. Die Primer waren zuvor institutsintern validiert worden. Die Duplikationseffizienzen der benutzten Primer betrugen 80 - 105 %. Für jedes Primerpaar wurde ein Primer Mix angefertigt und auf Eis gekühlt. Als fluoreszierender Farbstoff wurde der asymmetrische Cyanin-Farbstoff SYBR Green genutzt. Als Reaktionsansatz wurden 5 µl Primer Mix, 10 µl SYBR Green und 5 µl cDNA in eine 96-Loch-PCR-Mikrotiterplatte pipettiert. SYBR Green und Primer wurden jeweils als Master-Mix zusammenpipettiert, von welchem 15 µl pro Messansatz in die Vertiefungen pipettiert wurden. Während des Pipettierens wurde die 96-Loch-PCR-Mikrotiterplatte in einem wassergekühlten Ständer
23 gekühlt. Die Platte wurde mit einem Klebestreifen verschlossen, gevortext und für 2 Minuten bei 425 rcf zentrifugiert. Das Amplifikationsprotokoll wurde eingestellt und die Amplifikation wurde bei zeitgleicher Messung in dem Thermozykler CFX-96 Touch Real-Time PCR Detection System (Hersteller: BioRad) begonnen.
Tabelle 5: Primer Mix
Forward Primer Stock (100 µM) 14 µl Reverse Primer Stock (100 µM) 14 µl
Nuklease-freies Wasser 972 µl
Tabelle 6: qPCR-Reaktionsansatz für eine Probe
Primermix (je 1,4 µM) 5 µl
GoTag qPCR Master Mix 10 µl
cDNA 5 µl
Tabelle 7: Standard-Amplifikationsprogramm
94°C 5 min 1 x
94°C 15 s 40 x
60 °C 15 s 40 x
72°C 20 s 40 x
72°C 5 min 1 x
Tabelle 8: Sequenzen der qPCR-Primerpaare
Zielgen Forward Primer 5‘ → 3‘ Reverse Primer 5‘ → 3‘
Bmal1 CCT AAT TCT CAG GGC AGC AGA T TCC AGT CTT GGC ATC AAT GAG T Clock GTG GTG ACT GCC TAT CCT ACC T AAG GAG GGA AAG TGC TCT GTT G Per1 AGT TCC TGA CCA AGC CTC GTT AG CCT GCC CTC TGC TTG TCA TC Per2 GCC AAG TTT GTG GAG TTC CTG CTT GCA CCT TGA CCA GGT AGG Reverbα AGC TCA ACT CCC TGG CAC TTA C CTT CTC GGA ATG CAT GTT GTT C Eef1α TGC CCC AGG ACA CAG AGA CTT CA AAT TCA ACA CCA GCA GCA A
NPY CTC CGC TCT GCG ACA CTA C GGA AGG GTC TTC AAG CCT TGT
PPARα AAC ATC GAG TGT CGA ATA TGT GG AGC CGA ATA GTT CGC CGA AAG PGC1α AGC CGT GAC CAC TGA CAA CGA G GCT GCA TGG TTC GTG CTA AG
24
2.6 Datenauswertung
2.6.1 Tabellarische Übersicht verwendeter Programme
Tabelle 9: Tabellarische Übersicht verwendeter Software
Name Version Hersteller
Gen5 TM 5 2.0 BioTek Instruments, Inc.
Microsoft Excel Office 365 ProPlus und
Professional Plus 2016
Microsoft Corporation
GraphPad Prism 7.0 GraphPad Software, Inc.
LumiCycle Analysis 2.40 Actimetrics
SoftMax Pro 5.4.5 Molecular Devices
CFX Manager Software 3.0 BioRad
R 3.5.1 und 3.5.2 The R Foundation for
Statistical Computing
JTK_Cycle 3.1 Hughes Lab
Eine vollständige Übersicht der genutzten Geräte sowie Herstellerangaben befindet sich im Anhang (s. Anh. 2).
2.6.2 Auswertung des Versuches zu der Zytotoxizität von Palmitat
Die Auswertung fand über das Programm Gen5 2.0 sowie über Microsoft Excel statt. Von jedem Messwert bei 450 nm und bei 630 nm wurde ein korrigierter Messwert erstellt, indem der durchschnittliche Referenzmesswert subtrahiert wurde. Dafür wurde für jede Palmitatkonzentration aus den dazugehörigen drei Leerwertmessungen mit derselben Palmitatkonzentration ein Mittelwert für die Wellenlängen 450 nm und 630 nm errechnet.
Diese gemittelten Hintergrund-Absorptionen wurden von den Messwerten der Zellproben bei 450 nm und bei 630 nm abgezogen. Von dem korrigierten Messwert bei 450 nm wurde der korrigierte Messwert bei 630 nm als Absorptionsreferenz subtrahiert. Aus diesen errechneten Werten bei 450 nm abzüglich der Absorptionsreferenz verrechnet mit der Hintergrund-Absorption wurde aus jedem Versuchsansatz (n = 5 pro Konzentration) ein Mittelwert errechnet. Die weitere Auswertung sowie Visualisierung der Daten wurde mit GraphPad Prism 7.0 umgesetzt.
25 2.6.3 Analyse der Bmal1::Luc-Oszillationen
Für die Analyse der Versuchsreihen mit einem LumiCycle wurde der betrachtete Messzeitraum beginnend 12 Stunden nach Beginn der Messung genutzt, um anfängliche Temperatur-, Behandlungs- und Lichtartefakte durch die Behandlung zu verringern. Die Rohdaten wurden in Zählungen pro Sekunde (counts per second = CPS) erfasst. Für die Auswertung der Zeitreihen wurden die Probenansätze genutzt, die unbehandelt eine Periode zwischen 22 und 26 Stunden hatten und deren Modellanpassung mit einer gedämpften Sinuskurve einen „goodness of fit“ größer als 80 % hatte. Diese Parameter wurden mit dem Programm LumiCycle Analysis 2.40 bestimmt. Mit Hilfe desselben Programms wurden Datenreihen erstellt, die über den laufenden 24-Stunden-Durchschnitt normalisiert wurden. Die weitere statistische Auswertung sowie die grafische Darstellung erfolgten mit den normalisierten Daten der Versuche des Luminometers unter Verwendung der Programme Microsoft Excel, JTK_Cycle 3.1, GraphPad Prism 7.0 und den Statistikpaketen von R 3.5 (s. 2.6.5).
2.6.3.1 Auswertung der Bmal1::Luc-Oszillationen bei Dosisbehandlung
Für die Auswertung der Rohdaten wurden alle Messwerte (N = 13 oder N = 14) mithilfe eines gleitenden Mittelwertes über 24 Stunden normalisiert. Um die Effekte verschiedener Palmitatkonzentrationen auf die Rhythmik des hypothalamischen Uhrengenes Bmal1 zu untersuchen, wurden die N44-Bmal1-Zellen ab Beendigung der Synchronisation mit verschiedenen Konzentrationen Palmitat (0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM Palmitat) sowie ohne Palmitat inkubiert. Die Einflüsse des Palmitats wurden zunächst durch Betrachtung der grafischen Kurvenverläufe sowie exemplarischer Nullstellenbestimmung zweier Messwochen verglichen. Bei höheren Konzentrationen ab 1,0 mM Palmitat waren teilweise aufgrund starker Dämpfung und entsprechend verminderter Oszillation in einer der beiden exemplarisch analysierten Messwochen weniger als fünf aufeinanderfolgende Nullstellen bestimmbar. Für den Vergleich der Zykluslänge wurden nur Reihen mit eindeutiger zeitlicher Zuordnung von fünf aufeinander folgenden Nullstellen benutzt.
Nachfolgend wurden die Zeitreihen mit dem Modell einer gedämpften Sinusschwingung (Abb. 2) mit GraphPad Prism 7.0 angepasst, welche mit den Randwerten bei der Amplitude < 500 Zählungen/Sekunde, einem Dämpfungsfaktor K > 0,01 1/Stunde und einer Wellenlänge > 20 Stunden berechnet wurden. Dadurch waren Vergleiche hinsichtlich der Kurvencharakteristika (Amplitude, Wellenlänge, Phasenverschiebung, Frequenz,
26 Dämpfung und Dämpfungskonstante K) zwischen den unterschiedlichen Palmitatkonzentrationen möglich. Eine weitere Analyse der Messwertreihen erfolgte mit JTK_Cycle 3.1 und Statistikpaketen aus R 3.5, wodurch ein weiterer Vergleich der Amplitude, der Periodenlänge und der Phasenverschiebung möglich wurde.
Abbildung 2: Model des gedämpften Sinus
Zitiert aus GraphPad Curve Fitting Guide, S. 394 (141).
2.6.3.1.1 Übersicht über Parameter der genutzten Auswertungsprogramme Tabellarisch aufgelistet wurden im Folgenden die Definitionen der genutzten statistischen Parameter und Kurvencharakteristika von GraphPad Prism 7.0 und JTK_Cycle 3.1.
Tabelle 10: Übersicht der statistischen Parameter (GraphPad Prism 7.0)
R2 Bestimmtheitsmaß zwischen 0,0 und 1,0, welche angibt, wie abhängig oder unabhängig X- und Y-Wert voneinander sind
Sy.x Standardabweichung
Tabelle 11: Übersicht der Kurvencharakteristika (GraphPad Prism 7.0)
Y-Einheiten entsprechen in dieser Arbeit Zählungen pro Sekunde. X-Einheiten entsprechen in dieser Arbeit Zeiteinheiten, i.d.R. in Stundenangaben.
Amplitude Höchstes Maximum [Y-Einheiten]
Wellenlänge Benötigte Zeit für einen kompletten Zyklus [X-Einheiten]
Frequenz Zyklen pro Zeiteinheit, reziprok der Wellenlänge [1/X-Einheiten]
Phasenverschiebung Erster Zeitpunkt, zu dem Y = 0 ist [X-Einheiten]
Dämpfung Zeitpunkt, an dem sich die maximale Amplitude halbiert hat [X-Enheiten]
K Dämpfungskonstante [1/X-Einheiten]
Tabelle 12: Übersicht der statistischen Parameter (JTK_Cycle 3.1)
BH.Q Benjamini-Hochberg q-Wert für rhythmische Oszillation ADJ.P Angepasster p-Wert für rhythmische Oszillation
27 Tabelle 13: Übersicht der Kurvencharakteristika (JTK_Cycle 3.1)
AMP root mean square (RMS) amplitude [Y-Einheiten]
PER Berechnung einer gemittelten Periode [X-Einheiten]
LAG Erstes Maximum [X-Einheiten]
2.6.3.1.2 Darstellung der Kurvencharakteristika
Die Phasenangaben des Programms JTK_Cycle 3.1 lagen überwiegend bei sehr geringen Stundenangaben (0 – 3 Stunden). Zudem gab es wenige Ergebnisse, welche als Zeitpunkt des ersten Expressionsmaximums Stundenwerte von 22 bis 24 Stunden hatten. Die Betrachtung der Kurven zeigte, dass in diesen Fällen das vorherige Maximum unmittelbar vor dem Zeitraum der Auswertung ab 12 Stunden nach Messbeginn lag. Um die Stundenangabe auf dasselbe Maximum der gesamten Datenaufzeichnung zu beziehen und eine sinnvolle Mittelwert-Betrachtung zu ermöglichen, wurden die Phasenwerte über 20 Stunden korrigiert. Als Korrektur wurde die entsprechende Periodenlänge der jeweiligen Zeitreihe von der Phasenangabe subtrahiert. Dadurch lagen die überarbeiteten Phasenzeitpunkte ohne Ausreißer innerhalb weniger Stunden und bezogen sich auf dasselbe Maximum.
2.6.3.2 Analyse der Bmal1:Luc-Oszillationen bei Phasenbehandlung
Die Phasenbehandlung wurde in vier verschiedene Sektoren einer Sinuskurve eingeteilt (0-90 °, 90-180 °, 180-270 °, 270-360 °), um eine Reproduzierbarkeit der zellbasierten Phasenbehandlungen zu ermöglichen. Die Messreihen wurden über einen laufenden Mittelwert über 24 Stunden normalisiert. Die Originalkurven wurden grafisch betrachtet.
Des Weiteren folgte die Messwertauswertung ab dem Zeitpunkt der Phasenbehandlung anhand zweier verschiedener Ansätze: Die Berechnung von Kurvenparametern wurde mit Anpassungen an Modellkurven von JTK_Cycle 3.1 und GraphPad Prism 7.0 durchgeführt (s. a. 2.6.3 Analyse der Bmal1:Luc-Oszillationen).
2.6.4 Auswertung der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR)
Für die Datenanalyse der qPCR-Messwerte wurde die CFX Manager Software genutzt. Bei der Auswertung der Daten wurden Detektionsschwellenwerte (Threshold Cycle, CT-Wert) anhand der Schmelzkurven (0,5 °C/s Erhitzen auf 90 °C) unterhalb des 40. Zyklus als produktspezifisch gewertet, CT-Werte über 40 wurden als unspezifisch und dadurch als nicht-exprimiert gewertet.
28 Die relative Konzentration wurde anhand der ΔΔCT-Methode (Ratio = 2 –ΔΔCT) berechnet. Es wurde eine Normalisierung jedes Expressionswertes der Zielgene auf das Referenzgen Eef1α durchgeführt. Sämtliche Daten wurden auf die Durchschnittswerte biologischer Replikate der Kontrollbedingung des Zeitpunktes T0 normalisiert.
Die Analyse der Rhythmizität wurde mit JTK_Cycle 3.1 durchgeführt. Die Rhythmizität bei Zeitreihen wurde aufgrund der geringen Messpunktanzahl entsprechend der Empfehlung der Autoren Hughes et al (142) über einen kurzen Zeitraum eines zirkadianen Systems anhand einer Analyse der biologischen Replikate derselben Bedingung berechnet.
2.6.5 Statistik
Die Bearbeitung der Messwerte wurde mit Microsoft Excel und LumiCycle Analysis 2.40 durchgeführt. Die Zeitreihen des LumiCycles wurden zusätzlich zu den normalisierten Originalkurven mit dem Modell eines nichtlinearen gedämpften Sinus (Programm GraphPad Prism 7.0) bearbeitet. Zur statistischen Auswertung der Rhythmik von Genexpressionen bei Zeitreihen sowie der Sinusmodelle wurden die Programme JTK_Cycle 3.1 und weitere Programme aus der Statistik-Umgebung R 3.5 (s. u.) genutzt. Mit JTK_Cycle 3.1 wurde die Wahrscheinlichkeit der Richtigkeit der Nullhypothese mit dem p-Wert angegeben.
Bei einer Grundgesamtheit von weniger als 20 Werten konnte aufgrund der kleinen Fallzahl keine Normalverteilung vorausgesetzt werden. Es wurden daher Rang-Statistikverfahren für nicht parametrische Testverfahren angewandt. Aus der Statistik-Umgebung R 3.5 wurden die Pakete „Nonparametric Analysis of Longitudinal Data in Factorial Experiments“ (nparLD) verwendet (143). Vor der Verwendung der Module mit den Untersuchungsdaten wurden die mitgelieferten Testdaten der Autoren berechnet, um die korrekte Installation und Anwendung zu überprüfen. Für einen gezielten Vergleich von zwei Gruppen zu einem Zeitpunkt wurde der in diesem Paket enthaltene „Two-sample-Rank-Test“ genutzt. Für Vergleiche des Einflusses von unterschiedlichen Palmitat-Dosen über mehrere Zeitpunkte hinweg wurde mit dem „LD-F1-Design“ von nparLD gearbeitet. Von den hiermit berechneten Ergebnissen wurden die der Varianzanalyse („analysis of variance“, ANOVA) weiterverwendet. In den Tabellen mit Ergebnissen der Rang- und relativen Effekte wurden die Ergebnisordnungen farblich gekennzeichnet (höchster Wert grün, kleinster Wert rot).
29 Für den Vergleich der Mittelwerte von mehr als zwei Gruppen bei einer Grundgesamtheit
≥ 20 wurde eine 2-Weg-ANOVA mit GraphPad Prism 7.0 durchgeführt, unter der Annahme, dass die Daten normalverteilt waren, die Fehler unabhängig waren sowie eine Homogenität der Varianz vorlag. Anschließend wurde bei einer Grundgesamtheit N ≥ 20 der Bonferroni-Posttest durchgeführt.
Die Statistik wurde in dieser Arbeit deskriptiv dokumentiert. Dementsprechend wurde keine Grenze für eine „signifikante“ Interpretation gewählt. Stattdessen wurden die konkreten p-Werte als Wahrscheinlichkeitsmaß für die Annahme der H1-Hypothese angegeben. Im Fließtext wurden p-Werte ≤ 0,05 erwähnt, der Vollständigkeit halber wurden sämtliche p-Werte eines Tests tabellarisch ergänzt. Die Abbildungen sowie die dazugehörigen tabellarischen Statistiken wurden zusammen interpretiert, allerdings wurde von einer grafischen Darstellung der Wahrscheinlichkeiten in den Abbildungen bei Versuchen mit N < 20 zugunsten des einheitlich Deskriptiven abgesehen.
2.7 Material
2.7.1 Reagenzien und Lösungen
Tabelle 14: Zellkulturmedien und -zusätze
Produkt Ausgangskonzentration Firma Katalognummer
DMEM, high-glucose,
4500 mg/L Glucose Gibco 31053028
FBS Gibco 10500064
Trypsin-EDTA 0,05 % Gibco 25300062
B-27 Supplement 50x konzentriert Gibco 17504044
Stable Glutamine 200 mM PAA M11-006
HEPES 10 mM Thermo Fisher Scientific 15630056
Natriumcarbonat 352,5 µg/mL Roth P028.1
Natriumpalmitat > 98 % Sigma-Aldrich P9767
Albumin Fraktion V > 98 % Roth 8076
30 Tabelle 15: Reagenzien der molekularbiologischen Methoden
Produkt Firma Katalognummer
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002
2.7.2 Kits
Tabelle 16: Verwendete Kits
Produkt Firma Katalognummer
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
Applied Biosystems 4368814
Cell Proliferation Kit (XTT based)
Biological Industries 203001000
2.7.3 Spezielles Arbeitsmaterial
Tabelle 17: Spezielles Arbeitsmaterial
Produkt Firma Katalognummer
Filtropur S 0,45 Sarstedt 83.1826
Filtropus S 0,2 Sarstedt 83.1826.001
31
3 Ergebnisse
3.1 Kurzfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in nicht synchronisierten N44-Zellen
In nicht synchronisierten N44-Zellen wurde der Einfluss von 2,0 mM Palmitat auf die Expression verschiedener Uhrengene und Zielgene über den Zeitraum von 2 Stunden untersucht. Die Zeit der Inkubation beeinflusste die Expression von Bmal1 mit dem p-Wert 8,15*10-13. Die Palmitatdosis der Inkubation (0,0 mM vs. 1,0 mM) beeinflusste die Expression von Clock mit dem p-Wert 1,01*10-2. Die Interaktion zwischen Palmitat-Dosis und der Zeit erfolgte mit dem p-Wert 1,32*10-2 (s. Anh. 3). Die grafische Darstellung zeigte, dass diese Interaktion nach 0,0, 0,5 und 2,0 Stunden Inkubationszeit zu einer erhöhten Expression von Clock unter Palmitat führte (Abb. 3).
Die Expression von Per1 änderte sich über die Zeit mit dem p-Wert 2,00*10-2. Die Expression von Per2 änderte sich über die Zeit mit dem p-Wert 3,38*10-7. Die Interaktion zwischen Palmitatdosis und Inkubationszeit wirkte sich bezüglich der Expression von Per2 mit dem p-Wert 1,00*10-2 aus (s. Anh. 3). Die grafische Darstellung zeigte eine erhöhte Expression nach 2 Stunden Inkubationszeit durch Palmitat gegenüber dem Ansatz ohne Palmitat. Reverbα zeigte über die Inkubationszeit unterschiedliche Expressionsmengen, der p-Wert betrug 1,47*10-4 (Abb. 3).
Die Genexpression von PGC1α zeigte über die Inkubationszeit Unterschiede mit dem p-Wert 5,23*10-5. Die Expression von PPARα zeigte über die Inkubationszeit Unterschiede mit dem p-Wert 2,15*10-3. Die grafische Betrachtung zeigte unter beiden Bedingungen einen Anstieg der Genexpression von PCG1α und PPARα 2 Stunden nach Medienwechsel.
Neuropeptid Y (NPY) zeigte mit dem p-Wert 3,04*10-3 einen Unterschied zwischen den Inkubationsbedingungen. In der Auswertung von NPY betrug die Messwertanzahl zwischen 1 und 3, da manche Messwerte einen CT-Wert > 40 hatten und damit als unspezifisch von der Auswertung ausgeschlossen wurden (s. Anh. 4, Abb. 4).
32 Abbildung 3: Expression verschiedener Uhrengene in unsynchronisierten N44-Zellen zweistündiger Inkubation mit und ohne Palmitat
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mM zum ZeitpunktT0 normalisiert. Die nicht synchronisierten Zellen wurden nach 0,0, 0,5, 1,0, 2,0Stunden Inkubationszeit mit 2,0mM Palmitat geerntet (N=3). Alle Werte sind als Mittelwerte±Standardfehler dargestellt.
33 Abbildung 4: Expression verschiedener Zielgene in unsynchronisierten N44-Zellen während zweistündiger Inkubation mit und ohne Palmitat
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mM zum ZeitpunktT0 normalisiert. Die nicht synchronisierten Zellen wurden nach0,0,0,5,1,0 und 2,0Stunden Inkubationszeit mit 2,0mM Palmitat geerntet (N=1-3). Alle Werte sind als Mittelwerte±Standardfehler dargestellt.
Die Expression derselben Uhren- und Zielgene wurde unter gleichen Versuchsbedingungen über einen Zeitraum von 8 Stunden untersucht. Die Palmitatdosis der Inkubation (0,0 mM vs. 1,0 mM) beeinflusste die Expression von Bmal1 mit dem p-Wert 1,76*10-2. Die Zeit der Inkubation beeinflusste die Expression von Bmal1 mit dem p-Wert 7,51*10-68, grafisch zeigte sich über die untersuchten 8 Stunden nach Mediumwechsel ein Expressionsanstieg, welcher unter Palmitatinkubation verglichen mit den Ansätzen ohne Palmitat nach 8 Stunden verstärkt war. Die Expression von Clock zeigte in diesem Versuch keine wahrscheinlichen Tendenzen mit p-Werten unter 0,05 (s. Anh. 5).
Die Palmitatdosis der Inkubation beeinflusste die Expression von Per1 mit dem p-Wert 2,29*10-2. Die Expression von Per1 änderte sich über die Zeit mit dem p-Wert 2,67*10-24. Die Expression von Per2 änderte sich durch die Dosis des Palmitats mit dem p-Wert 3,86*10-3 und über die Zeit mit dem p-Wert 6,03*10-25. Reverbα zeigte durch die Dosis Unterschiede mit dem p-Wert 8,18*10-9 und über die Inkubationszeit mit dem p-Wert 6,78*10-34. Die Interaktion zwischen Palmitatdosis und Inkubationszeit wirkte sich bezüglich der Expression von Reverbα mit dem p-Wert 4,14*10-3 aus (s. Anh. 5). Die
34 grafische Darstellung zeigte eine geringere Abnahme der Genexpression innerhalb der 8 Stunden Inkubationszeit durch Palmitat entgegen dem Ansatz ohne Palmitat (Abb. 5).
Abbildung 5: Expression verschiedener Uhrengene in unsynchronisierten N44-Zellen während achtstündiger Inkubation mit und ohne Palmitat
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mM zum Zeitpunkt T0normalisiert. Die nicht synchronisierten Zellen wurden nach 0,0,2,0,4,0 und8,0Stunden Inkubationszeit mit 2,0mM Palmitat geerntet (N=3). Alle Werte sind als Mittelwerte±Standardfehler dargestellt.
Die Expression von PGC1α wurde durch die Palmitatdosis mit dem p-Wert 8,43*10-21 beeinflusst. Die mRNA wurde nach 8 Stunden im Ansatz mit Palmitat ca. 2,5fach höher exprimiert als im Kontrollansatz. Die Zeit der Palmitatinkubation beeinflusste die Expression von PGC1α mit dem p-Wert 3,49*10-26 (s. Anh. 6), grafisch zeigte sich über die untersuchten 8 Stunden nach Mediumwechsel zunächst ein Expressionsanstieg, welcher unter Palmitatinkubation verglichen mit den Ansätzen ohne Palmitat zunehmend verstärkt
35 war (Abb. 4). Die Genexpression von NPY ließ sich statistisch nicht auswerten, da die Messwertanzahl in dieser Auswertung 0 bis 3 betrug. Manche Messwerte hatten einen CT-Wert > 40 und wurden damit als unspezifisch von der Auswertung ausgeschlossen.
Aufgrund einer großen Varianz zwischen biologischen Replikaten sowie der hohen CT-Werte war die Aussagekraft über die Genexpression von NPY deutlich eingeschränkt und wurde in diesem Versuch ausschließlich grafisch (Abb. 6) dargestellt.
Abbildung 6: Expression verschiedener Zielgene in unsynchronisierten N44-Zellen während achtstündiger Inkubation mit und ohne Palmitat
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mM
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mM