2.6.1 Tabellarische Übersicht verwendeter Programme
Tabelle 9: Tabellarische Übersicht verwendeter Software
Name Version Hersteller
Gen5 TM 5 2.0 BioTek Instruments, Inc.
Microsoft Excel Office 365 ProPlus und
Professional Plus 2016
Microsoft Corporation
GraphPad Prism 7.0 GraphPad Software, Inc.
LumiCycle Analysis 2.40 Actimetrics
SoftMax Pro 5.4.5 Molecular Devices
CFX Manager Software 3.0 BioRad
R 3.5.1 und 3.5.2 The R Foundation for
Statistical Computing
JTK_Cycle 3.1 Hughes Lab
Eine vollständige Übersicht der genutzten Geräte sowie Herstellerangaben befindet sich im Anhang (s. Anh. 2).
2.6.2 Auswertung des Versuches zu der Zytotoxizität von Palmitat
Die Auswertung fand über das Programm Gen5 2.0 sowie über Microsoft Excel statt. Von jedem Messwert bei 450 nm und bei 630 nm wurde ein korrigierter Messwert erstellt, indem der durchschnittliche Referenzmesswert subtrahiert wurde. Dafür wurde für jede Palmitatkonzentration aus den dazugehörigen drei Leerwertmessungen mit derselben Palmitatkonzentration ein Mittelwert für die Wellenlängen 450 nm und 630 nm errechnet.
Diese gemittelten Hintergrund-Absorptionen wurden von den Messwerten der Zellproben bei 450 nm und bei 630 nm abgezogen. Von dem korrigierten Messwert bei 450 nm wurde der korrigierte Messwert bei 630 nm als Absorptionsreferenz subtrahiert. Aus diesen errechneten Werten bei 450 nm abzüglich der Absorptionsreferenz verrechnet mit der Hintergrund-Absorption wurde aus jedem Versuchsansatz (n = 5 pro Konzentration) ein Mittelwert errechnet. Die weitere Auswertung sowie Visualisierung der Daten wurde mit GraphPad Prism 7.0 umgesetzt.
25 2.6.3 Analyse der Bmal1::Luc-Oszillationen
Für die Analyse der Versuchsreihen mit einem LumiCycle wurde der betrachtete Messzeitraum beginnend 12 Stunden nach Beginn der Messung genutzt, um anfängliche Temperatur-, Behandlungs- und Lichtartefakte durch die Behandlung zu verringern. Die Rohdaten wurden in Zählungen pro Sekunde (counts per second = CPS) erfasst. Für die Auswertung der Zeitreihen wurden die Probenansätze genutzt, die unbehandelt eine Periode zwischen 22 und 26 Stunden hatten und deren Modellanpassung mit einer gedämpften Sinuskurve einen „goodness of fit“ größer als 80 % hatte. Diese Parameter wurden mit dem Programm LumiCycle Analysis 2.40 bestimmt. Mit Hilfe desselben Programms wurden Datenreihen erstellt, die über den laufenden 24-Stunden-Durchschnitt normalisiert wurden. Die weitere statistische Auswertung sowie die grafische Darstellung erfolgten mit den normalisierten Daten der Versuche des Luminometers unter Verwendung der Programme Microsoft Excel, JTK_Cycle 3.1, GraphPad Prism 7.0 und den Statistikpaketen von R 3.5 (s. 2.6.5).
2.6.3.1 Auswertung der Bmal1::Luc-Oszillationen bei Dosisbehandlung
Für die Auswertung der Rohdaten wurden alle Messwerte (N = 13 oder N = 14) mithilfe eines gleitenden Mittelwertes über 24 Stunden normalisiert. Um die Effekte verschiedener Palmitatkonzentrationen auf die Rhythmik des hypothalamischen Uhrengenes Bmal1 zu untersuchen, wurden die N44-Bmal1-Zellen ab Beendigung der Synchronisation mit verschiedenen Konzentrationen Palmitat (0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM Palmitat) sowie ohne Palmitat inkubiert. Die Einflüsse des Palmitats wurden zunächst durch Betrachtung der grafischen Kurvenverläufe sowie exemplarischer Nullstellenbestimmung zweier Messwochen verglichen. Bei höheren Konzentrationen ab 1,0 mM Palmitat waren teilweise aufgrund starker Dämpfung und entsprechend verminderter Oszillation in einer der beiden exemplarisch analysierten Messwochen weniger als fünf aufeinanderfolgende Nullstellen bestimmbar. Für den Vergleich der Zykluslänge wurden nur Reihen mit eindeutiger zeitlicher Zuordnung von fünf aufeinander folgenden Nullstellen benutzt.
Nachfolgend wurden die Zeitreihen mit dem Modell einer gedämpften Sinusschwingung (Abb. 2) mit GraphPad Prism 7.0 angepasst, welche mit den Randwerten bei der Amplitude < 500 Zählungen/Sekunde, einem Dämpfungsfaktor K > 0,01 1/Stunde und einer Wellenlänge > 20 Stunden berechnet wurden. Dadurch waren Vergleiche hinsichtlich der Kurvencharakteristika (Amplitude, Wellenlänge, Phasenverschiebung, Frequenz,
26 Dämpfung und Dämpfungskonstante K) zwischen den unterschiedlichen Palmitatkonzentrationen möglich. Eine weitere Analyse der Messwertreihen erfolgte mit JTK_Cycle 3.1 und Statistikpaketen aus R 3.5, wodurch ein weiterer Vergleich der Amplitude, der Periodenlänge und der Phasenverschiebung möglich wurde.
Abbildung 2: Model des gedämpften Sinus
Zitiert aus GraphPad Curve Fitting Guide, S. 394 (141).
2.6.3.1.1 Übersicht über Parameter der genutzten Auswertungsprogramme Tabellarisch aufgelistet wurden im Folgenden die Definitionen der genutzten statistischen Parameter und Kurvencharakteristika von GraphPad Prism 7.0 und JTK_Cycle 3.1.
Tabelle 10: Übersicht der statistischen Parameter (GraphPad Prism 7.0)
R2 Bestimmtheitsmaß zwischen 0,0 und 1,0, welche angibt, wie abhängig oder unabhängig X- und Y-Wert voneinander sind
Sy.x Standardabweichung
Tabelle 11: Übersicht der Kurvencharakteristika (GraphPad Prism 7.0)
Y-Einheiten entsprechen in dieser Arbeit Zählungen pro Sekunde. X-Einheiten entsprechen in dieser Arbeit Zeiteinheiten, i.d.R. in Stundenangaben.
Amplitude Höchstes Maximum [Y-Einheiten]
Wellenlänge Benötigte Zeit für einen kompletten Zyklus [X-Einheiten]
Frequenz Zyklen pro Zeiteinheit, reziprok der Wellenlänge [1/X-Einheiten]
Phasenverschiebung Erster Zeitpunkt, zu dem Y = 0 ist [X-Einheiten]
Dämpfung Zeitpunkt, an dem sich die maximale Amplitude halbiert hat [X-Enheiten]
K Dämpfungskonstante [1/X-Einheiten]
Tabelle 12: Übersicht der statistischen Parameter (JTK_Cycle 3.1)
BH.Q Benjamini-Hochberg q-Wert für rhythmische Oszillation ADJ.P Angepasster p-Wert für rhythmische Oszillation
27 Tabelle 13: Übersicht der Kurvencharakteristika (JTK_Cycle 3.1)
AMP root mean square (RMS) amplitude [Y-Einheiten]
PER Berechnung einer gemittelten Periode [X-Einheiten]
LAG Erstes Maximum [X-Einheiten]
2.6.3.1.2 Darstellung der Kurvencharakteristika
Die Phasenangaben des Programms JTK_Cycle 3.1 lagen überwiegend bei sehr geringen Stundenangaben (0 – 3 Stunden). Zudem gab es wenige Ergebnisse, welche als Zeitpunkt des ersten Expressionsmaximums Stundenwerte von 22 bis 24 Stunden hatten. Die Betrachtung der Kurven zeigte, dass in diesen Fällen das vorherige Maximum unmittelbar vor dem Zeitraum der Auswertung ab 12 Stunden nach Messbeginn lag. Um die Stundenangabe auf dasselbe Maximum der gesamten Datenaufzeichnung zu beziehen und eine sinnvolle Mittelwert-Betrachtung zu ermöglichen, wurden die Phasenwerte über 20 Stunden korrigiert. Als Korrektur wurde die entsprechende Periodenlänge der jeweiligen Zeitreihe von der Phasenangabe subtrahiert. Dadurch lagen die überarbeiteten Phasenzeitpunkte ohne Ausreißer innerhalb weniger Stunden und bezogen sich auf dasselbe Maximum.
2.6.3.2 Analyse der Bmal1:Luc-Oszillationen bei Phasenbehandlung
Die Phasenbehandlung wurde in vier verschiedene Sektoren einer Sinuskurve eingeteilt (0-90 °, 90-180 °, 180-270 °, 270-360 °), um eine Reproduzierbarkeit der zellbasierten Phasenbehandlungen zu ermöglichen. Die Messreihen wurden über einen laufenden Mittelwert über 24 Stunden normalisiert. Die Originalkurven wurden grafisch betrachtet.
Des Weiteren folgte die Messwertauswertung ab dem Zeitpunkt der Phasenbehandlung anhand zweier verschiedener Ansätze: Die Berechnung von Kurvenparametern wurde mit Anpassungen an Modellkurven von JTK_Cycle 3.1 und GraphPad Prism 7.0 durchgeführt (s. a. 2.6.3 Analyse der Bmal1:Luc-Oszillationen).
2.6.4 Auswertung der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR)
Für die Datenanalyse der qPCR-Messwerte wurde die CFX Manager Software genutzt. Bei der Auswertung der Daten wurden Detektionsschwellenwerte (Threshold Cycle, CT-Wert) anhand der Schmelzkurven (0,5 °C/s Erhitzen auf 90 °C) unterhalb des 40. Zyklus als produktspezifisch gewertet, CT-Werte über 40 wurden als unspezifisch und dadurch als nicht-exprimiert gewertet.
28 Die relative Konzentration wurde anhand der ΔΔCT-Methode (Ratio = 2 –ΔΔCT) berechnet. Es wurde eine Normalisierung jedes Expressionswertes der Zielgene auf das Referenzgen Eef1α durchgeführt. Sämtliche Daten wurden auf die Durchschnittswerte biologischer Replikate der Kontrollbedingung des Zeitpunktes T0 normalisiert.
Die Analyse der Rhythmizität wurde mit JTK_Cycle 3.1 durchgeführt. Die Rhythmizität bei Zeitreihen wurde aufgrund der geringen Messpunktanzahl entsprechend der Empfehlung der Autoren Hughes et al (142) über einen kurzen Zeitraum eines zirkadianen Systems anhand einer Analyse der biologischen Replikate derselben Bedingung berechnet.
2.6.5 Statistik
Die Bearbeitung der Messwerte wurde mit Microsoft Excel und LumiCycle Analysis 2.40 durchgeführt. Die Zeitreihen des LumiCycles wurden zusätzlich zu den normalisierten Originalkurven mit dem Modell eines nichtlinearen gedämpften Sinus (Programm GraphPad Prism 7.0) bearbeitet. Zur statistischen Auswertung der Rhythmik von Genexpressionen bei Zeitreihen sowie der Sinusmodelle wurden die Programme JTK_Cycle 3.1 und weitere Programme aus der Statistik-Umgebung R 3.5 (s. u.) genutzt. Mit JTK_Cycle 3.1 wurde die Wahrscheinlichkeit der Richtigkeit der Nullhypothese mit dem p-Wert angegeben.
Bei einer Grundgesamtheit von weniger als 20 Werten konnte aufgrund der kleinen Fallzahl keine Normalverteilung vorausgesetzt werden. Es wurden daher Rang-Statistikverfahren für nicht parametrische Testverfahren angewandt. Aus der Statistik-Umgebung R 3.5 wurden die Pakete „Nonparametric Analysis of Longitudinal Data in Factorial Experiments“ (nparLD) verwendet (143). Vor der Verwendung der Module mit den Untersuchungsdaten wurden die mitgelieferten Testdaten der Autoren berechnet, um die korrekte Installation und Anwendung zu überprüfen. Für einen gezielten Vergleich von zwei Gruppen zu einem Zeitpunkt wurde der in diesem Paket enthaltene „Two-sample-Rank-Test“ genutzt. Für Vergleiche des Einflusses von unterschiedlichen Palmitat-Dosen über mehrere Zeitpunkte hinweg wurde mit dem „LD-F1-Design“ von nparLD gearbeitet. Von den hiermit berechneten Ergebnissen wurden die der Varianzanalyse („analysis of variance“, ANOVA) weiterverwendet. In den Tabellen mit Ergebnissen der Rang- und relativen Effekte wurden die Ergebnisordnungen farblich gekennzeichnet (höchster Wert grün, kleinster Wert rot).
29 Für den Vergleich der Mittelwerte von mehr als zwei Gruppen bei einer Grundgesamtheit
≥ 20 wurde eine 2-Weg-ANOVA mit GraphPad Prism 7.0 durchgeführt, unter der Annahme, dass die Daten normalverteilt waren, die Fehler unabhängig waren sowie eine Homogenität der Varianz vorlag. Anschließend wurde bei einer Grundgesamtheit N ≥ 20 der Bonferroni-Posttest durchgeführt.
Die Statistik wurde in dieser Arbeit deskriptiv dokumentiert. Dementsprechend wurde keine Grenze für eine „signifikante“ Interpretation gewählt. Stattdessen wurden die konkreten p-Werte als Wahrscheinlichkeitsmaß für die Annahme der H1-Hypothese angegeben. Im Fließtext wurden p-Werte ≤ 0,05 erwähnt, der Vollständigkeit halber wurden sämtliche p-Werte eines Tests tabellarisch ergänzt. Die Abbildungen sowie die dazugehörigen tabellarischen Statistiken wurden zusammen interpretiert, allerdings wurde von einer grafischen Darstellung der Wahrscheinlichkeiten in den Abbildungen bei Versuchen mit N < 20 zugunsten des einheitlich Deskriptiven abgesehen.