Die Rohdaten wurden innerhalb von fünf Versuchswochen gewonnen. Die Betrachtung der Rohdaten zeigte im grafischen Vergleich innerhalb der ersten Messwoche ab 1,0 mM Palmitat eine deutlich zunehmende Dämpfung. Zudem waren Amplitudenunterschiede innerhalb einer Palmitatkonzentration sichtbar. In der zweiten Messwoche wurde eine
40 sichtbar zunehmende Dämpfung ab 1,5 mM Palmitat erkennbar. Zwischen den unterschiedlichen Konzentrationen zeigten sich Amplitudenunterschiede im Vergleich der ersten Maxima. In der dritten Messwoche wurde eine sichtbar zunehmende Dämpfung ab 1,0 mM Palmitat erkennbar. Die Amplitude war im zweiten Maximum in einigen Reihen höher als im ersten Maximum. Die letzten beiden Versuchswochen (Abb. 10) zeigten eine bessere Vergleichbarkeit zwischen einzelnen biologischen Replikaten. Auch in dieser Messwoche wurde die Dämpfung ab 1,0 mM Palmitat deutlich erkennbar. Bei Versuchsansätzen mit der Palmitatkonzentration 0,5 mM wurde eine Amplitudenvergrößerung von dem ersten auf das zweite Maximum sichtbar. In den Kurven mit 2,0 mM Palmitat war die Oszillation trotz wachsender Dämpfung deutlich erkennbar.
Die Betrachtung der Nullstellen von 28 Zeitreihen in den beiden letzten Messwiederholungen zeigte eine Dauer des ersten Zyklus (Differenz zwischen dem Zeitpunkt der ersten und der dritten Nullstelle) von 24 bis 28 Stunden. Der zweite Zyklus (Differenz zwischen dem Zeitpunkt der dritten und fünften Nullstelle) dauerte 20 bis 24 Stunden. Analoge Ermittlung der ersten beiden Zykluslängen in den Messreihen der letzten Messwiederholung ergaben eine Zyklusdauer von 23 bis 27 Stunden für den ersten Zyklus und der zweite Zyklus wies eine Zykluslänge von 20 bis 24 Stunden auf. Die gemittelte Zyklusdauer über die ersten zwei Zyklen betrug 22 bis 25 Stunden. Unterschiede der Zyklusdauer innerhalb der Versuchsansätze einer Palmitatkonzentration waren nicht erkennbar (s. Anh. 13).
Die Kurvendarstellung mit dem Modell einer gedämpften Sinusschwingung zeigte unterschiedliche Abweichungen zwischen Messkurve und Modell (s. Anh. 14). Die Amplitude der Sinuskurve begann meistens mit einer deutlich höheren Amplitude. Dies war besonders ausgeprägt, wenn das zweite Maximum dieselbe oder eine höhere Amplitude als das erste Maximum aufwies. Die Wellenlänge des Modells war zu Beginn der Messkurve sehr ähnlich. Die Wellenlänge der Sinusschwingungen blieb konstant, jedoch zeigte die Messkurve eine Verringerung der Wellenlänge, wodurch eine zunehmende Abweichung zwischen Original und Modell entstand. Die Dämpfung wurde während der letzten Aufzeichnungstage (dritter und vierter Tag) in der Messkurve stärker als in dem ermittelten Modell. Dementsprechend zeigte das Modell am dritten und vierten Tag größere und länger sichtbare Oszillationen. Die Abweichung der Dämpfung zwischen Modell und Messkurve war erhöht, wenn das zweite Maximum eine mindestens gleich hohe Amplitude dem ersten Maximum gegenüber aufwies.
41 Die Qualität der Modellanpassungen mit gedämpften Sinuskurven wurde anhand R2 und der Standardabweichung verglichen. R2 betrug in allen Modellen kontinuierlich über 0,85.
Die Standardabweichung betrug zirka 10 % der jeweiligen Amplitude. Die Standardabweichungen innerhalb einer Messwoche lagen ebenfalls bei zirka 10 %.
(s. Anh. 15a-b).
Die Auswertung der Originalkurven mit JTK_Cycle 3.1 und Paketen aus R 3.5 ergaben folgende Ergebnisse: Im Gruppenvergleich aller getesteten Konzentrationen führten diese mit der Wahrscheinlichkeit des p-Wertes 3,59*10-14 zu einer Beeinflussung der Amplitude.
Mit dem p-Wert 9,19*10-03 wurde die Phase durch verschiedene Palmitatkonzentrationen beeinflusst (s. Anh. 16a). Die Relativen Effekte (RTE) der Amplitude zeigten bei 0,5 mM Pal den größten Effekt, gefolgt von 0,0 mM Pal und daraufhin abnehmende Effekte bei zunehmenden Palmitatkonzentrationen (s. Anh. 16b). Die RTE der Phase hatte den größten Effekt bei 2,0 mM (RTE 0,66). Die Effekte anderer Konzentrationen waren ähnlich (RTE 0,42 – 0,47).
Im Einzelvergleich wurde getestet, ob eine geringe Palmitatkonzentration einen positiven Einfluss auf die Bmal1-Expression hatte. Im Vergleich von 0,0 mM und 0,5 mM gab es keine hohe Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit dieser Hypothese (s. Anh. 17). In einem weiteren Einzelvergleich wurde getestet, ob hohe Palmitatkonzentrationen gegenüber Versuchsansätzen ohne Palmitat eine Beeinflussung der Kurvenparameter analog des Gruppenvergleiches aufwiesen. Der Vergleich von 0,0 mM und 2,0 mM Pal zeigte eine Beeinflussung der Amplitude mit dem p-Wert 1,15*10-15 und eine Phasenbeeinflussung mit dem p-Wert 4,89*10-03 (s. Anh. 18a). Die Betrachtung der relativen Effekte von den Amplituden bestätigte eine deutliche Abnahme der Amplitude unter hohen Palmitatkonzentrationen (s. Anh. 18b). Die Beeinflussung der Phase war bei 2,0 mM Pal höher als bei 0,0 mM Pal (s. Anh. 18b).
Zusammenfassend ergab die Auswertung der Originalkurven anhand der Parameter Amplitude, Phase und Periode eine geringe Amplitudenzunahme bei 0,5 mM Pal, sowie ab 1,0 mM Pal eine zunehmend deutlichere Abnahme der Amplitudenhöhe. Die Phase von 2,0 mM Pal unterschied sich von anderen Behandlungsgruppen. Die Periode zeigte zwischen den Behandlungsgruppen keine Beeinflussung. Zudem bestätigte die Auswertung der Messreihen mit JTK_Cycle 3.1 und Paketen aus R 3.5 circadiane Oszillationen mit p-Werten i.d.R < 10-6 (s. Anh. 19).
42 Abbildung 10: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc-Zellen Dargestellt wurden die exemplarischen Messwerte einer Messwoche mit je 2bis3biologischen Replikaten normalisiert auf einen gleitenden Mittelwert über 24 Stunden.
In der Auswertung von den Modellanpassungen des gedämpften Sinus wurden Amplitude, Dämpfung, Half Life, Wellenlänge, Frequenz und Phasenverschiebung betrachtet. Im Gruppenvergleich aller getesteten Konzentrationen (s. Anh. 20) zeigte sich, dass die Palmitatkonzentration einen Einfluss auf die Amplitude mit der Wahrscheinlichkeit des p-Wertes 5,55*10-08 hatte. Die Dämpfung wurde mit dem p-Wert 4,96*10-06 beeinflusst.
Das Half Life zeigte mit dem p-Wert 4,95*10-06 ebenfalls eine Beeinflussung durch verschiedene Palmitatkonzentrationen. Die Phasenverschiebung zeigte eine analoge Beeinflussung mit dem p-Wert 6,95*10-04. Periode und Frequenz blieben unbeeinflusst.
43 Zusammenfassend zeigten die Kurvenparameter Amplitude, Dämpfung, Half Life und Phasenverschiebung eine Beeinflussung durch verschiedene Palmitatkonzentrationen. Bei diesen Parametern wurden folgend die relativen Effekte betrachtet (s. Anh. 21). Der relative Effekt gab die Rangzahlen der Messwerte eines Kurvenparameters an. Die relativen Effekte von Amplitude und Half Life zeigten jeweils 0,5 mM Palmitat auf dem obersten Rang, gefolgt von 0,0 mM Pal sowie den aufsteigenden Palmitatkonzentrationen ab einschließlich 1,0 mM Palmitat auf den absteigenden Rängen. Die Rangskala der Dämpfung hingegen wurde von der höchsten Palmitatkonzentration (2,0 mM) angeführt und es folgten in abnehmender Palmitatkonzentration die anderen Behandlungsgruppen.
Zusammenfassend führte eine geringe Palmitatkonzentration (0,5 mM) zu einer erhöhten Amplitude und dementsprechend zu einer verstärkten Expression von Bmal1 verglichen mit 0,0 mM Palmitat. Höhere Konzentrationen (ab 1,0 mM) zeigten hingegen eine niedrigere Amplitude und wirkten somit hemmend auf die Genexpression. Die Dämpfung und das Half Life wiesen reziproke Ränge auf, welche jedoch inhaltlich ähnliches bedeuteten: Die Dämpfungskonstante war größer, je höher die Palmitatkonzentration war.
Dadurch wurde der Zeitpunkt der Amplitudenreduktion auf die Hälfte der Ausgangsamplitude (Half Life) eher erreicht und hatte bei zunehmenden Palmitatkonzentrationen abnehmende Zahlenwerte.
Im Einzelvergleich wurde getestet, ob eine geringe Palmitatkonzentration einen positiven Einfluss auf die Bmal1-Expression hatte (s. Anh. 22). Dies wurde bezüglich der Amplitude mit der Wahrscheinlichkeit des p-Wertes 1,99*10-02 gezeigt. Der relative Effekt (RTE) bei 0,5 mM Palmitat war höher als der relative Effekt bei 0,0 mM Palmitat (0,0 mM Pal: RTE 0,42; 0,5 mM Pal: RTE 0,57) (s. Anh. 23). In einem weiteren Einzelvergleich wurde getestet, ob hohe Palmitatkonzentrationen gegenüber Versuchsansätzen ohne Palmitat eine Beeinflussung der Kurvenparameter analog des Gruppenvergleiches aufwiesen (s. Anh. 24). Es zeigte sich in dem Vergleich zwischen 0,0 und 2,0 mM Pal eine Beeinflussung von der Amplitude, der Dämpfung, des Half Life und der Phasenverschiebung. Die Palmitatkonzentration hatte einen Einfluss auf die Amplitude mit der Wahrscheinlichkeit des p-Wertes 5,41*10-08. Die Dämpfung und das hiervon abhängige Half Life wurden mit dem p-Wert 1,69*10-05 beeinflusst. Die Phasenverschiebung zeigte mit dem p-Wert 4,27*10-04 ebenfalls eine Beeinflussung durch verschiedene Palmitatkonzentrationen. Periode und Frequenz blieben unbeeinflusst. Auch die Betrachtung der relativen Effekte bestätigte die im Gruppenvergleich beobachteten
44 Einflüsse (s. Anh. 25): Die Inkubation mit 2,0 mM Palmitat führte zu einer verringerten Amplitude (RTE: 0,0 mM Pal = 0,71 vs. 2,0 mM Pal = 0,29), einer beschleunigten Dämpfung (RTE: 0,0 mM Pal = 0,30 vs. 2,0 mM Pal = 0,70), einem kürzeren Half Life (RTE: 0,0 mM Pal = 0,70 vs. 2,0 mM Pal = 0,70) sowie einer geringeren Phasenverschiebung (RTE: 0,0 mM Pal = 0,64 vs. 2,0 mM Pal = 0,36).
3.6 Konzentrationsabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc-Zellen per Plattenleser
Zunächst wurden drei unterschiedliche Zellkonzentrationen in zwei unterschiedlichen Volumina in einer 96-Mikrotiterplatte ausgesät, um die geeignetsten Rahmenbedingungen für nachfolgende Versuche mit Palmitatinkubation herauszufinden (Abb. 11). Am Vortag ausgesäte Zellen in der Konzentration 2,5 x 103/100 µl zeigten keine rhythmischen Signale.
Das Aussäen der Zellen in der Konzentration 2,5 x 104/100 µl am Vortag zeigte einen stetigen Rhythmus. Die am Vortag in der Konzentration 2,5 x 105/100 µl ausgesäten Zellen zeigte ebenfalls einen stetigen Rhythmus sowie eine deutlich höhere Amplitude als die der geringeren Konzentrationen. Die getesteten unterschiedlichen Gesamtvolumina 100 und 200 ml in den Löchern hatten geringe Auswirkungen auf die Qualität des Signals.
Dadurch wurden in den Folgeversuchen 200 ml Zellsuspension pro Loch pipettiert, um eine möglichst gute Nährstoffversorgung der Zellen über eine mehrtägige Messung zu gewährleisten.
Die Effekte verschiedener Palmitatkonzentrationen (0,0 mM, 1,0 mM und 2,0 mM) auf die Rhythmik des hypothalamischen Uhrengenes Bmal1 wurden per Lumineszenzmessung im Plattenleser gezeigt (N = 24) (Abb. 12). Es wurden Amplitude, Periode und Phase verglichen (Abb. 12b-f). Für die Auswertung wurde der Zeitraum ab 0,25 Tage bis 4,0 Tage Datenaufzeichnung nach Synchronisation gewählt, um eine Beeinflussung anfänglicher Synchronisations-, Licht- und Temperatureffekte zu minimieren.
Die Amplitude des ersten Expressionsmaximums (Abb. 12d) war im Ansatz mit 0,0 mM Pal am höchsten. Verglichen dazu war die Amplitude bei Inkubation mit 1,0 mM Pal tendenziell erniedrigt. Hingegen zeigte die Amplitude bei Inkubation mit 2,0 mM Pal eine deutliche Reduktion, welche verglichen mit den beiden anderen Konzentrationen mit der Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 (2,0 mM Pal vs. 1,0 mM Pal) und p < 0,01 (2,0 mM Pal vs.
0,0 mM Pal) erniedrigt war. Der Vergleich von drei aufeinanderfolgenden Amplitudenhöhen (Abb. 12b) zeigte erneut eine deutliche Differenz zwischen der durchgängig höheren Amplitude im Ansatz ohne Palmitat verglichen mit der deutlich
45 erniedrigten Amplitude bei 2,0 mM Pal. Die reduzierte Amplitude von 1,0 mM Pal war im zweiten Maximum mit der Wahrscheinlichkeit p < 0,05 erniedrigt. Die auf den Mittelwert jeder Bedingung normalisierten Amplituden (Abb. 12c) veranschaulichten, dass die Dämpfung in den Ansätzen mit Palmitat schneller stattfand als in der Vergleichsbedingung ohne Palmitat. Die Periode (Abb. 12e) wurde mit höherer Palmitatkonzentration länger;
der Unterschied zwischen 0,0 und 2,0 mM Pal war mit p < 0,01 wahrscheinlich. Die Phase (Abb. 12f) beschleunigte sich im Ansatz mit 2,0 mM verglichen mit der Kontrollbedingung mit der Wahrscheinlichkeit von p < 0,01.
Abbildung 11: Unterschiedliche Signalstärken von synchronisierten N44-Bmal1::Luc-Zellen
Konzentration 1: 2,5x106/1ml, Konzentration 2: 2,5x105/1ml, Konzentration 3: 2,5x104/1ml. Dargestellt wurden die Messwerte dreierbiologischer Replikate als Mittelwert±Standardfehler normalisiert auf einen gleitenden Mittelwert über 24Stunden.
46 Abbildung 12: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc-Zellen Dargestellt wurden die Mittelwerte ± Standardfehler 24biologischer Replikate. Die Messwerte wurden auf einen gleitenden Mittelwert über 24 Stunden normalisiert. a) Normalisierte Biolumineszenz, b) Amplitudenverlauf über 3 aufeinanderfolgende Maxima, c) Dämpfung, d) Amplitude, e) Periode, f) Phase.
*=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Max = Maximum. Die Daten b) wurden mit einem Zwei-Weg ANOVA und Bonferronis Posttest ausgewertet. Die Daten d) – f) wurden mit einem Ein-Weg ANOVA und Bonferronis Posttest ausgewertet.
3.7 Phasenabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte