In Versuchen anderer Autoren wurden Palmitatkonzentrationen bis 1,0 mM genutzt. Für Versuche in peripheren Zelllinien wie Adipozyten, Myozyten und pankreatischen Zellen wurden häufig Palmitatkonzentrationen zwischen 0,5 und 1,0 mM verwendet (148–155).
In Versuchen mit neuronalen Zelllinien wurden i.d.R. Konzentrationen unter 0,6 mM Palmitat genutzt (89,93,120,138,156).
Außerdem wurden in der Literatur unterschiedliche Methoden zum Lösen von Natriumpalmitat beschrieben (157,158). Weiterhin wurde das Natriumpalmitat meist mit Ethanol und BSA (6,159) oder mit Wasser und BSA (120,138) gelöst. Diese Unterschiede in Lösungsmittelbestandteilen sowie die unterschiedlichen Konzentrationen des BSAs schränken die direkte Vergleichbarkeit ein. Das Review von Alsabeeh et al. 2018 diskutierte Schwierigkeiten in der Vergleichbarkeit von Zellkulturmodellen für die Wirkung von Fettsäuren (160). In Versuchen mit Hirnzellen wurden beispielsweise Verhältnisse freier
55 Fettsäuren zu BSA von 2:1 bis über 10:1 genutzt. Dieses Verhältnis war für die zelluläre Aufnahme von Fett und damit die Toxizität wichtig. Daher vermuteten die Autoren verschiedene Verhältnisse von freien Fettsäuen zu BSA als mögliche Erklärung beobachteter entgegengesetzter Effekte durch Palmitat. Auch der Typ von BSA war relevant für die Wirkung dessen; so unterscheiden sich die 48 unterschiedlichen BSA-Angebote der Firma Sigma-Aldrich® in Reinheit- und Kontaminationsgrad. Zum Lösen der Fettsäuren wurden Ethanol, DMSO und erhitztes Wasser genutzt; wodurch die mögliche Zytotoxizität von Ethanol und DMSO entsprechend finaler Konzentrationsverhältnisse bedacht werden musste. Die genutzten Temperaturen zur Komplexbildung von Fettsäuren und Albumin variierten in durchgeführten Versuchen zwischen 37 °C und 70 °C. Ab 50 °C denaturierte Albumin jedoch zu wasserunlöslichen Aggregaten und veränderte somit erneut das tatsächliche Verhältnis freier Fettsäuren und Albumin. Die Zytotoxizität war abhängig von der Zellart, der freien Fettsäure, dem Verhältnis von freien Fettsäuren zu BSA und der Expositionszeit sowie weiterer bereits aufgeführter Aspekte. Dadurch wurde es relevant, die schädlichen Konzentrationen nach Lösen des Palmitats individuell vor weiteren Versuchen zu untersuchen sowie eine detaillierte und transparente Dokumentation dessen durchzuführen (160).
In dieser Arbeit wurde mit dem Versuch „Zelltoxizität durch Palmitat“ gezeigt, dass Palmitatkonzentrationen bis einschließlich 2,0 mM die metabolische Aktivität der hypothalamischen Zellen steigerten, höhere Palmitatkonzentrationen ab 2,5 mM hingegen zu einer Hemmung führten. Die Steigerung betrug bei 0,5 mM bis 1,5 mM Palmitat unter 5 % und bei 2,0 mM Palmitat 9 % verglichen mit 0,0 mM Palmitat. 2,5 mM Palmitat führte zu einer Hemmung auf 71 % metabolische Aktivität verglichen mit 0,0 mM Palmitat, 3,0 mM Palmitat reduzierten die Aktivität auf 62 % und 3,5 mM Palmitat auf 51 %, Dadurch waren die hemmenden Effekte deutlich ausgeprägter als die Steigerung der metabolischen Aktivität bei geringen Palmitatkonzentrationen. Die Streuung der Messwerte biologischer Replikate betrug zwischen 3 % bei 1,0 mM und 14,6 % bei 2,5 mM Palmitat.
Mayer und Belsham verwendeten 2010 in Versuchen mit mHypoE-N44-Zellen Palmitatkonzentrationen zwischen 0,2 und 1,0 mM. Bei 0,7 mM und 1,0 mM Palmitat beobachteten sie nach 24 Stunden Inkubation mehr als 80 % abgestorbene Zellen aufgrund ihrer veränderten lichtmikroskopischen Zellmorphologie. Bei 0,2 mM Palmitat sahen sie lichtmikroskopisch keine zellmorphologische Beeinflussung. Mayer und Belsham arbeiteten dennoch bei kürzeren Inkubationszeiten von 4 und 8 Stunden auch mit
56 0,7 mM und 1,0 mM Palmitat, ohne toxizitätsabhängige Wirkungen des Palmitats nach diesen Inkubationszeiten auszuschließen. Sie folgerten, dass Neuronen sehr empfindsam auf toxische Effekte des Palmitats reagierten.
Die Überprüfung der Zytotoxizität von Palmitat wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Cell Proliferation Kit (XTT based) durchgeführt. Die Messung beruhte auf der Fähigkeit von metabolisch aktiven Zellen, das Tetrazoliumsalz XTT zu orangefarbigen Formazanverbindungen zu reduzieren. Die Intensität des Farbstoffes war proportional zu der Anzahl metabolisch aktiver Zellen (161). Dies ermöglichte eine objektivierte Beurteilung nach photospektrometrischer Messung. Mayer und Belsham beurteilten hingegen den Zelltod lichtmikroskopisch quantitativ. Für eine Beobachtung einer Aktivitätserhöhung war dieser Ansatz jedoch nicht geeignet. Ob ursächlich für die in dieser Arbeit beobachtete Aktivitätserhöhung eine Anregung des neuronalen Fettstoffwechsels durch Nährstoffaufnahme oder aber bereits eine erhöhte Entgiftungsaktivität ist, bleibt in weiterführenden Versuchen zu untersuchen. Die in dieser Arbeit beobachtete Hemmung der metabolischen Aktivität sowie der von Mayer und Belsham 2010 beobachtete Zelluntergang durch höhere Konzentrationen von Palmitat kann durch Auslösung von ER-Stress erklärt werden (89,138). Mayer und Belsham schlussfolgerten, dass die Zellen mindestens 24 Stunden Inkubation mit Palmitat benötigten, um die neuronale Signalisierung von Insulin zu beeinflussen (138). Fick und ihre Arbeitsgruppe beobachteten 2011 hingegen bereits nach 12 Stunden Inkubationszeit mit 0,3 mM Palmitat Effekte (120).
Dalvi et al. zeigten zellbasiert Effekte von Palmitat nach 4 Stunden Inkubationszeit sowie konzentrationsabhängig auch wachstumsfördernde Effekte von Palmitat (89). In den Versuchen anderer Arbeitsgruppen wurden unterschiedliche Inkubationszeiten genutzt.
Damit gingen sehr unterschiedliche Interpretationen einher, ab welcher Inkubationszeit mit Palmitat dessen Effekte zu registrieren bzw. zu beobachten sind.
Die Zytotoxizität wurde in dieser Arbeit nach 24 Stunden Inkubationszeit gemessen.
Vorherige Versuche anderer Autoren zeigten bei geringeren Inkubationszeiten Palmitat-bedingte Veränderungen (89,120,138). Daher wurde das Zeitfenster der Palmitatinkubation ausreichend lang gewählt, um eine Hemmung des Metabolismus der Zellen durch Palmitat messen zu können.
Für die weiteren Versuche wurden daher Palmitatkonzentrationen bis einschließlich 2,0 mM verwendet. Eine mögliche zytotoxische Wirkung als Ursache für beobachtete Veränderungen konnte bei Palmitatkonzentrationen ≤ 2,0 mM hiermit ausgeschlossen
57 werden, da die Zellen bei diesen Konzentrationen eine erhöhte metabolische Aktivität zeigten. Daher konnten beobachtete Effekte unter Einbeziehung des jeweiligen Versuchsaufbaus auf eine Veränderung des Uhrensystems durch toxizitätsunabhängige Wirkungen von Palmitat bezogen werden.
Die in dieser Arbeit verwendeten Konzentrationen von Palmitat sind verglichen mit denen anderer Versuche mit neuronalen Zelllinien höher, jedoch ist bei der Bewertung dessen die bereits diskutierte limitierte Vergleichbarkeit zu beachten. Der durchgeführte Versuch zeigte, dass Konzentrationen bis einschließlich 2,0 mM Palmitat keine zytotoxische Auswirkung auf die verwendete Zelllinie hatten.