Die Phasenbehandlung erfolgte vor und nach Expressionsmimimum und –maximum. Die Betrachtung der Ergebniskurven (Abb. 13) zeigte eine große grafische Ähnlichkeit der Kurvenverläufe bis zum Behandlungszeitpunkt in den Kurven der Behandlungszeitpunkte
„Vor Maximum“, „Nach Maximum“ und „Vor Minimum“. Die Amplitudenhöhen des Behandlungszeitpunktes „Nach Minimum“ wichen im ersten Minimum zwischen beiden Behandlungsgruppen ab; die folgend mit Palmitat behandelte Gruppe zeigte ein tieferes Minimum.
Deutlich erkennbar ab dem Behandlungszeitpunkt „Nach Minimum“ war eine zeitliche Verschiebung der Extrempunkte beider Behandlungsgruppen. Der Kurvenverlauf mit Palmitatbehandlung zeigte spätere Extrempunkte als die Kontrollgruppe, welche ohne Palmitat behandelt wurde. Auffällig wurde zudem in beiden Behandlungsgruppen ein dem ersten Maximum gegenüber deutlich erhöhtes zweites Maximum, welches dem Behandlungszeitpunkt folgte. Der Behandlungszeitpunkt „Vor Maximum“ hingegen zeigte
47 ab der Behandlung im Kurvenverlauf mit Palmitatbehandlung frühere Extrempunkte als die Kontrollgruppe. Die Amplitudenhöhe war im ersten Maximum nach Behandlung mit Palmitat gegenüber der Kontrollgruppe erhöht. Der Behandlungszeitpunkt „Nach Maximum“ führte zu keinen deutlichen grafischen Veränderungen zwischen beiden Behandlungsgruppen. Der Behandlungszeitpunkt „Vor Minimum“ führte zu einer Erhöhung des dem Behandlungszeitpunkt folgenden Maximums gegenüber dem vorigen Maximum in beiden Behandlungsgruppen. Die Dämpfung wirkte im Verlauf in der Kontrollgruppe stärker als in der mit Palmitat behandelten Gruppe.
Die Sinusanpassungen (s. Anh. 26) erfolgten ab dem Behandlungszeitpunkt. Die Anpassungen waren abhängig des Behandlungszeitpunktes unterschiedlich genau. Die Gesamtanpassung, angegeben in einem zusammenfassenden p-Wert (p summary value), betrug bei allen Modellen < 0,05. Die Modellanpassungen der Behandlungszeitpunkte
„Nach Minimum“ stimmten grafisch sehr genau mit den Kurvenverläufen der Messreihen überein. Die Modellanpassungen der Behandlungszeitpunkte „Vor Maximum“ und „Nach Maximum“ wiesen in ihrer Periode Abweichungen auf. Diese Abweichungen waren in den Behandlungsreihen mit Palmitat verstärkt. Die Amplitudenanpassungen wichen bei Modellanpassungen des Behandlungszeitpunktes „Vor Minimum“ von den Messwertreihen ab; sie waren im Modell deutlich geringer.
Die statistischen Ergebnisse beider Auswertungssysteme (Ergebnisreihen anhand JTK_Cycle 3.1 und gedämpfte Sinusmodelle mit GraphPad Prism 7.0) ließen sich eingeschränkt miteinander vergleichen (s. 2.6.3.1.1. Übersicht über Parameter der genutzten Auswertungsprogramme). Zum einen wurden unterschiedlich viele Kurvenparameter bestimmt. Zum anderen wurden selbst identisch bezeichnete Parameter, wie beispielsweise die Amplitude in den genutzten Programmen unterschiedlich definiert.
Daher konnten die Ergebnisse nur eingeschränkt miteinander verglichen werden.
Sämtliche Parameter, welche sich mit p-Werten < 0,05 innerhalb der Behandlungsgruppen unterschieden, lassen sich dem Anhang 27 entnehmen. Der Anhang 27 zeigte vereinfacht eine Übersicht der verschiedenen Kurvenparameter.
48 Abbildung 13: Einteilung in vier Behandlungssektoren und Übersicht über Behandlungsphasen
a) - b) Modell der Behandlung vor Maximum zw 0–90°, Behandlung nach Maximum zw 90–180°, Behandlung vor Minimum zw 180–270°, Behandlung nach Minimum zw 270-360°. Der Zeitpunkt einer Behandlung wurde möglichst nah an dem dazugehörigen Extrempunkt innerhalb des Behandlungssektors gewählt. Die Zahlen in der Kurve b) kennzeichnen die Behandlungszeitpunkte. Dargestellt ist eine repräsentative Biolumineszenzmessung mit 0,0mMPal.
c) – f): Repräsentative Behandlung nach Minimum zw 270-360° (c), vor Maximum zw 0–90° (d), nach Maximum zw 90–180° (e) und vor Minimum zw 180–270° (f). Farbiger senkrechter Strich markiert den jeweiligen Behandlungszeitpunkt (N=5–6). Dargestellt sind Mittelwerte±Standardfehler.
In den folgenden Tabellen im Anhang (s. Anh. 28 – 34) sind die konkreten Wahrscheinlichkeiten sowie die relativen Effekte der statistischen Auswertung aufgeführt.
Trotz der eingeschränkten Vergleichbarkeit verschiedener Auswertungswege zeigte sich bezüglich der Periode eine einheitliche Beeinflussung durch Palmitat innerhalb der
49 Auswertungsmethoden. Durch Betrachtung der Originalkurven und ihre Auswertung mit JTK_Cycle 3.1 zeigte sich zum Behandlungszeitpunkt nach dem Minimum eine Periodenverlängerung der mit Palmitat-behandelten Gruppe. Die Phasenbehandlung vor dem Maximum führte über alle drei Auswertungswege zu einer Periodenverkürzung der mit Palmitat behandelten Gruppe. Die Amplitude zeigte sich sowohl in den Grafiken wie auch bei der statistischen Auswertung der Sinuskurven in der Behandlungsgruppe mit Palmitat erhöht. Die Phasenbehandlung nach dem Maximum führte (anhand der Auswertung der Originalkurven mit JTK_Cycle 3.1 sowie den Sinuskurven ersichtlich) zu einer Verlängerung der Periode in der Behandlungsgruppe mit Palmitat. Zusammenfassend zeigten die verschiedenen Auswertungsmethoden insbesondere eine Beeinflussung der Periode durch Phasenbehandlungen mit Palmitat. Diese zeigte sich sowohl in einer Verkürzung der Periode sowie in einer Verlängerung der Periode durch Palmitatbehandlung.
3.8 Langfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen
In synchronisierten N44-Zellen wurde der Einfluss von 1,0 mM Palmitat auf die Expression verschiedener Uhrengene und Zielgene über den Zeitraum von 18 Stunden beginnend 12 Stunden nach Beendigung der Synchronisation untersucht. Bmal1 und Clock zeigten einen deutlichen Tagesrhythmus mit einem Expressionsmaximum bei 20 Stunden und einem Minimum bei 8 Stunden nach Beginn des Zeitprofils (Abb. 14). Bmal1 war mit dem p-Wert 2,27*10-6 bei Inkubation ohne Palmitat und mit dem p-Wert 8,70*10-9 bei Inkubation mit Palmitat rhythmisch (s. Anh. 35). Die Ryhthmizität von Clock verstärkte sich bei der Inkubation mit Palmitat (p-Wert bei Inkubation mit 0,0 mM Pal = 3,40*10-2, p-Wert bei Inkubation mit 0,0 mM Pal = 7,80*10-6) (s. Anh. 35). Die Zeit der Palmitatinkubation beeinflusste die Expression von Bmal1 mit dem p-Wert 2,50*10-29 (s. Anh 36). Die Interaktion zwischen Palmitat-Dosis und der Zeit erfolgte mit dem p-Wert 3,21*10-2. Die grafische Darstellung zeigte, dass diese Interaktion zu einer erhöhten maximalen Expression von Bmal1 unter Palmitat führte. Die Dosis beeinflusste die Expression von Clock mit dem p-Wert 1,03*10-2. Die Zeit beeinflusste die Expression von Clock mit dem p-Wert 1,76*10-9. Die Interaktion zwischen Palmitat-Dosis und der Zeit erfolgte mit dem p-Wert 1,06*10-2. Die grafische Darstellung zeigte, dass diese Interaktion zu einer erniedrigten minimalen Expression von Clock unter Palmitat (Zeitpunkt 8 Stunden) und zu
50 einer erhöhten maximalen Expression von Clock unter Palmitat führte (Zeitpunkt 20 Stunden). Über die gesamte Zeitreihe betrachtet wurde die zirkadiane Expression von Clock durch Palmitat verstärkt; es zeigten sich unter Palmitatinkubation niedrigere Expressionen in der ersten zirkadianen Hälfte (Zeitpunkte 4, 8, 12 Stunden) und erhöhte Expressionen in der zweiten zirkadianen Hälfte (Zeitpunkte 16, 20, 24, 28 Stunden) (s. Anh. 36).
Per2 und Reverbα zeigten beide eine antiphasische Expression verglichen mit Bmal1 und Clock, mit einem Maximum bei 4 Stunden von Reverbα und 8 bis 12 Stunden von Per2 und einem Minimum bei 16 bis 20 Stunden von Reverbα und 24 Stunden von Per2 nach Beginn des Zeitprofils (Abb. 14). Per2 war mit dem p-Wert 1,46*10-10 bei Inkubation ohne Palmitat und mit dem p-Wert 2,78*10-8 bei Inkubation mit Palmitat rhythmisch (s. Anh. 35). Die Ryhthmizität von Reverbα hatte die Wahrscheinlich von p 1,28*10-9 bei der Inkubation ohne Palmitat und von p 1,47*10-6 bei der Inkubation mit Palmitat (s. Anh. 35). Die Zeit beeinflusste die Expression von Reverbα mit dem p-Wert 1,49*10-74 und die Expression von Per2 mit dem p-Wert 3,56*10-46. Die p-Werte der Dosis sowie der Interaktion zwischen Dosis und Zeit waren bei beiden Genen größer als 7,0*10-2. Damit zeigte sich, dass die Inkubation mit 1,0 mM Palmitat gegenüber der Inkubation ohne Palmitat keine Auswirkung auf die Expression der Gene Per2 und Reverba hatte (s. Anh. 36).
Zusammenfassend zeigten Bmal1 und Clock antiphasische Tagesrhythmen zu Per1 und Reverbα, verdeutlicht anhand der p-Werte für die Zeit der Palmitatinkubation (p = < 1,50*10-9 für alle vier Uhrengene), welche deutliche Expressionsunterschiede zu verschiedenen Zeitpunkten wahrscheinlich machten. Unterschiede in der Expression der Uhrengene durch Palmitat zeigten sich in den Genen der positiven Rückkopplungsschleife durch erhöhte Maxima von Bmal1 und Clock sowie einer verstärkten Tagesrhythmik von Clock über alle Zeitpunkte ab dem zweiten Messwert (4 Stunden nach Palmitatinkubation).
51 Abbildung 14: Expression verschiedener Zielgene in synchronisierten N44-Zellen während Palmitatinkubation
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α wurden in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mMT0 normalisiert. Über 28Stunden Inkubation mit 1,0mM Palmitat wurden alle 4 Stunden Zellen geerntet (N=3). Alle Werte sind als Mittelwerte±Standardfehler dargestellt.
PGC1α zeigte einen rhythmischen Tagesverlauf unter beiden Bedingungen (0,0 mM Pal: p = 1,12*10-3, 1,0 mM Pal: p = 3,90*10-3) (s. Anh. 35). Durch die Inkubation mit Palmitat entstand ein Expressionsunterschied mit p = 3,99*10-18 (s. Anh. 37). Dieser Expressionsunterschied zeigte sich grafisch in einer Steigerung der Expression von PGC1α gegenüber der Inkubation ohne Palmitat. Die Zeit beeinflusste die Expression von PGC1α mit p = 2,28*10-5. PPARα zeigte keinen rhythmischen Tagesverlauf bei Inkubation ohne Palmitat. Hingegen war PPARα mit dem p-Wert 5,49*10-4 bei Inkubation mit Palmitat rhythmisch. Die Dosis beeinflusste die Expression von PPARα mit dem p-Wert 3,45*10-3, der Expressionsunterschied zeigte erneut eine Reduktion durch Palmitat. Die Zeit beeinflusste die Expression von PPARα mit dem p-Wert 8,20*10-4. NPY zeigte keinen rhythmischen Verlauf bei Inkubation ohne Palmitat. Hingegen war NPY mit dem p-Wert 9,88*10-5 bei Inkubation mit Palmitat rhythmisch. Die Zeit beeinflusste die Expression von NPY mit dem p-Wert 1,55*10-2. Zusammenfassend zeigte von den untersuchten Zielgenen nur PGC1α ohne Inkubation mit Palmitat eine zirkadiane Rhythmik. Bei Inkubation mit
52 Palmitat zeigten PGC1α, PPARα und NPY eine rhythmische Expression.
Expressionsunterschiede ließen sich auf Dosis oder Zeit, jedoch bei keinem der Gene auf eine wahrscheinliche Interaktion zwischen Inkubationszeit und Palmitatkonzentration zurückführen (s. Abb. 15, Anh. 35, Anh. 37).
Abbildung 15: Expression verschiedener Zielgene in synchronisierten N44-Zellen während Palmitatinkubation
Normalisierte Messwerte auf das Referenzgen Eef1α sind in der Darstellung auf den Durchschnitt Pal 0,0mMT0 normalisiert. Über 28 Stunden Inkubation mit 1,0mM Palmitat wurden alle 4 Stunden Zellen geerntet (N=3). Alle Werte sind als Mittelwerte±Standardfehler dargestellt.
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