2.1.1 Allgemeine Arbeitsbedingungen mit der Zellkultur
Sämtliche Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter einer sterilen Sicherheitswerkbank durchgeführt. Die Materialen waren steril verpackt oder wurden vor Nutzung autoklaviert und mit 70 % Ethanol gesäubert. Die Arbeitsoberflächen wurden vor und nach Benutzung der Werkbank mit 70 % Ethanol gereinigt.
Alle genutzten Flüssigkeiten wurden vor Zugabe auf die Zellen auf 37 °C erwärmt, um die Wachstumsbedingungen der In-vitro-Säugerzellkultur konstant entsprechend der In-vivo-Umgebungsbedingungen zu halten. Diese Temperatur entspricht zudem dem Aktivitätsoptimum des Enzyms Trypsin, welches zum Ablösen der Zellen genutzt wurde.
Während der Nutzung eines Wasserbades wurde durchgehend darauf geachtet, Kontamination durch Berührungen des Deckels mit der Wasseroberfläche zu vermeiden.
2.1.2 Verwendete Zelllinie mHypoE-N44-Bmal1-Luc
Sämtliche zellbasierten Versuche wurden mit einer embryonalen hypothalamischen Neuronen-Zelllinie aus Mäusen (mHypoE-N44) durchgeführt. Diese war klonal und immortalisiert. Die Zellen wurden stabil so mit dem Lentivirus transfiziert, dass eine Luciferase unter dem Promotor von Bmal1 exprimiert wurde (Bmal1-Luc) (100). Die Zelllinie wurde bei 37 °C, 5 % CO2-Gehalt und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert (Inkubator: New Brunswick Galaxy 170 S, Hersteller: Eppendorf Company). Die Zellversuche wurden in der Regel bei 100 % konfluentem Wachstum begonnen, um eine Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Bei einer Abweichung dessen wurde dies explizit im Versuchsaufbau beschrieben.
2.1.3 Auftauen eingefrorener Zellen
Ein Kryoröhrchen mit der entsprechenden Zelllinie und Zellpassage wurde aus dem Stickstofflagertank entnommen und auf Eis zu einer Zellkultur-Arbeitsbank transportiert.
Das Kryoröhrchen wurde bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurde anschließend zügig in eine Zellkulturflasche mit 37 °C warmem Kulturmedium pipettiert (DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S)) und inkubiert. Nach zirka
15 8 Stunden wurden die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen und es wurden 15 ml neues Kulturmedium hinzugegeben.
2.1.4 Kryokonservierung
Für die Kryokonservierung wurde eine Zentrifuge auf 4 °C vorgekühlt. Als Einfriermedium wurde DMEM mit 10 % FBS und 1 % P/S mit 10 % DMSO durchmischt und auf Eis gestellt.
Die Zellen einer 175 cm2-Zellkulturflasche wurden mit 20 ml PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml 0,05 % Trypsin/EDTA für 30 Sekunden inkubiert. Bei sichtbarer Schlierenbildung wurde das Trypsin durch Hinzugabe von 20 ml serumhaltigem Medium inaktiviert und die Zellen durch mehrfaches Pipettieren von der Flaschenoberfläche gelöst.
Die Suspension wurde bei 4 °C und 42 rcf für 5 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und die Zellen im Einfriermedium resuspendiert. Je 1,0 ml der Zellsuspension wurde in ein Einfriergefäß (CryoPure der Firma Sarstedt) pipettiert. Die Kryoröhrchen wurden über mehrere Tage in Isopropanol in einem -80 °C-Gefrierschrank gekühlt, bevor sie zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden.
2.1.5 Teilen der konfluierenden Zellen (Splitting)
Die folgenden Angaben beziehen sich auf das Teilen der Zellen in einer 75 cm2 -Zellkulturflasche. Bei Benutzung anderer Größen wurden die Verhältnisse von PBS, Trypsin-EDTA und Medium an die Oberfläche der Zellkulturflasche angepasst.
Die Zellkulturen wurden gesplittet, sobald die Oberfläche einer Zellkulturflasche zu 70 - 90 % mit einem Monolayer bewachsen war. Aus der Zellkulturflasche wurde das Medium mit einer Glaspipette abgesaugt. Die Zellen wurden mit 10 ml PBS gewaschen.
Danach wurden 2 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in die Zellkulturflasche pipettiert. Nach 30 Sekunden Inkubation wurden 10 ml serumhaltiges Medium hinzugegeben und die Zellen mit mehrfachem Pipettieren von der Oberfläche gelöst. Anschließend wurde die Zelllösung in ein konisches 15 ml-Falconröhrchen überführt. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 200 g zentrifugiert. Das Medium oberhalb des Zellpellets wurde abgesaugt und das Zellpellet in frischem Medium gelöst. Die Resuspension wurde entsprechend der benötigten Konzentration in neuem Medium verdünnt und in sterile Zellkulturflaschen überführt.
16 2.1.6 Zellzählung
Die Zellen wurden mit dem LUNA-Fl Dual Fluorescence Cell Counter (Hersteller: Logos Biosystems) gezählt, bei dem jeweils 10 µl einer Verdünnung von einem Volumenteil Zelllösung zu einem Volumenteil Trypanblau genutzt wurde. Entsprechend der Zellzählung wurde die berechnete Menge Zellen verdünnt und in neue Kulturflaschen, Petrischalen oder Mikrotiterplatten überführt. Petrischalen (Durchmesser 35 mm) und Sechs-Loch-Platten wurden mit je 2 ml der Konzentration 5,0 x 105 Zellen/ml besät, um am Folgetag 100 % Konfluenz zu erreichen.
2.1.7 Medien und Bestandteile
2.1.7.1 Zellkulturmedium und Medienzusätze
Als Flüssignährmedium wurde DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 100 µg/ml) genutzt. Bei Aufzeichnungsmedien, welche während der photometrischen Messungen genutzt wurden, wurde DMEM ohne Phenolrot (DMEMw/o) genutzt.
Tabelle 1: Kultivierungsmedium für Zelllinie N44-BL DMEM
1 % Penicillin (100 U/ml) / Streptomycin (100 µg/ml) 10 % FBS
Tabelle 2: Medienzusätze
Reagenz Funktion
B-27 serumfreie Ergänzung für Zellwachstum
BSA Fettsäurentransporter, erhöht Löslichkeit des Palmitats Dexamethason Synchronisation der Zellrhythmen
FBS Rinderserum mit Wachstumsfaktoren
HEPES Puffer
D-Luciferin Substrat der Luciferase
Natriumpalmitat Fettsäure (Hexadecansäure, C16H32O2)
PBS Waschen
Natriumcarbonat Puffer
Stabiles Glutamin Nährmedium, Stickstoffquelle
Trypsin Serinprotease, zur Spaltung von Proteinen
Trypanblau Anionischer Diazofarbstoff, zur Zellzahlbestimmung
2.1.7.2 Ansetzen von 5 % BSA in DMEMw/o
Mithilfe eines Rührfisches wurden 5 % BSA in DMEMw/o gelöst. Die Lösung wurde steril filtriert. Hierfür wurden Filter mit geringer Proteinbindung verwendet: zuerst mit einer
17 Porengröße von 0,45 µm Durchmesser und anschließend von 0,22 µm Durchmesser. Die sterile 5 % BSA/DMEM-Lösung wurde im Kühlschrank bei 4 °C gelagert.
2.1.7.3 Ansetzen der Palmitatlösung
Zum Herstellen einer 100 mM Palmitatlösung wurden 27,8 mg Natriumpalmitat in 1 ml sterilem Wasser bei 60 °C unter regelmäßigem Schwenken gelöst. Steriles 5 % BSA in DMEM wurde auf 41 °C erwärmt. Um eine 5 mM Palmitatkonzentration anzusetzen, wurden 500 µl der flüssigen 100 mM Palmitatlösung in 9,5 ml 5 % BSA/DMEM gelöst (138).
Analog wurden weitere Verdünnungen angesetzt. Nach Ansetzen der Arbeitskonzentrationen wurden diese erneut steril filtriert (Siehe 1.7.2). Die Palmitatlösung wurde bei -80 °C eingefroren und bei -20 °C gelagert.
2.1.8 Synchronisation
Das Uhrensystem der Zellen wurde nach Zugabe von 4 µl 50 µM Dexamethason (entspricht 100 nM Dexamethason in 2 ml Zellmedium) für 2 Stunden synchronisiert. Nach Zugabe des Dexamethasons wurde dieses durch zeitgleiche horizontale Acht-Bewegungen der Zellproben gleichmäßig verteilt. Bei Versuchsansätzen in 96-Loch-Mikrotiterplatten wurde das Dexamethason zuvor in DMEM + GlutaMax gelöst und nach Hinzugabe in die Versuchsansätze (100 nM Dexamethason pro Loch) für 2 Stunden synchronisiert.
Alternativ wurde die Synchronisation mit Rinderserum durchgeführt. Dafür wurden die Zellen 60 Minuten mit 50 % FBS oder 30 Minuten mit 20 % FBS inkubiert. Die Hinzugabe des Serums erfolgte nach Absaugen des alten Kulturmediums sowie eines einmaligen Waschens mit PBS.
Die Synchronisation wurde durch Absaugen des Mediums sowie zweifachen Waschens mit PBS beendet. Wurden verschiedene Synchronisationsvarianten miteinander verglichen, erfolgte der Beginn zeitversetzt und die Synchronisation wurde in den Versuchsansätzen zeitgleich beendet.
2.1.9 Ernten der Zellen
Zum Ernten der Zellen wurde das Medium abgesaugt und ein Waschschritt mit PBS durchgeführt. Danach wurde das PBS restlos abgesaugt. Die Zellplatten oder Petrischalen
18 wurden mit Parafilm zugeklebt und unverzüglich auf Trockeneis gestellt. Die Proben wurden bei -80 °C eingefroren.
2.1.9.1 Ernten der Zellen für anschließende qPCR nach vorheriger Palmitatinkubation
Die Zellen wurden in dem Versuch „Einfluss von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen“ bereits bei einem Wachstum von 60-70 % für 12 Stunden mit 0,3 mM Palmitat oder alternativ mit 0,0 mM Palmitat inkubiert. Danach wurde eine Synchronisation mit 20 % Serum für 30 Minuten durchgeführt. Nach Absaugen des Synchronisationsmediums wurden die Zellen erneut mit 0,3 mM Pal und 0,0 mM Pal inkubiert. Beendigung der Synchronisation repräsentierte hierbei den Messbeginn als Zeitpunkt T0. Die Zellen wurden zu T0 und T18 Stunden nach Beendigung der Synchronisation geerntet.
In dem Versuch „Kurzfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in nicht synchronisierten N44-Zellen“ (s 3.1) wurde ein Mediumwechsel durchgeführt, welcher den Zeitpunkt des Messbeginns (= T0) repräsentierte. Das neue Medium enthielt in einer Versuchsgruppe kein Palmitat (0,0 mM Pal) und in der anderen 2,0 mM Palmitat. Die Zellen wurden in zwei Versuchswiederholungen verschiedener Messzeitpunkte innerhalb der ersten 8 Stunden nach Synchronisation geerntet.
In dem Versuch „Langfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen“ (s. 3.8) wurden die Zellen mit Dexamethason synchronisiert.
12 Stunden nach Beendigung der Synchronisation mit einem Mediumwechsel repräsentiert Zeitpunkt T0. Das neue Medium enthielt in einer Versuchsgruppe 0,0 mM Palmitat und in der anderen 1,0 mM Palmitat. Die Zellen wurden ab T0 über 28 Stunden alle 4 Stunden geerntet.