Institut für Neurobiologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. Henrik Oster
Beeinflussung der zirkadianen Uhr durch die Fettsäure Palmitat
Inauguraldissertation zur
Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck -aus der Sektion Medizin-
vorgelegt von Ruth Merle Brockmann
aus Reinbek
Lübeck 2019
1. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Henrik Oster 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Jens Mittag Tag der mündlichen Prüfung: 11.01.2021
Zum Druck genehmigt, Lübeck den 11.01.2021 Promotionskommission der Sektion Medizin
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Die zirkadiane Uhr ...1
1.1.1 Einführung in die zirkadiane Uhr ...1
1.1.2 Der anatomische Aufbau des zirkadianen Uhrensystems ...1
1.1.3 Die zirkadiane Uhr auf molekularer Ebene ...3
1.1.4 Periphere zirkadiane Uhren ...5
1.2 Der Energie-Metabolismus ...6
1.2.1 Zusammenhang zwischen Metabolismus und zirkadianem System ...6
1.2.1.1 Gesundheitliche Folgen des Konfliktes zwischen verschiedenen exogenen Zeitgebern ...6
1.2.1.2 Entkopplung endogener Uhren durch Nahrungsaufnahme ...7
1.2.1.3 Einfluss des Metabolismus auf das Uhrensystem ...8
1.2.2 Die Appetitregulation ...9
1.2.3 Uhrensystem des mediobasalen Hypothalamus ... 10
1.2.4 Die Wirkungen von Palmitat ... 11
1.3 Die hypothalamische Zelllinie mHypoE-N44 ... 12
1.4 Fragestellung ... 12
2 Methodik ... 14
2.1 Zellkultur ... 14
2.1.1 Allgemeine Arbeitsbedingungen mit der Zellkultur ... 14
2.1.2 Verwendete Zelllinie mHypoE-N44-Bmal1-Luc ... 14
2.1.3 Auftauen eingefrorener Zellen ... 14
2.1.4 Kryokonservierung ... 15
2.1.5 Teilen der konfluierenden Zellen (Splitting) ... 15
2.1.6 Zellzählung ... 16
2.1.7 Medien und Bestandteile ... 16
2.1.7.1 Zellkulturmedium und Medienzusätze ... 16
2.1.7.2 Ansetzen von 5 % BSA in DMEMw/o ... 16
2.1.7.3 Ansetzen der Palmitatlösung ... 17
2.1.8 Synchronisation ... 17
2.1.9 Ernten der Zellen ... 17
2.1.9.1 Ernten der Zellen für anschließende qPCR nach vorheriger Palmitatinkubation ... 18
2.2 Versuch zu der Zytotoxizität von Palmitat ... 18
2.3 Messung der Luciferase-Promoteraktivität im Luminometer ... 19
2.3.1 Dosisbehandlung ... 20
2.3.2 Phasenbehandlung ... 20
2.4 Aufnahme der Rhythmen mit Mikrotiterplatten-Lesegerät ... 20
2.5 Molekulargenetische Methoden ... 21
2.5.1 RNA-Extraktion ... 21
2.5.2 cDNA-Synthese ... 21
2.5.3 Quantitative Echtzeit-PCR... 22
2.6 Datenauswertung ... 24
2.6.1 Tabellarische Übersicht verwendeter Programme ... 24
2.6.2 Auswertung des Versuches zu der Zytotoxizität von Palmitat ... 24
2.6.3 Analyse der Bmal1::Luc-Oszillationen ... 25
2.6.3.1 Auswertung der Bmal1::Luc-Oszillationen bei Dosisbehandlung ... 25
2.6.3.1.1 Übersicht über Parameter der genutzten Auswertungsprogramme ... 26
2.6.3.1.2 Darstellung der Kurvencharakteristika ... 27
2.6.3.2 Analyse der Bmal1:Luc-Oszillationen bei Phasenbehandlung ... 27
2.6.4 Auswertung der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) ... 27
2.6.5 Statistik ... 28
2.7 Material ... 29
2.7.1 Reagenzien und Lösungen ... 29
2.7.2 Kits ... 30
2.7.3 Spezielles Arbeitsmaterial ... 30
3 Ergebnisse ... 31
3.1 Kurzfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in nicht synchronisierten N44-Zellen ... 31
3.2 Einfluss von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen ... 35
3.3 Zelltoxizität durch verschiedene Konzentrationen von Palmitat ... 36
3.4 Synchronisationsmöglichkeiten ... 38
3.5 Konzentrationsabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc- Zellen per LumiCycle ... 39
3.6 Konzentrationsabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc- Zellen per Plattenleser ... 44
3.7 Phasenabhängiger Einfluss von Palmitat auf synchronisierte N44-Bmal1::Luc-Zellen 46 3.8 Langfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44- Zellen ... 49
4 Diskussion ... 53
4.1 Überblick über die Ergebnisse ... 53
4.2 Der statistische Ansatz ... 54
4.3 Zelltoxizität durch Palmitat ... 54
4.4 Synchronisation der Zelllinie mHypoE-N44-Bmal1-Luc ... 57
4.5 Beeinflussung zirkadianer Rhythmizität durch Palmitat ... 58
4.5.1 Dosisabhängige Beeinflussung ... 60
4.5.2 Phasenabhängige Beeinflussung ... 62
4.6 Auswirkungen des Palmitats auf zelluläre Signalwege ... 63
5 Zusammenfassung ... 69
6 Literaturverzeichnis ... 70
7 Anhang ... i
8 Danksagungen ... xxv
9 Lebenslauf ... xxvi
Abkürzungsverzeichnis
AMP Adenosinmonophosphat
ATP Adenosintriphosphat
B 27 Zellkulturmedium-Ergänzung
BL Brain and Muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator – like 1
Bmal1 Brain and Muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator – like 1
Bmal1-Luc Bmal1-Luciferase-Reporterplasmid BMAL1::LUC BMAL1::Luciferase-Fusionsprotein
BSA Rinderserumalbumin
Ccg Clock controlled gene, Uhren-kontrolliertes Gen
cDNA Complementary desoxy-ribonucleis acid, Komplementäre Desoxyribonukleinsäure
Clock Circadian locomotor output cycles kaput Cry1, Cry2 Cryptochrome 1, Chryptochrome 2 DMEM Dulbecco’s modified eagle medium
DMEMw/o Dulbecco’s modified eagle medium without phenol red DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxy-ribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure (DNS) dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
dPBS Dulbecco’s phosphate buffered saline E-Box Element eines DNA-Promoters
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Eef1α Eukaryotic elongation factor 1 alpha FBS Fetales Rinderserum
HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure-Puffer MDH Mediodorsaler Hypothalamus
mRNA Messenger ribonucleid acid, Boten-Ribonukleinsäure Multiscribe RT Multiscribe Reverse Transcriptase
NAD Nikotinamidadenindinukleotid
NPY Neuropeptid Y
N44 Zellreihe mHypoE-N44
Pal Palmitat
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung Per1, Per2 Period 1, Period 2
PGC-1𝛼 Peroxisome proliferator-activated receptor ɣ coactivator 1𝛼 (PPARGC-1𝛼)
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor P/S Penicillin/Streptomycin
RTE Relative treatment effect, relativer Behandlungseffekt
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction, Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
Rev-erbα Reverse erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 𝛼 RHT Retinohypothalmischer Trakt
RORα Retinoic acid-related orphan receptor alpha RMS Root mean square
RT Reverse Transkriptase SCN Nucleus suprachiasmaticus
SEM Standard error of the mean, Standardfehler
TTL Transkriptionell-translationale Rückkopplungsschleife
1
1 Einleitung
1.1 Die zirkadiane Uhr
1.1.1 Einführung in die zirkadiane Uhr
In der fünften Ausgabe von „On The Origin Of Species By Means Of Natural Selection, Or The Preservation Of Favored Races In The Struggle For Life” (Revised Fourth Edition With Changes Shown For Fifth Edition) übernahm Darwin den Ausdruck “survival of the fittest”
(1). Er erkannte die Bedeutung der Anpassung an die Umwelt als Selektionsvorteil. Diese Anpassung betraf die animalischen Zeitpunkte der Jagd und der Ruhezeiten, des Ortswechsels im Meer, an Land und in der Luft, bis hin zum Paarungsverhalten. Ebenso richteten die Pflanzen Wachstumsphasen und Nährstoffaufnahme entsprechend wiederkehrender Rhythmen aus (2). Zahlreiche dieser Rhythmen orientieren sich an einer Periode der Erdrotation um die eigene Achse von 24 Stunden (lat. "circa dies“ = in etwa einen Tag) (2). Die Evolution sorgte für eine Anpassung an wiederkehrende Rhythmen. Für den Menschen ist die Bedeutung der technischen Zeitsynchronisation stetig gewachsen.
Die Menschen haben schon in der Antike versucht, Sonnenwenden, Tag- und Nachtgleiche, Nordrichtung und den geographischen Ort zu bestimmen (3). Die Zeitmessung hat eine lange Geschichte von megalithischen Bauwerken bis hin zur Atomuhr (4). Aber erst mit der Synchronisation von Abläufen durch Zeitsignale sind die globale Gesellschaft, weltweiter Verkehr und Kommunikation möglich, so funktioniert auch die Ortsbestimmung mit dem Global Positioning System (GPS) durch synchronisierte Zeitsignale (5).
Die Periode innerer Uhren von Lebewesen beträgt 24 Stunden und beginnt daraufhin von Neuem. Dieses endogene Uhrensystem wird durch exogene Einflüsse, sogenannte Zeitgeber, synchronisiert. Als wichtigster Zeitgeber dient das Licht. Bei Wirbeltieren werden über den Schlaf-Wach-Rhythmus hinaus zahlreiche weitere Prozesse im Körper, wie beispielsweise Appetitregulation, Sekretion verschiedener Hormone (u. a. Cortisol) sowie die Regulation der Körpertemperatur, zirkadian gesteuert.
1.1.2 Der anatomische Aufbau des zirkadianen Uhrensystems
Der zentrale Schrittmacher von Säugetieren ist der Nucleus suprachiasmaticus (SCN), ein winziger zentraler Taktgeber. Dieser Kern hat einen Durchmesser von nur 8 bis 10 μm und befindet sich bilateral dorsal des Chiasma opticum im anterioren Hypothalamus und beinhaltet in etwa 20.000 Neuronen (6,7). Die Neuronen des Kerns oszillieren autonom (8).
Sie sind über neurochemische Mechanismen miteinander gekoppelt, so dass ihre
2 Oszillationen synchron ablaufen (9). Die Kopplung der Oszillationen funktioniert zum einen mit Hilfe biochemischer Neurotransmitter und zum anderen elektrophysiologisch. Für die enge elektrische Kopplung der Zellen bestehen Zell-Zell-Kanäle (gap junctions) (10,11). Für weitere Wechselwirkungen zwischen den Neuronen des SCN sind die Neurotransmitter vasoaktives intestinales Peptid (VIP), gastrinfreisetzendes Peptid (GRP) und Gamma- Aminobuttersäure (GABA) relevant (12). Zudem sind Kaliumkanäle (sowohl verzögerte Gleichstromkanäle als auch G-Protein-gekoppelte inwärts gerichtete Kanäle) für rhythmische Aktivität wichtig (13). Auch der Einstrom von Ca2+ ist für das Generieren der Rhythmik notwendig (14).
Afferente Informationen erhält der SCN über drei wesentliche Wege: Über den retinohypothalamischen Trakt (RHT), den geniculohypothalamischen Trakt sowie serotonerg über die Raphé-Kerne (15). Der RHT stellt eine direkte Verbindung zwischen der Retina und dem SCN dar. In der Retina exprimieren intrinsische retinale Ganglienzellen (ipRGCs) das photosensitive Molekül Melanopsin und geben die Lichtwahrnehmung über den monosynaptischen retinohypothalamischen Trakt an den SCN weiter (6,16,17). Die Übertragung auf die Neuronen des SCN erfolgt über die Neurotransmitter Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) und Glutamat (18,19).
Die SCN-Neuronen projizieren primär nach kaudal und dorsal in die subparaventrikuläre Zone (SPV), zudem in den dorsomedialen Nucleus des Hypothalamus (DMH) und den paraventriculären Nucleus (PVN) (20,21). Der PVN sezerniert Hormone (z.B. CRH), welche die Hypophyse regulieren (z.B. ACTH) und verknüpft somit die Oszillationen des SCN mit peripheren Oszillationen (22). Auch die Melatonin-Produktion wird zirkadian reguliert.
Tagsüber wird diese in der Epiphyse gehemmt und nachts induziert (23). Melatonin reduziert die Erregbarkeit im ZNS und trägt durch seine inhibitorische Wirkung zur Schlafeinleitung bei. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der SCN auch in das vegetative Nervensystem projiziert und somit die autonomen Funktionen peripherer Organe beeinflusst (24). Zusammenfassend verbindet und synchronisiert der SCN als zentraler Schrittmacher verschiedene zerebrale Bereiche sowie periphere Organe.
Dieses Uhrensystem ist selbsterhaltend und behält seine Periode unter konstanten Bedingungen bei (25). Allerdings können sich die zirkadianen Rhythmen durch exogene Stimuli an äußere Rhythmen adaptieren. Beispielsweise sind sowohl Licht als auch Nahrungsaufnahme solche Zeitgeber (26). Des Weiteren kompensieren die zirkadianen
3 Rhythmen verschiedene physiologische Temperaturen und behalten ihre Periode bei (7,26).
1.1.3 Die zirkadiane Uhr auf molekularer Ebene
Die molekulare Grundlage zirkadianer Oszillationen sind autoregulatorische transkriptionell-translationale Rückkopplungsschleifen (TTLs), welche aus Uhrengenen sowie ihren Proteinen bestehen (s. Abb. 1). Aktivierende Transkriptionsfaktoren fördern die Expression von Genen, deren Produkte die Aktivität der Transkriptionsfaktoren – und damit ihre eigene Produktion - hemmen. Innerhalb jedes zirkadianen Zyklus werden die mRNAs und die Proteine, welche die dynamische Regulation des Uhrensystems bewirken, zunächst produziert sowie daraufhin abgebaut. Von diesen Rückkopplungsschleifen gibt es mehrere, welche teils parallel ineinandergreifen und positiv oder negativ auf die Genexpression der Uhrengene wirken. Der zentrale positive (d. h. aktivierende) Arm besteht aus den Transkriptionsfaktoren Brain and Muscle Arnt-like Protein-1 (BMAL1) und Circadian Locomotor Output Cycles Kaput (CLOCK). Diese Transkriptionsfaktoren enthalten eine Helix-loop-helix-Domäne, mit welcher sie an DNA binden können, sowie eine Per-ARNT-SIM-Domäne (PAS), welche die Heterodimerisierung von BMAL1 und CLOCK erleichtert (27). Der zentrale negative Arm wird gebildet von den Coregulatoren Period (PER1, PER2, PER3) und Cryptochrome (CRY1, CRY2). In der Aktivierungsphase formen BMAL1 und CLOCK Heterodimere, welche an Hexanukleotid-E-Box-Sequenzen der Zielpromotoren binden. Dadurch werden PERs, CRYs sowie weitere Transkriptionsfaktoren exprimiert. PER und CRY bilden ihrerseits Komplexe im Zytoplasma, welche bei höheren Konzentrationen in der Unterdrückungsphase in den Zellkern translozieren. Dort inhibieren sie die von BMAL1/CLOCK-Dimeren aktivierte Transkription und damit ihre eigene Transkription. Die daraus resultierende Reduktion des negativen Schenkels führt nach zirka 24 Stunden zu einer Wiederholung der Aktivierungsphase über BMAL1/CLOCK-Dimere.
Wegen seiner hohen Sequenzhomologie zu CLOCK kann das Neuronal PAS Domain Protein 2 (NPAS2) im SCN mit BMAL1 interagieren und den Rhythmus auch in Abwesenheit von CLOCK aufrechterhalten (28,29). Fehlen jedoch beide heterodimeren Partner von BMAL1, ist kein zirkadianer Rhythmus möglich (30). Die Verzögerung der Translokation des Repressorkomplexes wird posttranslational durch die Caseinkinasen 1 (CK 1) ɛ und δ reguliert, welche die PER-Proteine über Phosphorylierung und Ubiquitinierung abbauen (31,32).
4 Neben der zentralen Rückkopplungsschleife werden durch den Heterodimer BMAL1/CLOCK weitere Transkriptionsfaktoren reguliert, welche als Transkriptionsaktivatoren oder Transkriptonsrepressoren fungieren. Sie beeinflussen die drei Hauptelemente, welche zur rhythmischen Transkription beitragen: E-Boxen, D-Box-Elemente und retinoic acid-related orpha receptor response elements (RORE) (33).
Zudem sind die fakultativen Rückkopplungsschleifen für die Modifizierung der Amplitude und Phase des zirkadianen Genexpressionsrhythmus relevant. Die nukleären Orphan-Rezeptoren Reverse erythroblastic leukemia viral oncogene homolog alpha (REV-ERB𝛼) sowie Retinoic acid-related orphan receptor alpha (ROR𝛼) wirken unter anderem direkt auf die zentrale Rückkopplungsschleife ein. REV-ERB𝛼 und ROR𝛼 können an ROREs binden, welche im Promotor von Bmal1 lokalisiert sind (6). REV-ERB𝛼 inhibiert die Transkription von Bmal1 und kann seinerseits von PER/CRY inhibiert werden. Hingegen induziert ROR𝛼 die Transkription von Bmal1 (33–36).
Der BMAL1/CLOCK-Heterodimer steigert des Weiteren die Transkription der Uhren-kontrollierten Gene (Clock controlled genes; CCG). Diese Uhrenzielgene vermitteln den rhythmischen Einfluss auf physiologische Abläufe (37). Beispielsweise beschleunigt D site albumin promoter binding protein (DBP) durch seine Bindung an verschiedene Promotoren einiger Gene deren Transkription (38,39). DBP beeinflusst so beispielsweise die Enzyminduktion der Cytochrome P450 2A4 (Cyp2a4) und 2A5 (Cyp2a5) in der Leber (40,41).
Durch die genaue zeitliche Abstimmung induzierender und reduzierender Transkriptionsfaktoren des primären TTLs sowie der parallel geschalteten Modifikatoren ist es möglich das zirkadiane System in Abstimmung mit exogenen Zeitgebern stabil aufrecht zu erhalten.
5 Abbildung 1: Das molekulare Uhrensystem
Gezeigt sind die vereinfachten transkriptionell-translationalen Rückkopplungsschleifen des zirkadianen Uhrensystems. Erläuterungen s. Punkt 1.1.3. Enhancer Box (E-Box), ROR/REV-ERB-response element (RORE), Brain and Muscle Arnt-like Protein-1 (BMAL1), Circadian Locomotor Output Cycles Kaput Protein (CLOCK), Cryptochrom-Protein 1/2 (CRY 1/2), Period-Protein 1/2/3 (PER 1/2/3), Retinoic Acid-related Orphan Receptor Alpha (RORα), Reverse erythroblastic leukemia viral oncogene homolog alpha (REV-ERBα), Uhren-kontrollierte Gene (CCGs).
1.1.4 Periphere zirkadiane Uhren
Neben dem zentralen Schrittmacher im Gehirn gibt es in zahlreichen, wenn nicht allen anderen Geweben, ebenfalls Oszillatoren (42,43). Der molekulare Mechanismus ist derselbe wie in dem SCN (44). Insgesamt agieren 43 % aller für Proteine kodierenden Gene irgendwo im Körper rhythmisch (45). Microarray-Studien zeigen an Leber, Herz, Retina und Darm, dass diese Gewebe über 10% ihrer Gene rhythmisch exprimieren (46–49). Die rhythmischen Lebergene kodieren für Enzyme des metabolischen Stoffwechsels sowie der Entgiftung (40). Physiologisch ist eine negativ korrelierte Expression entgegengesetzter biochemischer Prozesse sinnvoll (50,51).
Die Zellen peripherer Gewebe weisen selbstständige, zellautonome Uhren auf, wie mit explantierten Leber-, Muskel und Fettgewebeproben von Mäusen gezeigt wurde (52). Im Gegensatz zu den zentralen Schrittmachern sind periphere Oszillatoren jedoch untereinander nicht eng gekoppelt (53), weswegen der SCN notwendig ist, um die endogenen Rhythmen weniger gekoppelter Zellen eines Gewebes zu synchronisieren.
Als Zeitgeber für die peripheren Organe können neben dem Licht (indirekt über das zentrale Uhrensystem) andere Faktoren eine Rolle spielen. So ist die Nahrungsaufnahme für viele Gewebe ein einflussreicher Zeitgeber (42,54). Beispielsweise führt bei Ratten die
6 Nahrungsaufnahme während ihrer Ruhephase zu einer Entkopplung der Genexpression peripherer Organe von der in dem SCN; hingegen bleibt die Rhythmik des SCN unbeeinflusst (54,55). Besonders schnell nahrungsabhängig beeinflusst werden die Rhythmen metabolisch-aktiver Gewebe wie die der Leber (54).
Die physiologischen Funktionen der peripheren Organe werden zum einen über die zirkadiane Genexpression beeinflusst. Zum anderen verändern periphere Organe ihre Sensitivität für Hormone. Diese doppelte Beeinflussung wurde sowohl für die Wirkung von Insulin (56) als auch für Glucocorticoide gezeigt (57).
1.2 Der Energie-Metabolismus
1.2.1 Zusammenhang zwischen Metabolismus und zirkadianem System
Durch zahlreiche Uhren in den peripheren Geweben (s. 1.1.4) werden viele metabolische Prozesse rhythmisch gesteuert. Der zentrale Taktgeber synchronisiert sein endogenes Uhrensystem primär über den exogenen Lichtrhythmus. Die peripheren Uhrensysteme hingegen werden außer von dem SCN vor allem von der Nahrungsaufnahme beeinflusst, wodurch eine effiziente Nährstoffverwertung ermöglicht wird. Der Metabolismus reagiert auf Nahrungsaufnahme mit der Regulation von transkriptionellen und enzymatischen Aktivitäten. Allerdings können – abhängig von dem Zeitpunkt der Nahrungsausnahme – die peripheren Uhren dadurch von dem SCN entkoppelt werden (54,55).
1.2.1.1 Gesundheitliche Folgen des Konfliktes zwischen verschiedenen exogenen Zeitgebern
In der modernen Gesellschaft, geprägt von einem Tageslicht-unabhängigen Sozialleben sowie etlichen Berufsgruppen mit Schichtarbeiten, entsteht ein Konflikt der Uhrensysteme.
In Industrieländern arbeiten zirka 15 bis 30 % in Schichtarbeit (58,59), beispielsweise bei der Fließbandarbeit innerhalb der Industrie. Die Schichtarbeit führt zu vermehrten nächtlichen Unfällen (60,61), insbesondere im Verkehrswesen (62). Neben den Sicherheitsaspekten werden auch die Zufriedenheit und die Lebensqualität der Schichtarbeiter negativ beeinflusst (63,64). Zudem werden bei Schichtarbeitern vermehrt Erkrankungen nachgewiesen, wie beispielsweise Schlafprobleme (65) sowie eine Erhöhung des kardiovaskulären Risikos (66). Es wurde anhand prospektiver Studien gezeigt, dass Schichtarbeit das Risiko für Übergewicht, metabolisches Syndrom und Glucose-Dysregulation erhöht. Folglich steigt auch die Wahrscheinlichkeit, an Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) zu erkranken (67,68). Die Erkrankungswahrscheinlichkeit für
7 Übergewicht und T2DM korreliert mit der Dauer von Schichtarbeit (68). Über die Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels hinaus zeigten sich auch eine Beeinflussung des Fettstoffwechsels durch erhöhte Triacylglycerid- (TAG) und erniedrigte High-density lipoprotein (HDL)-Werte bei Schichtarbeitern verglichen mit Nicht-Schichtarbeitern (69).
Zusammenfassend gefährdet die Schichtarbeit Gesundheit, Arbeitssicherheit und Lebensqualität, weswegen das Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen des Schichtdienstes aus gesundheitlichen und gesellschaftsökonomischen Aspekten äußerst relevant ist.
1.2.1.2 Entkopplung endogener Uhren durch Nahrungsaufnahme
Die Zeiten der Nahrungsaufnahme sind zwecks evolutionärer Sicherstellung von Nahrung zirkadian reguliert (70). Nachtaktive Tiere nehmen ihre Nahrung nachts und tagaktive Tiere tagsüber auf (54). Komplette Läsionen des SCN führen zu einer Aufhebung der zirkadianen Oszillation von Nahrung- und Wasseraufnahme (71,72). Auch Tierversuche mit dem gezielten Ausschalten der Uhrengene zeigten eine Aufhebung der Nahrungsrhythmen (73–75). Abhängig von der Uhrzeit der Nahrungsaufnahme kann diese zu einer Desynchronisation von endogenen physiologischen Rhythmen sowie dem externen Hell-Dunkel-Rhythmus führen. Hierbei kommt es zu einer Entkopplung der peripheren Organe, während der SCN von der Nahrungsaufnahme unbeeinflusst bleibt (54,55).
Nahrungs-induzierte Phasenverschiebungen der peripheren Uhrensysteme sind in der Leber schneller als in weniger Stoffwechsel-aktiven Geweben zu beobachten (54). In Tierversuchen wurde gezeigt, dass es durch Nahrungsaufnahme während normaler Ruhezeiten zu einer Störung der metabolischen Homöostase kommt (76–79). Dies deckt sich mit der Korrelation zwischen Schichtarbeit und metabolischen Erkrankungen (s. 1.2.1.1).
Die Störung resultiert in erhöhten Konzentrationen von Triglyceriden, Cholesterol, low density lipoproteins (LDL) und high density lipoproteins (HDL) (69,80–82). Zudem wurde teils eine gestörte Glucosetoleranz gemessen (69,83,84). Die Enzymregulationen des Fett- und des Kohlenhydratstoffwechsels wird teilweise zirkadian gesteuert (56,85) und 13 – 17 % der Metabolite des Lipidstoffwechsels zeigen zirkadiane Rhythmen (86,87). Die Veränderung der Fettkonzentrationen führt zu proinflammatorischen Reaktionen, mitochondrialer Dysbalance und Insulinresistenz (88–94). Bei gestörter Glucosetoleranz werden veränderte Glucosetransportmechanismen, veränderte intrazellulären
8 Signalwegen des Insulins und mitochondriale Dysbalance beobachtet (95,96). Des Weiteren wird die Ausschüttung verschiedene Hormone wie Insulin, Leptin, Adiponectin, Neuropeptid Y und Ghrelin durch die Entkopplung des peripheren Uhrensystems verändert (6,95,97–99). Diese Hormone werden von dem Uhrensystem reguliert und beeinflussen ihrerseits das zirkadiane System, wodurch es zu Störungen in der Appetitregulation kommt (6,99,100). Zusammenfassend führt die Entkopplung peripherer Uhren und dem SCN durch Nahrungsaufnahme zu einer hormonellen Veränderung sowie inflammatorischen Reaktionen durch Metabolite vor allem des Lipidstoffwechsels.
1.2.1.3 Einfluss des Metabolismus auf das Uhrensystem
Es gibt eine direkte Verbindung zwischen dem energetischen Zustand einer Zelle und der Uhren-vermittelten Transkription. Der zelluläre energetische Zustand wird u. a. über das Verhältnis von NAD+ zu NADPH, das sog. Redox-Potential, dargestellt. NAD+ ist ein Cofaktor des CLOCK:BMAL1-Heterodimers und beeinflusst dessen Bindung an DNA (101). Des weiteren ist silent mating type information regulation 2 homolog type 1 (SIRT1) eine NAD+-abhängige Decarboxylase, welche ihrerseits die Funktion von CLOCK/BMAL1 beeinflusst und PER2 decarboxyliert (102,103). Auch das Verhältnis von AMP zu ATP beeinflusst das Uhrensystem: Die AMP-aktivierte Protein Kinase (AMPK) kann CRY1-Proteine phosphorylieren und somit die positive Rückkopplungsschleife des zentralen TTLs verstärken (104).
Die nukleären Rezeptoren REV-ERB𝛼 und ROR𝛼 beeinflussen sowohl die Uhrengene (s. 1.1.3) als auch den Metabolismus. In dem Review von Solt et al. 2011 fassen die Autoren die metabolischen Wirkungen von REV-ERB und ROR zusammen. ROR𝛼 reguliert die Enzyme Fettsäuresynthase, Cholesterol-7𝛼-Hydroxylase und Glucose-6-Phosphatase sowie den Transkriptionsfaktor sterol regulatory element-binding protein 1c (strbp-1c). Zudem beeinflusst ROR die Konzentrationen des Plasma-Cholesterols, high density lipoproteins (HDL), verschiedener Apolipoproteine und Triglyzeride. Auch REV-ERB reguliert verschiedene Apolipoproteine sowie verschieden Enzyme der Gallensäurebiosynthese (105). Beide nukleäre Rezeptoren sind somit wichtig für den Lipidstoffwechsel. Zudem wird ROR mit der Von-Gierke-Krankheit und damit dem Kohlenhydratstoffwechsel in Verbindung gebracht (106). Der Coaktivator von nukleären Rezeptoren Peroxisome proliferator-activated receptor ɣ coactivator 1𝛼 (PPARGC-1𝛼 oder auch mit PGC-1𝛼 bezeichnet) ist eine weitere Ebene der metabolischen Regulation. PGC-1𝛼 weist eine
9 zirkadiane Expression auf (107) und reguliert durch Coaktivierung der ROR-Familie nukleärer Rezeptoren die Expression von BMAL1 und REV-ERB𝛼 (108,109). Dieser Coaktivator gilt als wichtige Verbindung zwischen dem zirkadianen Uhrensystem und dem Metabolismus (107). Sowohl in PGC-1𝛼-defizienten Fibroblasten als auch in Mäusen mit einer Leber-spezifischen Deletion von PGC-1𝛼 wurde gezeigt, dass PGC-1𝛼 für eine zell- autonome Uhrenfunktion notwendig ist. Mäuse mit fehlendem PGC-1𝛼 zeigten abnormale Aktivitätsrhythmen, veränderte Körpertemperaturprofile sowie eine Beeinflussung des metabolischen Energiehaushaltes. Die Tiere zeigen zudem veränderte Uhrengenexpression (107).
Auch Peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) sind eine Gruppe von nukleären Rezeptoren, deren Isoformen (𝛼, β/δ, ɣ) rhythmisch exprimiert werden (108). Die PPARs sind wichtige Lipidsensoren, welche sowohl die Nutzung als auch die Speicherung von Lipiden transkriptionell regulieren (110). Sie werden selbst von der zirkadianen Uhr reguliert und beeinflussen diese wiederum ihrerseits (108). PPARɣ ist ein wichtiger Regulator der Adipogenese und wird primär in Fettgewebe exprimiert (108). PPARɣ wird von seinem bereits beschriebenen Coaktivator PGC-1𝛼 reguliert (108). Die Isoform β/δ wird ubiquitär exprimiert (108). PPAR𝛼 wird in Leber, Herz, Nieren und auch zentral in dem Nucleus suprachiasmaticus (SCN) exprimiert (108). PPAR𝛼 beeinflusst die TTLs im Uhrensystem deutlich, indem PPAR𝛼 direkt an PPAR-Antwort-Elemente in der Promotorregion von Bmal1 und Reverb𝛼 bindet (107,108,111). PPAR𝛼 ist zudem ein direktes Zielgen von BMAL1 und CLOCK (108,112). PPAR𝛼 reguliert die zirkadiane Expression von zahlreichen Genen des Lipidstoffwechsels, beispielsweise der Fettsäurensynthase (Fasn) und der HMG-CoA Reduktase (Hmgcr) (108).
1.2.2 Die Appetitregulation
Ein Experiment zeigte, dass Ratten durch Futteraufnahme während ihrer Ruhezeit trotz einer Reduktion der absoluten Menge an Futteraufnahme an Gewicht zunehmen (77). Die Arbeitsgruppe erklärte diese Beobachtung durch eine Änderung der Uhrengene des Hypothalamus wegen des Konfliktes von Nahrungsaufnahme und Schlaf-Wach-Rhythmus.
Diese Beobachtung deutet auf eine Verknüpfung von Appetit und Uhrensystem hin.
Für die Regulation der Nahrungsaufnahme ist der Nucleus arcuatus durch die Expression orexigener (Appetit steigernder) und anorexigener (Appetit hemmender) Peptide wichtig.
Der Nucleus arcuatus ist ein Kern im Hypothalamus, welcher im Tuber cinereum hinter der
10 Eminentia mediana liegt. Über die Expression und Sekretion von orexigenen und anorexigenen Peptiden wird von dem Nucleus arcuatus ausgehend die Nahrungsaufnahme gesteuert. Anorexigene Peptide sind 𝛼-Melanozyten-stimulierendes Hormon (𝛼MSH) und Cocaine- and amphatamine regulated Transcript (CART). Orexigene sind Neuropeptid Y (NPY) und Agouti-related protein (AgRP).
Informationen aus der Peripherie erhält dieser Kern über die Expression von Rezeptoren für metabolische Hormone, wie Leptin, Insulin und Ghrelin (113). Beispielsweise wird Leptin von Adipozyten sezerniert und stimuliert die Expression von Anorexigenen. Ghrelin hingegen wird vom Magen sezerniert und stimuliert die Expression von Orexinen. Auch Glucocorticoide modulieren über die Expression von NPY in dem Nucleus arcuatus die hepatische Insulinsensitivität (114). Die Anorexigene und Orexigene vermitteln ihre Wirkung durch Modulation des vegetativen Nervensystems bis in die peripheren Organe.
Das Neuropeptid Y (NPY) zeigt sowohl periphere wie auch zentrale Beeinflussung: NPY aktiviert beispielsweise sympathische Nerven vom Hypothalamus zur Leber (115,116). In einem Tierversuch wurde gezeigt, dass bei T2DM NPY oszillierend erhöht ist und mit Insulin und Leptin positiv korreliert sowie mit Ghrelin negativ (117). Zudem gibt es über NPY eine direkte Verbindung zu dem SCN (118), wodurch Veränderungen in Form von Phasenverschiebungen von PER2 durch NPY induziert werden können (119). Der bereits beschriebene Zellversuch von Fick et al. 2011 weist mit der Veränderung der mRNA sowohl von Uhrengenen als auch von NPY durch Palmitat eine Schnittstelle der Appetitregulation sowie des zirkadianen Systems auf (120).
Zusammenfassend gibt es zwischen dem Nucleus arcuatus und dem SCN anatomische und funktionale Verbindungen, welche einen reziproken Feedbackmechanismus ermöglichen.
Dadurch werden Informationen aus der Peripherie in den Hypothalamus weitergeleitet und können das zentrale Uhrensystem beeinflussen (121,122).
1.2.3 Uhrensystem des mediobasalen Hypothalamus
Der mediobasale Hypothalamus (MBH) ist eine Ansammlung hypothalamischer Kerne, in welcher auch der Nucleus arcuatus liegt. Diese Hirnregion ist wichtig für die Regulation und Integration von physiologischen Rhythmen; wie dem Schlaf-Wach-Rhythmus sowie dem Rhythmus der Nahrungsaufnahme (123,124). Für Gewebe sowie einzelner Zellen des mediobasalen Hypothalamus (und somit außerhalb des SCNs) wurden autonome Rhythmen nachgewiesen. Diese persistierten in hypothalamischen Gewebeproben aus
11 Ratten über mehrere Tage (125,126). Guilding et al. zeigten 2009, dass insbesondere der Nucleus arcuatus und die Pars compacta Region des dorsomedialen Hypothalamus autonom Uhrengene exprimierten (125).
1.2.4 Die Wirkungen von Palmitat
Palmitinsäure (auch Hexadecansäure genannt) ist eine gesättigte Fettsäure, welche meist in Form von Triglyceriden in tierischen und pflanzlichen Fetten vorkommt (127). Sie ist die häufigste gesättigte Fettsäure in westlicher Ernährung (128). Im Rahmen biochemischer Prozesse wird diese Fettsäure als Depotfett genutzt. In der Lipogenese wird sie als erste Fettsäure gebildet, welche zu weiteren längeren Fettsäuren modifiziert werden kann.
Palmitat weist im Serum tägliche Konzentrationsfluktuationen auf, welche bei Mäusen mit verändertem Clock-Gen (ClockΔ19) sowie Mäusen ohne Bmal1 (Bmal1-/-) erniedrigte Konzentrationen aufwies (129).
Es wurde gezeigt, dass eine Palmitat-reiche Ernährung zu Übergewicht und metabolischem Syndrom in Mäusen führt, sowie deren Aktivitätsrhythmus verändert (76). Bei Menschen mit Diabetes mellitus Typ 2 wurde außer erhöhten Insulin- und C-Peptidkonzentrationen auch eine erhöhte nächtliche und postprandiale Konzentration von Palmitat sowie freien Fettsäuren gemessen (130). Bereits bei übergewichtigen Kindern wurde eine erhöhte Palmitatkonzentration nachgewiesen (128). Die Konzentration der totalen freien Fettsäuren betrugen im Serum bis zu 0,8 mM mit einem Anteil von 25 % Palmitat (92,131,132).
Palmitat-reiche Ernährung führt in Leber- und Fettgewebe von Mäusen zu einer Amplitudenveränderung in der mRNA-Expression von Clock, Bmal1, Per, Reverbα und RORα. Im SCN zeigten sich die mRNA-Expressionen derselben Gene demgegenüber nach 6 Wochen unbeeinflusst (76). In denselben Geweben sowie in Muskelgewebe wurden durch erhöhte Konzentrationen an Palmitat Insulinresistenzen beschrieben (90,91,133). In hoher Konzentration wirkt Palmitat peripher lipotoxisch und proinflammatorisch und führt zu einer vermehrten Expression und Sekretion von Zytokinen und Chemokinen (94,134–
136). Die proinflammatorische Wirkung von Palmitat entsteht unter anderem durch eine Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen in mikrovaskulären Endothelzellen sowie eine Erhöhung von Monozytenadhäsion und Transmigration (92).
Der Einfluss von Palmitat auf den Hypothalamus wird erst seit kürzer Zeit erforscht und derzeit ist noch weniger bekannt. Zunächst berichteten Veröffentlichungen
12 widersprüchlich sowohl über resistente (137) als auch von empfindliche (138) hypothalamische Neuronen gegenüber Palmitat-induzierter Entzündung sowie Insulinresistenz. Die Forschungsgruppe Fick et al. zeigte 2011 anhand der hypothalamischen Zellline mHypoE-44 Einflüsse von Palmitat auf die Expression der Uhrengene Bmal1, Clock, Per2 und Reverbα sowie auf das Neuropeptid Y, welches für die Appetitregulation wichtig ist (s. 1.2.3) (120). In aktuellen Veröffentlichungen wird berichtet, dass Palmitat eine Entzündungsreaktion und mitochondriale Dysfunktion auslöst sowie die Expression von Stressgenen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) erhöht (89,93,139). Des Weiteren wurde mehrfach bestätigt, dass Palmitat zu einer Erhöhung von NPY und einer Insulinresistenz führt (89,93,139). Dalvi et al. berichteten 2016 zudem, dass die schädliche Wirkung von Palmitat im Hypothalamus dennoch zeitabhängig ist, da es ebenso wachstumsfördernd wirkt (89).
1.3 Die hypothalamische Zelllinie mHypoE-N44
Die hypothalamische Zelllinie von Mäusen mHypoE-N44 exprimiert laut Herstellerangabe die Orexigene Agouti-related peptide (AgRP), Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH), eine Ghrelin-Variante sowie den Orexin-Rezeptor 1. Das Anorexigen Neurotensin (NT) wird exprimiert. Des Weiteren werden einige Hormone und Rezeptoren exprimiert, welche für den Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel relevant sind (s. Anh. 1).
Diese Zelllinie zeigte in anderen Versuchen zirkadiane Expressionen der mRNA von den Uhrengenen Bmal1, Per2, Clock und Reverbα (100,120,140). Fick et al. führten Versuche durch, in denen die mRNA der Orexigene Neuropeptid Y (NPY) und Preproghrelin sowie die Anorexigene Neurotensin (NT) und Corticotropin-releasing Hormon (CRH) rhythmisch oszillierten. Agouti-related peptide (AgRP) wurde von dieser Zelllinie exprimiert. Es zeigte hingegen keine rhythmische Expression. Preproghrelin und CRH oszillierten ultradian. NPY und NT wiesen zirkadiane Expressionen auf (140).
1.4 Fragestellung
In vielen Studien wurde in vivo (tierbasiert sowie anhand von Patientendaten) und in vitro gezeigt, dass zahlreiche metabolische Erkrankungen durch eine Entkopplung des zentralen und des peripheren Uhrensystems entstehen. Während über die Pathophysiologie einer Hyperglykämie sowie therapeutischer Ansatzpunkte umfangreiche Erkenntnisse vorliegen, ist die Wirkung erhöhter Produkte des Fettsäurestoffwechsels unklarer. Gezeigt wurde,
13 dass Palmitat in der Peripherie über verschiedene Mechanismen zu erhöhter Inzidenz von dem metabolischen Syndrom und assoziierten Erkrankungen führt. Über den Effekt von erhöhten Palmitatwerten im zentralen Uhrensystem ist jedoch weniger bekannt. Auf Grund der Verknüpfung von Energiehaushalt, Appetitregulation und zirkadianer Rhythmik im Hypothalamus ist ein besseres Verständnis dieser Zusammenhänge wichtig. Dieses könnte wohlmöglich eine bessere Behandlung assoziierter Erkrankungen sowie eine effiziente Gesundheitsprävention unterstützen.
Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe einer hypothalamischen Zellreihe zu zeigen, wie, wann und in welchen Konzentrationen Palmitat die normale Rhythmik des zentralen Uhrensystems beeinflusst.
Im Rahmen dessen wird auf folgende Fragen eingegangen:
1. In welchen Konzentrationen wirkt Palmitat schädlich auf die hypothalamische Zelllinie?
2. Gibt es eine Beeinflussung der Rhythmik von Uhrengenen auf Proteinebene durch Palmitat?
Ist diese Beeinflussung zeitabhängig?
3. Über welche molekulare Veränderung von Uhrengenen oder Cofaktoren entsteht diese Beeinflussung?
14
2 Methodik
2.1 Zellkultur
2.1.1 Allgemeine Arbeitsbedingungen mit der Zellkultur
Sämtliche Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter einer sterilen Sicherheitswerkbank durchgeführt. Die Materialen waren steril verpackt oder wurden vor Nutzung autoklaviert und mit 70 % Ethanol gesäubert. Die Arbeitsoberflächen wurden vor und nach Benutzung der Werkbank mit 70 % Ethanol gereinigt.
Alle genutzten Flüssigkeiten wurden vor Zugabe auf die Zellen auf 37 °C erwärmt, um die Wachstumsbedingungen der In-vitro-Säugerzellkultur konstant entsprechend der In-vivo-Umgebungsbedingungen zu halten. Diese Temperatur entspricht zudem dem Aktivitätsoptimum des Enzyms Trypsin, welches zum Ablösen der Zellen genutzt wurde.
Während der Nutzung eines Wasserbades wurde durchgehend darauf geachtet, Kontamination durch Berührungen des Deckels mit der Wasseroberfläche zu vermeiden.
2.1.2 Verwendete Zelllinie mHypoE-N44-Bmal1-Luc
Sämtliche zellbasierten Versuche wurden mit einer embryonalen hypothalamischen Neuronen-Zelllinie aus Mäusen (mHypoE-N44) durchgeführt. Diese war klonal und immortalisiert. Die Zellen wurden stabil so mit dem Lentivirus transfiziert, dass eine Luciferase unter dem Promotor von Bmal1 exprimiert wurde (Bmal1-Luc) (100). Die Zelllinie wurde bei 37 °C, 5 % CO2-Gehalt und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert (Inkubator: New Brunswick Galaxy 170 S, Hersteller: Eppendorf Company). Die Zellversuche wurden in der Regel bei 100 % konfluentem Wachstum begonnen, um eine Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Bei einer Abweichung dessen wurde dies explizit im Versuchsaufbau beschrieben.
2.1.3 Auftauen eingefrorener Zellen
Ein Kryoröhrchen mit der entsprechenden Zelllinie und Zellpassage wurde aus dem Stickstofflagertank entnommen und auf Eis zu einer Zellkultur-Arbeitsbank transportiert.
Das Kryoröhrchen wurde bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurde anschließend zügig in eine Zellkulturflasche mit 37 °C warmem Kulturmedium pipettiert (DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S)) und inkubiert. Nach zirka
15 8 Stunden wurden die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen und es wurden 15 ml neues Kulturmedium hinzugegeben.
2.1.4 Kryokonservierung
Für die Kryokonservierung wurde eine Zentrifuge auf 4 °C vorgekühlt. Als Einfriermedium wurde DMEM mit 10 % FBS und 1 % P/S mit 10 % DMSO durchmischt und auf Eis gestellt.
Die Zellen einer 175 cm2-Zellkulturflasche wurden mit 20 ml PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml 0,05 % Trypsin/EDTA für 30 Sekunden inkubiert. Bei sichtbarer Schlierenbildung wurde das Trypsin durch Hinzugabe von 20 ml serumhaltigem Medium inaktiviert und die Zellen durch mehrfaches Pipettieren von der Flaschenoberfläche gelöst.
Die Suspension wurde bei 4 °C und 42 rcf für 5 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und die Zellen im Einfriermedium resuspendiert. Je 1,0 ml der Zellsuspension wurde in ein Einfriergefäß (CryoPure der Firma Sarstedt) pipettiert. Die Kryoröhrchen wurden über mehrere Tage in Isopropanol in einem -80 °C-Gefrierschrank gekühlt, bevor sie zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden.
2.1.5 Teilen der konfluierenden Zellen (Splitting)
Die folgenden Angaben beziehen sich auf das Teilen der Zellen in einer 75 cm2- Zellkulturflasche. Bei Benutzung anderer Größen wurden die Verhältnisse von PBS, Trypsin-EDTA und Medium an die Oberfläche der Zellkulturflasche angepasst.
Die Zellkulturen wurden gesplittet, sobald die Oberfläche einer Zellkulturflasche zu 70 - 90 % mit einem Monolayer bewachsen war. Aus der Zellkulturflasche wurde das Medium mit einer Glaspipette abgesaugt. Die Zellen wurden mit 10 ml PBS gewaschen.
Danach wurden 2 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in die Zellkulturflasche pipettiert. Nach 30 Sekunden Inkubation wurden 10 ml serumhaltiges Medium hinzugegeben und die Zellen mit mehrfachem Pipettieren von der Oberfläche gelöst. Anschließend wurde die Zelllösung in ein konisches 15 ml-Falconröhrchen überführt. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 200 g zentrifugiert. Das Medium oberhalb des Zellpellets wurde abgesaugt und das Zellpellet in frischem Medium gelöst. Die Resuspension wurde entsprechend der benötigten Konzentration in neuem Medium verdünnt und in sterile Zellkulturflaschen überführt.
16 2.1.6 Zellzählung
Die Zellen wurden mit dem LUNA-Fl Dual Fluorescence Cell Counter (Hersteller: Logos Biosystems) gezählt, bei dem jeweils 10 µl einer Verdünnung von einem Volumenteil Zelllösung zu einem Volumenteil Trypanblau genutzt wurde. Entsprechend der Zellzählung wurde die berechnete Menge Zellen verdünnt und in neue Kulturflaschen, Petrischalen oder Mikrotiterplatten überführt. Petrischalen (Durchmesser 35 mm) und Sechs-Loch-Platten wurden mit je 2 ml der Konzentration 5,0 x 105 Zellen/ml besät, um am Folgetag 100 % Konfluenz zu erreichen.
2.1.7 Medien und Bestandteile
2.1.7.1 Zellkulturmedium und Medienzusätze
Als Flüssignährmedium wurde DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 100 µg/ml) genutzt. Bei Aufzeichnungsmedien, welche während der photometrischen Messungen genutzt wurden, wurde DMEM ohne Phenolrot (DMEMw/o) genutzt.
Tabelle 1: Kultivierungsmedium für Zelllinie N44-BL DMEM
1 % Penicillin (100 U/ml) / Streptomycin (100 µg/ml) 10 % FBS
Tabelle 2: Medienzusätze
Reagenz Funktion
B-27 serumfreie Ergänzung für Zellwachstum
BSA Fettsäurentransporter, erhöht Löslichkeit des Palmitats Dexamethason Synchronisation der Zellrhythmen
FBS Rinderserum mit Wachstumsfaktoren
HEPES Puffer
D-Luciferin Substrat der Luciferase
Natriumpalmitat Fettsäure (Hexadecansäure, C16H32O2)
PBS Waschen
Natriumcarbonat Puffer
Stabiles Glutamin Nährmedium, Stickstoffquelle
Trypsin Serinprotease, zur Spaltung von Proteinen
Trypanblau Anionischer Diazofarbstoff, zur Zellzahlbestimmung
2.1.7.2 Ansetzen von 5 % BSA in DMEMw/o
Mithilfe eines Rührfisches wurden 5 % BSA in DMEMw/o gelöst. Die Lösung wurde steril filtriert. Hierfür wurden Filter mit geringer Proteinbindung verwendet: zuerst mit einer
17 Porengröße von 0,45 µm Durchmesser und anschließend von 0,22 µm Durchmesser. Die sterile 5 % BSA/DMEM-Lösung wurde im Kühlschrank bei 4 °C gelagert.
2.1.7.3 Ansetzen der Palmitatlösung
Zum Herstellen einer 100 mM Palmitatlösung wurden 27,8 mg Natriumpalmitat in 1 ml sterilem Wasser bei 60 °C unter regelmäßigem Schwenken gelöst. Steriles 5 % BSA in DMEM wurde auf 41 °C erwärmt. Um eine 5 mM Palmitatkonzentration anzusetzen, wurden 500 µl der flüssigen 100 mM Palmitatlösung in 9,5 ml 5 % BSA/DMEM gelöst (138).
Analog wurden weitere Verdünnungen angesetzt. Nach Ansetzen der Arbeitskonzentrationen wurden diese erneut steril filtriert (Siehe 1.7.2). Die Palmitatlösung wurde bei -80 °C eingefroren und bei -20 °C gelagert.
2.1.8 Synchronisation
Das Uhrensystem der Zellen wurde nach Zugabe von 4 µl 50 µM Dexamethason (entspricht 100 nM Dexamethason in 2 ml Zellmedium) für 2 Stunden synchronisiert. Nach Zugabe des Dexamethasons wurde dieses durch zeitgleiche horizontale Acht-Bewegungen der Zellproben gleichmäßig verteilt. Bei Versuchsansätzen in 96-Loch-Mikrotiterplatten wurde das Dexamethason zuvor in DMEM + GlutaMax gelöst und nach Hinzugabe in die Versuchsansätze (100 nM Dexamethason pro Loch) für 2 Stunden synchronisiert.
Alternativ wurde die Synchronisation mit Rinderserum durchgeführt. Dafür wurden die Zellen 60 Minuten mit 50 % FBS oder 30 Minuten mit 20 % FBS inkubiert. Die Hinzugabe des Serums erfolgte nach Absaugen des alten Kulturmediums sowie eines einmaligen Waschens mit PBS.
Die Synchronisation wurde durch Absaugen des Mediums sowie zweifachen Waschens mit PBS beendet. Wurden verschiedene Synchronisationsvarianten miteinander verglichen, erfolgte der Beginn zeitversetzt und die Synchronisation wurde in den Versuchsansätzen zeitgleich beendet.
2.1.9 Ernten der Zellen
Zum Ernten der Zellen wurde das Medium abgesaugt und ein Waschschritt mit PBS durchgeführt. Danach wurde das PBS restlos abgesaugt. Die Zellplatten oder Petrischalen
18 wurden mit Parafilm zugeklebt und unverzüglich auf Trockeneis gestellt. Die Proben wurden bei -80 °C eingefroren.
2.1.9.1 Ernten der Zellen für anschließende qPCR nach vorheriger Palmitatinkubation
Die Zellen wurden in dem Versuch „Einfluss von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen“ bereits bei einem Wachstum von 60-70 % für 12 Stunden mit 0,3 mM Palmitat oder alternativ mit 0,0 mM Palmitat inkubiert. Danach wurde eine Synchronisation mit 20 % Serum für 30 Minuten durchgeführt. Nach Absaugen des Synchronisationsmediums wurden die Zellen erneut mit 0,3 mM Pal und 0,0 mM Pal inkubiert. Beendigung der Synchronisation repräsentierte hierbei den Messbeginn als Zeitpunkt T0. Die Zellen wurden zu T0 und T18 Stunden nach Beendigung der Synchronisation geerntet.
In dem Versuch „Kurzfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in nicht synchronisierten N44-Zellen“ (s 3.1) wurde ein Mediumwechsel durchgeführt, welcher den Zeitpunkt des Messbeginns (= T0) repräsentierte. Das neue Medium enthielt in einer Versuchsgruppe kein Palmitat (0,0 mM Pal) und in der anderen 2,0 mM Palmitat. Die Zellen wurden in zwei Versuchswiederholungen verschiedener Messzeitpunkte innerhalb der ersten 8 Stunden nach Synchronisation geerntet.
In dem Versuch „Langfristiger Effekt von Palmitat auf die Uhrengenexpression in synchronisierten N44-Zellen“ (s. 3.8) wurden die Zellen mit Dexamethason synchronisiert.
12 Stunden nach Beendigung der Synchronisation mit einem Mediumwechsel repräsentiert Zeitpunkt T0. Das neue Medium enthielt in einer Versuchsgruppe 0,0 mM Palmitat und in der anderen 1,0 mM Palmitat. Die Zellen wurden ab T0 über 28 Stunden alle 4 Stunden geerntet.
2.2 Versuch zu der Zytotoxizität von Palmitat
Für den Zelltoxizitätsversuch wurde mit dem Cell Proliferation Kit (XTT-based) der Firma Biological Industries gearbeitet. Es wurden auf einer 96-Loch-Mikrotiterplatte pro Vertiefung 100 µl Zellsuspension mit der Konzentration 2,5 x 105 Zellen/ml gesät. Als Medium wurde 5 % BSA/DMEM genutzt. Die außenliegenden Löcher wurden mit je 100 µl Puffer als Isolationsring befüllt. Die Zellen wurden über Nacht bis zu 100 % konfluentem Wachstum im Monolayer inkubiert. Nach lichtmikroskopischer Wachstumskontrolle
19 bezüglich der Konfluenz wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 100 µl PBS zweifach gewaschen. Zügig wurden Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen an Palmitat in 5 % BSA/DMEM sowie 2 % B27, 2 mM stabiles Glutamin, 1 % P/S, 10 mM HEPES und 352,5 µg/mL Natriumcarbonat hinzugegeben. Jede Palmitatkonzentration wurde in fünf Wells auf Zellen gegeben sowie in drei Wells für konzentrationsspezifische Leerwerte pipettiert. Die Platten wurden für weitere 24 Stunden inkubiert. Danach wurden je 50 µl Reaktionslösung in die vorbereiteten Wells pipettiert. Dies entspricht Zeitpunkt 0. Die Reaktionslösung wurde unmittelbar vor Gebrauch aus XTT-Reagenz und Aktivierungslösung entsprechend der Herstellerbeschreibung bei gedämpftem Licht angefertigt (Verhältnis: 0,1 ml Aktivierungslösung in 5,0 ml XTT-Reagenz). Die Platten wurden mit der Reaktionslösung weiter inkubiert. Messungen wurden nach 2, 4 und 6 Stunden Inkubationszeit gemacht. Gemessen wurde mit einem Spektralphotometer der Firma Bio Tek Epoch bei den Wellenlängen 450 nm und 630 nm.
2.3 Messung der Luciferase-Promoteraktivität im Luminometer
Die Zellen wurden für 2 Stunden mit 100 nM Dexamethason synchronisiert. Nach der Synchronisation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit den entsprechenden Aufzeichnungsmedien versetzt. Alle Aufzeichnungsmedien enthielten 5 % BSA/DMEM, 2 % B27, 2 mM Stabiles Glutamin, 1 % P/S, 10 mM HEPES und 352,5 µg/mL Natriumcarbonat sowie 100 nM D-Luziferin. Das D-Luziferin wurde lichtgeschützt in einem mit Aluminiumfolie umwickelten Reaktionsröhrchen gelagert und erst kurz vor Beendigung der Synchronisation in gedämpftem Licht zum Aufzeichnungsmedium pipettiert. Deckgläser (Durchmesser 40 mm) wurden am äußeren Rand mit Silikon-Hochvakuumfett bestrichen und zum Verschließen der Petrischalen genutzt. Anschließend wurden die Messungen über den Zeitraum von vier bis sieben Tagen im Luminometer begonnen. Zum Messen der Lumineszenz wurde der 32-Kanal- Luminometer LumiCycle32 (Hersteller: Actimetrics; s. Anhang 1) genutzt. Der LumiCycle stand über den Zeitraum der Messungen in einem 32,5 °C warmen Inkubator (Heratherm Microbiological Incubator, Hersteller: Thermo Fisher Scientific).
20 2.3.1 Dosisbehandlung
Für die Dosisbehandlung wurden unmittelbar nach Beendigung der Synchronisation Aufzeichnungsmedien mit verschiedenen Konzentrationen Palmitat (0,0 mM; 0,5 mM;
1,0 mM; 1,5 mM und 2,0 mM Palmitat) zu den synchronisierten Zellen hinzugegeben.
2.3.2 Phasenbehandlung
Nach Beendigung der Synchronisation wurde auf alle Probenansätze Aufzeichnungsmedium ohne Palmitat gegeben. Bevor die Messungen gestartet wurden, wurden die Petrischalen mit Silikon und Deckgläschen verschlossen. Nach der ersten Periode wurden anhand der bisherigen Messwerte mit dem Programm LumiCycle Analysis 2.40 möglichst deckungsgleiche Probenpaare mit N = 6 sortiert. Diese Probenpaare wurden zeitgleich in einer bestimmten Phase bei fortlaufender Messung aus dem LumiCycle genommen. Die Proben wurden auf einer erwärmten Kupferplatte (32,5 °C) unter den Abzug transportiert und dort auf einer analog erwärmten Heizplatte behandelt, um mögliche Temperatureffekte zu minimieren. Die Deckgläschen wurden vorsichtig entfernt.
Die Phasenbehandlung wurde mit 100 µl 20 mM Palmitat in 5 % BSA/DMEM (entspricht 1,0 mM Pal in 2,0 ml Medium) oder 100 µl 5 % BSA/DMEM (entspricht 0,0 mM Pal in 2,0 ml Medium) durchgeführt. Die Deckplättchen wurden erneut mit Silikon befestigt. Die Proben wurden auf der Kupferplatte zurück in den Inkubator transportiert und auf denselben Messpositionen wie zuvor zurück in den LumiCycle gestellt.
2.4 Aufnahme der Rhythmen mit Mikrotiterplatten-Lesegerät
Zur Beendigung der Synchronisation wurden Aufzeichnungsmedien mit verschiedenen Palmitatkonzentrationen sowie eine Kontrollbedingung ohne Palmitat auf die Zellen gegeben. Das Aufzeichnungsmedium enthielt in allen Versuchen 0,5 mM D-Luziferin. Die 96-Loch-Mikrotiterplatten wurden generell im äußersten Ring mit Isolationspuffer befüllt.
Die verschiedenen Konzentrationen wurden in Reihen abwechselnd auf der Platte verteilt, um systematische Fehler zu minimieren. Nach Hinzugabe des Aufzeichnungsmediums wurde die Platte mit einer luftdurchlässigen Membran zugeklebt. Die Messungen wurde nach entsprechender Protokolleinstellung (Temperatur: 32,5 °C) in dem SpectraMax L Microplate Luminometer (Hersteller: Molecular Devices) begonnen.
21 2.5 Molekulargenetische Methoden
2.5.1 RNA-Extraktion
Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden die benötigten Arbeitsmaterialen und Oberflächen für die RNA-Isolierung zunächst mit RNA-Dekontaminationsflüssigkeit gesäubert, und es wurde unter einem Abzug gearbeitet. Die Proben wurden während der RNA-Isolation auf Eis gelagert. Die Zellen wurden mit 500 µl TRIzol pro Vertiefung einer Sechs-Well-Plate (9,5 cm2 Fläche) durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren gelöst und homogenisiert. Die Suspension wurde in Reaktionsgefäße (1,5 ml der Firma Eppendorf) überführt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Folgend wurden zu jeder Probe 100 µl Chloroform hinzugegeben und durch Invertieren der Reaktionsgefäße vermischt. Die Proben wurden 5 Minuten auf Eis gestellt. Anschließend wurden sie mit 15.294 rcf bei 4 °C für 15 Minuten zentrifugiert. Es entstanden drei Phasen: Eine untere organische Phase mit Proteinen, eine Interphase mit DNA und eine obere, wässrige Phase mit RNA. Es wurde die obere wässrige Phase vorsichtig abpipettiert und in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt, ohne die Interphase oder die untere visköse Phase zu tangieren. Nach Hinzugabe von 1 µl GlycoBlue und 250 µl Isopropanol oder alternativ 250 µl 75 % Ethanol wurden die Proben invertiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 17.949 rcf und 4 °C für 30 Minuten. Der Überstand wurde abpipettiert und die Niederschläge wurden zweifach mit je 500 ml 75 % Ethanol gewaschen. Zwischen den Waschschritten vor erneutem Abpipettieren des Überstands wurden die Proben bei 20.817 rcf und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand nach dem zweiten Waschen abpipettiert worden war, wurden die RNA-Niederschläge für 5 Minuten luftgetrocknet. Anschließend wurden die Niederschläge in je 20 µl Nuklease-freiem Wasser gelöst. Die Lagerung der RNA-Proben erfolgte bei -80 °C.
2.5.2 cDNA-Synthese
Für die cDNA-Synthese wurde das High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) genutzt. Die RNA-Proben wurden auf Eis aufgetaut. Die RNA-Konzentrationen wurden mit dem Epoch Microplate Spectrophotometer (Hersteller: Bio Tek) bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm gemessen. Es wurde das Programm „Nucleid Acid Quantification“ mit dem Probentyp RNA genutzt. Das Probenvolumen für die Messungen betrug 2 µl. Als Leerwert wurde eine äquivalente Menge Wasser genutzt. Die RNA-Reinheit
22 wurde anhand des 260 nm / 280 nm-Quotienten beurteilt, welcher zwischen 2,0 und 2,2 sein sollte.
Der RNA-Gehalt jeder Probe wurde entsprechend der vorherigen Konzentrationsbestimmung mit Nuklease-freiem Wasser verdünnt, sodass äquivalente Gesamtmengen an RNA in jedem Probenansatz für die RT-Reaktion bereitstanden. Die RNA-Konzentration wurde auf 1 µg/µl eingestellt. Für das Ansetzen des Reverse Transkriptase-Mastermixes (Tab. 3) wurden die benötigten Substanzen (mit Ausnahme der MultiScribe RT) auf Eis aufgetaut. Danach wurde der Mastermix angefertigt. Es wurden 10 µl RNA mit 10 µl Mastermix in ein PCR-Röhrchen pipettiert. Nach kurzem Durchmischen und Abzentrifugieren der Proben wurden diese im Thermozykler Biometra TRIO (Hersteller:
Analytik Jena) in cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Proben wurden mit Nuklease-freiem Wasser 1:20 verdünnt und anschließend bei -20 °C eingefroren.
Tabelle 3: Mastermix für Reverse Transkriptase-Reaktion (Ansatz je Probe)
10 x RT Puffer 2 µl
25 x dNTP Mix (100 mM) 0,8 µl 10 x RT random primer 2 µl MiltiScribe RT (50 U/µl) 1 µl Nuklease-freies Wasser 4,2 µl
Total 10 µl
Tabelle 4: Programm des Thermozyklers für die Reverse Transkriptase-Reaktion
25 °C 10 min
37 °C 120 min
85 °C 5 min
4°C ∞
2.5.3 Quantitative Echtzeit-PCR
Zur Bestimmung der Expression spezifischer Uhrengene wurden die cDNA und die Primer auf Eis aufgetaut. Die Primer waren zuvor institutsintern validiert worden. Die Duplikationseffizienzen der benutzten Primer betrugen 80 - 105 %. Für jedes Primerpaar wurde ein Primer Mix angefertigt und auf Eis gekühlt. Als fluoreszierender Farbstoff wurde der asymmetrische Cyanin-Farbstoff SYBR Green genutzt. Als Reaktionsansatz wurden 5 µl Primer Mix, 10 µl SYBR Green und 5 µl cDNA in eine 96-Loch-PCR-Mikrotiterplatte pipettiert. SYBR Green und Primer wurden jeweils als Master-Mix zusammenpipettiert, von welchem 15 µl pro Messansatz in die Vertiefungen pipettiert wurden. Während des Pipettierens wurde die 96-Loch-PCR-Mikrotiterplatte in einem wassergekühlten Ständer
23 gekühlt. Die Platte wurde mit einem Klebestreifen verschlossen, gevortext und für 2 Minuten bei 425 rcf zentrifugiert. Das Amplifikationsprotokoll wurde eingestellt und die Amplifikation wurde bei zeitgleicher Messung in dem Thermozykler CFX-96 Touch Real-Time PCR Detection System (Hersteller: BioRad) begonnen.
Tabelle 5: Primer Mix
Forward Primer Stock (100 µM) 14 µl Reverse Primer Stock (100 µM) 14 µl
Nuklease-freies Wasser 972 µl
Tabelle 6: qPCR-Reaktionsansatz für eine Probe
Primermix (je 1,4 µM) 5 µl
GoTag qPCR Master Mix 10 µl
cDNA 5 µl
Tabelle 7: Standard-Amplifikationsprogramm
94°C 5 min 1 x
94°C 15 s 40 x
60 °C 15 s 40 x
72°C 20 s 40 x
72°C 5 min 1 x
Tabelle 8: Sequenzen der qPCR-Primerpaare
Zielgen Forward Primer 5‘ → 3‘ Reverse Primer 5‘ → 3‘
Bmal1 CCT AAT TCT CAG GGC AGC AGA T TCC AGT CTT GGC ATC AAT GAG T Clock GTG GTG ACT GCC TAT CCT ACC T AAG GAG GGA AAG TGC TCT GTT G Per1 AGT TCC TGA CCA AGC CTC GTT AG CCT GCC CTC TGC TTG TCA TC Per2 GCC AAG TTT GTG GAG TTC CTG CTT GCA CCT TGA CCA GGT AGG Reverbα AGC TCA ACT CCC TGG CAC TTA C CTT CTC GGA ATG CAT GTT GTT C Eef1α TGC CCC AGG ACA CAG AGA CTT CA AAT TCA ACA CCA GCA GCA A
NPY CTC CGC TCT GCG ACA CTA C GGA AGG GTC TTC AAG CCT TGT
PPARα AAC ATC GAG TGT CGA ATA TGT GG AGC CGA ATA GTT CGC CGA AAG PGC1α AGC CGT GAC CAC TGA CAA CGA G GCT GCA TGG TTC GTG CTA AG
24
2.6 Datenauswertung
2.6.1 Tabellarische Übersicht verwendeter Programme
Tabelle 9: Tabellarische Übersicht verwendeter Software
Name Version Hersteller
Gen5 TM 5 2.0 BioTek Instruments, Inc.
Microsoft Excel Office 365 ProPlus und
Professional Plus 2016
Microsoft Corporation
GraphPad Prism 7.0 GraphPad Software, Inc.
LumiCycle Analysis 2.40 Actimetrics
SoftMax Pro 5.4.5 Molecular Devices
CFX Manager Software 3.0 BioRad
R 3.5.1 und 3.5.2 The R Foundation for
Statistical Computing
JTK_Cycle 3.1 Hughes Lab
Eine vollständige Übersicht der genutzten Geräte sowie Herstellerangaben befindet sich im Anhang (s. Anh. 2).
2.6.2 Auswertung des Versuches zu der Zytotoxizität von Palmitat
Die Auswertung fand über das Programm Gen5 2.0 sowie über Microsoft Excel statt. Von jedem Messwert bei 450 nm und bei 630 nm wurde ein korrigierter Messwert erstellt, indem der durchschnittliche Referenzmesswert subtrahiert wurde. Dafür wurde für jede Palmitatkonzentration aus den dazugehörigen drei Leerwertmessungen mit derselben Palmitatkonzentration ein Mittelwert für die Wellenlängen 450 nm und 630 nm errechnet.
Diese gemittelten Hintergrund-Absorptionen wurden von den Messwerten der Zellproben bei 450 nm und bei 630 nm abgezogen. Von dem korrigierten Messwert bei 450 nm wurde der korrigierte Messwert bei 630 nm als Absorptionsreferenz subtrahiert. Aus diesen errechneten Werten bei 450 nm abzüglich der Absorptionsreferenz verrechnet mit der Hintergrund-Absorption wurde aus jedem Versuchsansatz (n = 5 pro Konzentration) ein Mittelwert errechnet. Die weitere Auswertung sowie Visualisierung der Daten wurde mit GraphPad Prism 7.0 umgesetzt.
25 2.6.3 Analyse der Bmal1::Luc-Oszillationen
Für die Analyse der Versuchsreihen mit einem LumiCycle wurde der betrachtete Messzeitraum beginnend 12 Stunden nach Beginn der Messung genutzt, um anfängliche Temperatur-, Behandlungs- und Lichtartefakte durch die Behandlung zu verringern. Die Rohdaten wurden in Zählungen pro Sekunde (counts per second = CPS) erfasst. Für die Auswertung der Zeitreihen wurden die Probenansätze genutzt, die unbehandelt eine Periode zwischen 22 und 26 Stunden hatten und deren Modellanpassung mit einer gedämpften Sinuskurve einen „goodness of fit“ größer als 80 % hatte. Diese Parameter wurden mit dem Programm LumiCycle Analysis 2.40 bestimmt. Mit Hilfe desselben Programms wurden Datenreihen erstellt, die über den laufenden 24-Stunden-Durchschnitt normalisiert wurden. Die weitere statistische Auswertung sowie die grafische Darstellung erfolgten mit den normalisierten Daten der Versuche des Luminometers unter Verwendung der Programme Microsoft Excel, JTK_Cycle 3.1, GraphPad Prism 7.0 und den Statistikpaketen von R 3.5 (s. 2.6.5).
2.6.3.1 Auswertung der Bmal1::Luc-Oszillationen bei Dosisbehandlung
Für die Auswertung der Rohdaten wurden alle Messwerte (N = 13 oder N = 14) mithilfe eines gleitenden Mittelwertes über 24 Stunden normalisiert. Um die Effekte verschiedener Palmitatkonzentrationen auf die Rhythmik des hypothalamischen Uhrengenes Bmal1 zu untersuchen, wurden die N44-Bmal1-Zellen ab Beendigung der Synchronisation mit verschiedenen Konzentrationen Palmitat (0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM Palmitat) sowie ohne Palmitat inkubiert. Die Einflüsse des Palmitats wurden zunächst durch Betrachtung der grafischen Kurvenverläufe sowie exemplarischer Nullstellenbestimmung zweier Messwochen verglichen. Bei höheren Konzentrationen ab 1,0 mM Palmitat waren teilweise aufgrund starker Dämpfung und entsprechend verminderter Oszillation in einer der beiden exemplarisch analysierten Messwochen weniger als fünf aufeinanderfolgende Nullstellen bestimmbar. Für den Vergleich der Zykluslänge wurden nur Reihen mit eindeutiger zeitlicher Zuordnung von fünf aufeinander folgenden Nullstellen benutzt.
Nachfolgend wurden die Zeitreihen mit dem Modell einer gedämpften Sinusschwingung (Abb. 2) mit GraphPad Prism 7.0 angepasst, welche mit den Randwerten bei der Amplitude < 500 Zählungen/Sekunde, einem Dämpfungsfaktor K > 0,01 1/Stunde und einer Wellenlänge > 20 Stunden berechnet wurden. Dadurch waren Vergleiche hinsichtlich der Kurvencharakteristika (Amplitude, Wellenlänge, Phasenverschiebung, Frequenz,
