5.2 Cdc5 – ein negativer Regulator des Spindelkontrollsystems
5.2.3 Wirkungsweise von Cdc5 im SAC
Da die Überexpression von Cdc5 die Inaktivierung des SAC zur Folge hat, stellt sich die Frage, wie Cdc5 den SAC inaktiviert. Nach der Inaktivierung des SAC durch die bipolare Anheftung der Mikrotubuli an die Kinetochore, werden die SAC-Komponenten von den Kinetochoren wieder entfernt (Musacchio und Salmon, 2007; Kim und Yu, 2011). Der Mechanismus der Inaktivierung des SAC ist aber noch nicht vollständig geklärt.
Möglicherweise trägt Cdc5 dazu bei, indem es die Lokalisation von Mad1 und dadurch die Bildung des MCC an den unbesetzten Kinetochoren verhindert. Diese Vermutung bestärken einerseits die Ergebnisse der Lokalisationsstudien zur Abhängigkeit der SAC-Komponenten voneinander, die zeigen, dass Mad2 gänzlich und Bub3 sowie Mad3 teilweise von Mad1-abhängig am unbesetzten Kinetochor lokalisierten (siehe Abb. 4.31; Iouk et al., 2002; Gillett et al., 2004). Andererseits konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass erhöhte Mengen von Cdc5 die Lokalisation von Mad1, Mad2 und Bub3 am unbesetzten Kinetochor verringerte.
Die Auswirkungen auf die Lokalisation von Mad1 und Mad2 waren am stärksten. Beide lokalisierten nach Überexpression von Cdc5 in Nocodazol-arretierten Zellen kaum am unbesetzten Kinetochor (siehe Abb. 4.26 und 4.27). Allerdings hatte die Überexpression von Cdc5 keinen Einfluss auf die Interaktion zwischen Mad1 und Mad2 (siehe Abb. 4.23), jedoch auf die Interaktion von Cdc20 mit Mad2 (siehe Abb. 4.22) sowie mit Mad3 und Bub3 (Bittner, 2011). Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdc5 die Lokalisation von Mad1 am unbesetzten Kinetochor verhindert. Dies wirft die Frage auf, ob Cdc5 die Dissoziation von Mad1 vom unbesetzten Kinetochor induziert oder die Rekrutierung von Mad1 ans unbesetzte Kinetochor verhindert. Die gezeigten Daten sprechen eher dafür, dass die Dissoziation von Mad1 induziert wurde, da Mad1 zunächst am unbesetzten Kinetochor lokalisierte und durch die anschließende Überexpression von Cdc5 weniger Zellen mit Mad1-Kinetochor-Lokalisation detektierbar waren (siehe Abb. 4.26 B). Anders als hier in S. cerevisiae gezeigt, scheint die Plk1 in humanen Zellen nicht nur an der Inaktivierung, sondern auch an der Aktivierung des SAC beteiligt zu sein. Plk1 ist für die Lokalisation von Mad1 am unbesetzten Kinetochor notwendig (Chi et al., 2008).
Da in Gegenwart von erhöhten Cdc5-Mengen die Mad1-Lokalisation am unbesetzten Kinetochor verringert ist, stellt sich die Frage, wie Cdc5 die Lokalisation von Mad1 beeinflusst. Eine physische Interaktion von Cdc5 mit Mad1 in Nocodazol-arretierten Zellen konnte mittels Co-Immunpräzipitation nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt) und ist auch nicht bekannt. Eine andere Möglichkeit wäre, dass Cdc5 die Aufrechterhaltung der Lokalisation von Mad1 an den unbesetzten Kinetochoren verhindert, indem Cdc5 direkt auf
das Kinetochor wirkt. Ndc80 gehört zum Ndc80-Komplex des äußeren Kinetochors, der zur Mikrotubuli-Anheftung nötig ist (Santaguida und Musacchio, 2009; Cho et al., 2010). Für Ndc80 ist eine physische Interaktion mit Cdc5 beschrieben (Snead et al., 2007). Allerdings ergab sich in dieser Arbeit kein Hinweis auf eine Cdc5-abhängige Phosphorylierung von Ndc80 (Daten nicht gezeigt).
Des Weiteren ist eine physische Interaktion von Cdc5 mit Mps1 beschrieben (Snead et al., 2007). Mps1 lokalisiert vermutlich Ndc80-abhängig am Kinetochor (Kemmler et al., 2009) und ist für die Rekrutierung von Mad1 und Mad2 ans unbesetzte Kinetochor notwendig (Kim und Yu, 2011). Durch Überexpression ist Mps1 in der Lage den SAC zu aktivieren und die Zellen arretieren in der Metaphase (Hardwick et al., 1996). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die gleichzeitige Überexpression von Mps1 und Cdc5 den Arrest in der Metaphase verzögert und die Zellen besser wachsen können (siehe Abb. 4.35). Daraus folgt, dass Cdc5 direkt auf oder unterhalb von Mps1 wirkt, denn würde Cdc5 oberhalb von Mps1 wirken, würde die gleichzeitige Überexpression von Cdc5 und Mps1 den Metaphase-Arrest nicht beeinflussen. Darüber hinaus konnte eine durch die Überexpression von Cdc5 induzierte mögliche Phosphorylierung von Mps1 nachgewiesen werden (siehe Abb. 4.36). Diese Daten legen nahe, dass Mps1 ein direktes Substrat von Cdc5 ist und Cdc5 Mps1 entgegenwirkt. Es wäre möglich, dass die Cdc5-abhängige Phosphorylierung die Aktivität von Mps1 inhibiert und bzw. oder dass dadurch die Lokalisation (möglicherweise die Wechselwirkung mit Ndc80) am Kinetochor beeinflusst wird. Dies könnte dann die Mad1-Dissoziation vom unbesetzten Kinetochor zur Folge haben. Daher wäre eine Lokalisationsanalyse von Mps1 bei erhöhten Mengen von Cdc5 hilfreich, um die Wirkung von Cdc5 auf Mps1 weiter zu klären.
Eine weitere Komponente des Kinetochors mit der eine physische Interaktion von Cdc5 beschrieben ist, ist Slk19 (Park et al., 2008). Die Lokalisation von Slk19 am Kinetochor ist ebenfalls von Ndc80 abhängig (Pagliuca et al., 2009). Slk19 lokalisierte nach Aktivierung des SAC überwiegend am unbesetzten Kinetochor (siehe 4.4.6.2). Die Überexpression von Cdc5 hatte zur Folge, dass die Anzahl der Zellen mit zwei Slk19-Signalen anstieg (siehe Abb. 4.33). Ähnlich war auch die Auswirkung auf die Lokalisation von Ndc80. Es zeigte sich nach erhöhten Mengen von Cdc5 eine reduzierte Anzahl der Zellen mit unbesetztem Kinetochor und eine leicht erhöhte Anzahl der Zellen mit zwei Kinetochor-Cluster (siehe Abb. 4.32). Es ist bekannt, dass Cdc5 für die Mikrotubuli-Nukleation und die Mikrotubuli-Dynamik wichtig ist und dafür die Phosphorylierung von Slk19 sowie Stu2 eine Rolle spielt (Park et al., 2008). Für Slk19 ist ebenfalls bekannt, dass es die Mikrotubuli
stabilisiert (Havens et al., 2010). Kitamura et al. (2010) zeigen, dass Kinetochore selbst Mikrotubuli mit distalem Plus-Ende bilden und dass dafür Stu2 notwendig ist. Daher lässt sich mutmaßen, dass erhöhte Mengen von Cdc5 dazu führen, dass trotz Nocodazol die Mikrotubuli-Bildung stabilisiert ist und die unbesetzten Kinetochore zum Cluster zurück finden sowie die SAC-Komponenten vom Kinetochor entfernt werden. Um dies zu überprüfen wäre eine Analyse des Tubulin-Signals unter Nocodazol-Bedingungen und Cdc5-Überexpression nützlich. Zudem wäre es denkbar, dass Cdc5 neben der Inaktivierung des SAC auch eine positive Wirkung auf den weiteren Ablauf der Mitose hat, indem Cdc5 hilft die defekte Spindel wieder zu reparieren.
Möglicherweise ist Cdc5 an mehreren Ereignissen der Inaktivierung des SAC beteiligt. Eine indirekte Wirkung von Cdc5 durch Cdc14 wäre durchaus auch vorstellbar. Cdc14 ist wichtig für die Relokalisation des CPC zur spindle midzone während der Anaphase, um eine Reaktivierung des SAC zu verhindern (Mirchenko und Uhlmann, 2010). Dafür ist die Dephosphorylierung von Sli15 notwendig. Im Zuge einer Interaktionsstudie von Cdc14 wurde auch Mad1 als potentielles Substrat identifiziert (Bloom et al., 2011). Mad1 wird nach Aktivierung des SAC hyperphosphoryliert (Hardwick et al., 1996). Möglicherweise trägt die Dephosphorylierung durch Cdc14 zur Inaktivierung des SAC bei.
Die Aktivität von Cdk1 ist ebenso hoch wie die von Cdc5 während der Mitose. Liang et al.
(2011) vermuten, dass Cdk1 zur Inaktivierung des SAC beiträgt. Zum einen stimuliert Cdk1 die CDC20-Transkription, um freies Cdc20 zum Eintritt in die Anaphase bereit zu stellen und zum anderen scheint Cdk1 an der Koordination der Spindeldynamik beteiligt zu sein (Liang et al., 2011). Cdc5 stimuliert ebenfalls die Transkription des CLB2-Genclusters, dem CDC20 angehört, und wird wie bereits erwähnt für die Spindelelongation sowie die Spindeldynamik benötigt (Darieva et al., 2006; Park et al., 2008). Deshalb wäre es durchaus möglich, dass Cdc5 zusammen mit Cdk1 die Inaktivierung des SAC induziert.
Zusammenfassend lässt sich resümieren, dass Cdc5 ein negativer Regulator des Spindelkontrollsystems ist. Die Ergebnisse legen nahe, dass Cdc5 die Lokalisation von Mad1 am unbesetzten Kinetochor verhindert. Mps1 wurde als potentielles Substrat identifiziert, wobei die genaue Wirkungsweise von Cdc5 noch weiter analysiert werden muss.