Erhöhte Mengen von Cdc5 verringern die Kinetochor-Lokalisation von

Nocodazol-arretierten Zellen zusätzlich an den unbesetzten Kinetochoren (Iouk et al., 2002;

Gillett et al., 2004). Um eine mögliche Veränderung der Lokalisation von Mad1 nach Cdc5-Überexpression zu untersuchen, wurde zunächst das Mad1-GFP-Signal in Nocodazol-arretierten Zellen hinsichtlich der erwarteten Lokalisation am Kinetochor überprüft. Dazu wurde zur Co-Lokalisation einerseits Ndc80-3mCherry als Kinetochor-Marker und andererseits Spc42-3mCherry als SPK-Marker verwendet.

Die Mikroskopie-Daten zeigten, dass Mad1-GFP in Nocodazol-arretierten Zellen wie erwartet als nukläres, punktförmiges Signal lokalisierte. Dabei trat in 86% der analysierten Zellen ein

punktförmiges Signal und in 7% der Zellen zwei Foci auf (Daten nicht gezeigt). Die Mad1-GFP-Foci überlagerten überwiegend mit dem schwachen Ndc80-3mCherry oder blieben ohne Ndc80-Signal (Abb. 4.25 A). Die Co-Lokalisation von Mad1 mit Spc42 zeigte größtenteils keine Überlagerung der Signale. In Nocodazol-arretierten Zellen war überwiegend ein SPK-Signal vorhanden und bei 81% der analysierten Zellen war das punkförmige Mad1-GFP-Signal nicht mit dem SPK überlagert (Abb. 4.25 B).

Diese Ergebnisse bestätigen, dass Mad1-GFP in Nocodazol-arretierten Zellen an den unbesetzten Kinetochoren lokalisiert und stellten zusätzlich sicher, dass die hier verwendetete Mad1-GFP-Fusion sich wie erwartet verhielt.

Abbildung 4.25 Mad1-Foci co-lokalisieren überwiegend mit unbesetzten Kinetochoren

Die Zellen der Stämme (A) W11440 (MAD1-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1) und (B) W11594 (MAD1-GFP-CaURA3 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1) wurden in XYD bei 25°C angezogen und während der exponentiellen Wachstumsphase durch Zugabe von Nocodazol (7,5 µg/ml) 3 h arretiert. Die Präparation der Zellen und die Aufnahmen am Mikroskop wurden wie unter Abb. 4.24 durchgeführt. Mad1-GFP wurde mit 50% des 488 nm Lasers, Ndc80-3mCherry mit 80% und Spc42-3mCherry mit 75% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und repräsentative Nocodazol-arretierte Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm). Anschließend wurde die Co-Lokalisation von Mad1-GFP-Foci mit Ndc80 (A, n = 100) und Spc42 (B, n = 59) ausgewertet und in je einem Diagramm dargestellt.

Als Nächstes wurde das Mad1-GFP-Signal in asynchronen, Nocodazol-arretierten und Nocodazol-arretierten Zellen mit anschließender Cdc5-Überexpression untersucht. Dazu wurden die Zellen zunächst mit Nocodazol (7,5 µg/ml) in der Metaphase arretiert und

anschließend zur Überexpression von Cdc5 die Hälfte der Kultur für 120 min mit 2%

Galaktose induziert.

Die Auswertung der Mad1-Lokalisation zeigte, dass nach Nocodazol-Behandlung in über 80% der Zellen ein Kinetochor-Signal sichtbar war (Abb. 4.26 A und B). Interessanterweise war die Anzahl der Zellen mit Mad1-Kinetochor-Signal nach der Cdc5-Überexpression von 80% auf knapp 20% reduziert (Abb. 4.26 B). Bei konstitutiver Cdc5-Expression (pTEF2) war ebenfalls eine geringe Anzahl an Nocodazol-arretierten Zellen mit Mad1-Kinetochor-Signal zu sehen als bei Nocodazol-arretierten WT-Zellen (Abb. 4.26 B 3 h NOC und C). Dagegen war die Anzahl von Nocodazol-arretierten Zellen mit Mad1-Kinetochor-Signal bei konstitutiver Expression der kinaseinaktiven Mutante Cdc5K110M vergleichbar mit der von WT-Zellen (Abb. 4.26 C).

Daraus lässt sich schließen, dass erhöhte Mengen von Cdc5 Mad1 hindern am unbesetzten Kinetochor zu lokalisieren. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass durch Cdc5 die Mad1-Dissoziation vom Kinetochor induziert wurde.

Abbildung 4.26 Überexpression von Cdc5 verringert die Kinetochor-Lokalisation von Mad1-GFP

(A) Die Zellen des Stammes W11440 (MAD1-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 ura3::pGAL1-FLAG3-CDC5-tCYC1-URA3) wurden in XYR bei 25°C kultiviert und während der exponentiellen Wachstumsphase Nocodazol (7,5 µg/ml) zugegeben. Nach 3 stündigem Arrest wurde die Kultur geteilt und bei der einen Hälfte durch Zugabe von 2% Galaktose der GAL1-Promotor für 2 h induziert. Aus der asynchronen, der Nocodazol-arretierten (3 h und 5 h) und der Nocodazol-arretierten Kultur mit anschließender Cdc5-Überexpression wurden Zellen geerntet und mit SD++-Agarose für die Mikroskopie präpariert. Die mit

Galaktose inkubierten Zellen wurden mit SRG++-Agarose präpariert. Es wurden Z-Stapel mit 10 Ebenen und einer Distanz von 0,5 µm sowie einer Belichtungszeit von 200 ms aufgenommen. Mad1-GFP wurde mit 50% des 488 nm Lasers und Ndc80-3mCherry mit 80% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und für die Zeitwerte repräsentative Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm).

(B) Darstellung der Quantifizierung der Mad1-GFP-Signale nach Nocodazol-Behandlung (NOC) und Cdc5-Überexpression (ÜE, n > 100)

(C) Die Zellen der Stämme W12378 (MAD1-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 CDC5-MYC9-LEU2) und W12380 (MAD1-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 leu2::pTEF2-cdc5K110M-MYC9-LEU2) wurden in XYD bei 25°C angezogen und während der exponentiellen Wachstumsphase durch Zugabe von Nocodazol (7,5 µg/ml) 3 h arretiert. Die Präparation der Zellen und die Aufnahmen am Mikroskop wurden wie unter A durchgeführt und anschließend das Mad1-GFP-Signal ausgewertet (n > 48) und in einem Diagramm dargestellt.

4.4.4.2 Erhöhte Mengen von Cdc5 verringern die Kinetochor-Lokalisation von Mad2 und Bub3

Da Mad1 für die Rekrutierung von Mad2 ans Kinetochor zuständig ist und Mad2 sowie Bub3 nach SAC-Aktivierung ebenfalls an den unbesetzten Kinetochoren lokalisieren (Iouk et al., 2002; Kerscher et al., 2003; Gillett et al., 2004), lässt sich vermuten, dass die erhöhten Mengen von Cdc5 auch einen erheblichen Einfluss auf die Lokalisation des MCC haben könnten.

Um diese Vermutung zu überprüfen, wurden die Kinetochor-Signale von Mad2-GFP, Mad3-GFP und Bub3-GFP in asynchronen, Nocodazol-arretierten und Nocodazol-arretierten Zellen mit anschließender Cdc5-Überexpression untersucht.

In asynchronen Zellen lokalisierte Mad2 im Zytoplasma und im Zellkern. Dagegen lokalisierte Mad2 nach Aktivierung des Spindelkontrollsystems fast ausschließlich an den unbesetzten Kinetochoren (Abb. 4.27 A). Dabei hatten 71% der Zellen ein Kinetochor-Signal und 15% der Zellen zwei Signale. Ebenso wie bei Mad1, überlagerte das Mad2-Kinetochor-Signal bei 96% der Zellen, die ein punktförmiges Mad2-Signal zeigten, mit dem schwachen Ndc80-Signal oder blieben ohne Ndc80-3mCherry (Daten nicht gezeigt).

Infolge der Überexpression von Cdc5 verschwand wie bei Mad1 das Kinetochor-Signal von Mad2-GFP. Von ca. 90% der Zellen mit Kinetochor-Signal sank der Anteil auf knapp 30% ab (Abb. 4.27 B). Zusätzlich behinderte auch die konstitutive Expression von Cdc5 die Lokalisation von Mad2 am Kinetochor. Nur 60% der Zellen wiesen ein Mad2-Kinetochor-Signal auf, im Gegensatz zu 80% der Zellen bei konstitutiver Expression der kinaseinaktiven Mutante Cdc5K110M (Abb. 4.27 C).

Abbildung 4.27 Mad2-Lokalisation am unbesetzten Kinetochor wird durch Cdc5-Überexpression reduziert

(A) Die Zellen des Stammes W11441 (MAD2-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 ura3::pGAL1-FLAG3-CDC5-tCYC1-URA3) wurden wie unter Abb. 4.26 A kultiviert, präpariert und mikroskopiert. Mad2-GFP wurde mit 80% des 488 nm Lasers und Ndc80-3mCherry mit 80% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und für die Zeitwerte repräsentative Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm).

(B) Darstellung der Quantifizierung der Mad2-GFP-Signale zu den angegebenen Zeitpunkten (n > 140).

(C) Die Zellen der Stämme W12374 (MAD2-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 CDC5-MYC9-LEU2) und W12376 (MAD2-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 leu2::pTEF2-cdc5K110M-MYC9-LEU2) wurden ebenfalls, wie in Abb. 4.26 C beschrieben, behandelt und anschließend das Mad2-GFP-Signal ausgezählt (n > 45) und in einem Diagramm dargestellt.

Neben Mad1 und Mad2 wurden auch Mad3 und Bub3 nach Nocodazol-Behandlung ans unbesetzte Kinetochor rekrutiert (Abb. 4.28). Während des Zellteilungszyklus lokalisierten Mad3 und Bub3 hauptsächlich im Zellkern. Da Bub3 vermutlich für den Aufbau der Spindel wichtig ist, lokalisiert Bub3 bereits ab der S-Phase bis zur frühen Metaphase, wenn die bipolare Anheftung der Mikrotubuli an die Kinetochore erfolgt ist, am Kinetochor. Die Aktivierung des SAC verstärkt die Bub3-Kinetochor-Lokalisation (Kerscher et al., 2003;

Gillett et al., 2004). Allerdings waren die Auswirkungen der Cdc5-Überexpression auf die Lokalisation von Mad3 und Bub3 nicht so deutlich wie bei Mad1 und Mad2.

Die Mad3-Kinetochor-Signale waren nach drei Stunden Nocodazol-Inkubation nur sehr schwach zu sehen. Anders als bei den anderen Komponenten, erhöhte sich nach längerem Nocodazol-Arrest die Anzahl der Zellen mit Mad3-Kinetochor-Signal (Abb. 4.28 A).

Interessanterweise nahm die Anzahl der Zellen mit Mad3-Kinetochor-Lokalisation nach Cdc5-Überexpression nicht wieder ab, sondern es traten mehr Zellen mit zwei Kinetochor-Signalen auf. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass die Kinetochor-Signale stärker wurden.

Abbildung 4.28 Kinetochor-Lokalisation von Mad3 und Bub3 im SAC nach Cdc5-Überexpression

Die Zellen der Stämme (A) W11837 (MAD3-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 ura3::pGAL1-FLAG3-CDC5-tCYC1-URA3) und (B) W11838 (BUB3-GFP-CaURA3 NDC80-3mCherry-tCYC1-TRP1 ura3::pGAL1-FLAG3-CDC5-tCYC1-URA3) wurden ebenfalls wie unter Abb. 4.26 A kultiviert, präpariert und mikroskopiert. Mad3-GFP wurde mit 100%, Bub3-GFP mit 80% des 488 nm Lasers und Ndc80-3mCherry mit 100% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und für die Zeitwerte repräsentative Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm). Die Mad3-GFP- (A, n > 80) bzw. Bub3-GFP-Signale (B, n > 77) wurden anschließend zu den angegebenen Zeitpunkten ausgezählt und dargestellt.

Bei Bub3 konnten neben den Zellen mit einem starken Kinetochor-Signal auch teilweise Zellen mit schwachem und starkem Bub3-GFP detektiert werden. Dabei überlagerten das starke Bub3-GFP mit dem schwachen Ndc80-3mCherry und das schwache Bub3-GFP mit dem starken Ndc80-Signal (Abb. 4.28 B 5 h NOC). Die Überexpression von Cdc5 bewirkte im Fall von Bub3 wie bei Mad1 und Mad2 eine Reduktion der Anzahl der Zellen mit Kinetochor-Signal von ungefähr 90% auf 70% (Abb. 4.28 B). Zwar war die Abnahme nicht so deutlich wie bei Mad1 und Mad2, jedoch war bei 20% der Zellen mit Kinetochor-Signal das Bub3-Kinetochor-Signal nur noch schwach zu sehen.

Einerseits bestätigen diese Ergebnisse, dass nach SAC-Aktivierung neben Mad1 auch Mad2 und Bub3 am unbesetzten Kinetochor lokalisieren und andererseits konnte erstmals eine Mad3-Kinetochor-Lokalisation gezeigt werden. Zusätzlich lässt sich aus den Lokalisationsstudien schließen, dass Cdc5 die Lokalisation von Mad1, Mad2 und Bub3 aber nicht von Mad3 am unbesetzten Kinetochor verringert.