Mutation der N-terminalen Phosphorylierungsstellen hat keinen Einfluss auf

Um die Funktion der N-terminalen Phosphorylierung von Cdc5 zu identifizieren, wurde zunächst deren Einfluss auf die Instabilität von Cdc5 getestet, da der N-terminale Bereich von Cdc5 dessen Instabilität vermittelt (siehe 4.1 und 4.2; Shirayama et al., 1998). Dazu wurde das Fusionsprotein Cdc5N80pm1/2-GFP durch Fusion der 80 N-terminalen Aminosäuren von Cdc5pm1/2 an GFP erzeugt und das DNA-Konstrukt unter die Kontrolle des GAL1-Promotors gestellt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Mutation der Phosphorylierungsstellen in der G1-Phase keinen Einfluss auf die Instabilität von Cdc5N80-GFP hatten (Gaub, 2010). Da die Phosphorylierung der N-terminalen Domäne vermutlich Cdk1 abhängig ist und die Cdk1-Aktivität in der G1-Phase gering ist (Enserink und Kolodner, 2010), wurde die Stabilität von Cdc5N80-GFP und Cdc5N80pm1/2-GFP nun bei hoher Cdk1-Aktivität in der M-Phase überprüft. Dazu wurden die Zellen zuerst durch Zugabe des Paarungspheromons α-Faktor in der G1-Phase synchronisiert und anschließend durch Zugabe von Nocodazol in den M-Phase-Arrest entlassen. Beim Entlassen der Zellen aus der G1-Phase wurde zusätzlich die Expression der Fusionsproteine für 30 min induziert. Nach der Repression des Promotors wurden Proben für die Westernblot-Analyse geerntet, um die Proteinlevel zu verfolgen. Zusätzlich wurden während des gesamten Experiments Proben für die Durchflusszytometrie genommen, um die Snychronität der Zellen und den Arrest in der M-Phase zu überprüfen.

Die DNA-Profile in Abbildung 4.12 A und B zeigen, dass die Zellen in beiden Fällen zuerst vollständig in der G1-Phase arretierten (α) und 30 min nach der Repression des Promotors die M-Phase erreichten. Der M-Phase-Arrest wurde über die weitere Dauer des Experiments aufrecht erhalten. Im Gegensatz zur G1-Phase war Cdc5N80-GFP in der M-Phase stabil. Die Expression von Cdc5N80-GFP stieg bis 30 min nach Beendigung der Transkription weiter an.

Auch nach 150 min konnte immer noch ein starkes Signal detektiert werden (Abb. 4.12 A).

Gleiches galt auch für die Phospho-Mutante Cdc5N80pm1/2-GFP. Anfangs nahm das Signal zu (30 min) und blieb dann über die Dauer des Experiments konstant (Abb. 4.12 B).

Daraus und aus der Tatsache, dass die benachbarten RXXL-Sequenzen indirekt als Teil einer NLS zur Instabilität von Cdc5 beitragen (siehe 4.2), lässt sich schließen, dass die

Phosphorylierungen im N-terminalen Bereich keinen Einfluss auf die Instabilität von Cdc5 haben.

Abbildung 4.12 Instabilität von Cdc5N80pm1/2-GFP in der M-Phase

Die Zellen der Stämme (A) W9250 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-tCYC1-URA3) und (B) W9703 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80pm1/2-GFP-tCYC1-URA3) wurden in XYR bei 25°C angezogen und durch Zugabe des Paarungspheromons α-Faktor (50 ng/ml) während der exponentiellen Wachstumsphase in G1 arretiert. Nach 3 h Arrest wurden 0,25 OD₆₀₀ Zellen für die Durchflusszytometrie mit 70% Ethanol fixiert, die restlichen Zellen in XYR mit Nocodazol (7,5 µg/ml) umgesetzt, der GAL1-Promotor für 30 min induziert und danach der 0-Wert geerntet. Dann wurden die übrigen Zellen in XYD mit Nocodazol (7,5 µg/ml) umgesetzt, um den Promotor wieder zu reprimieren. Es wurden Proben 30, 60, 90, 120 und 150 min nach der Repression des GAL1-Promotors für die Westernblot-Analyse sowie die Durchflusszytometrie geerntet und aufgearbeitet. In der Westernblot-Analyse wurden die Cdc5N80-GFP-Derivate über ihr N-terminales MYC3-Epitop mit dem α-myc-Antikörper 9E10 und Tubulin (Tub2) mittels α-Tub2-Serum nachgewiesen. Tubulin diente dabei als Ladekontrolle. Anhand der Durchflusszytometrie wurde der DNA-Gehalt der Zellen gemessen und der vollständige Arrest in der G1- und der M-Phase überprüft (1C = G1-Phase, 2C = M-Phase).

4.3.3 Mutation der N-terminalen Phosphorylierungsstellen hat keinen Einfluss auf die Lokalisation von Cdc5

Als Nächstes wurde der Einfluss der N-terminalen Phosphorylierung auf die Lokalisation von Cdc5 überprüft, da der N-terminale Bereich von Cdc5 zur Lokalisation im Zellkern beiträgt (siehe 4.2). Dazu wurde die Lokalisation von GFP-fusioniertem endogenem Cdc5

(eCdc5-GFP) und von Cdc5-GFP-Derivaten am konfokalen Mikroskop untersucht. Zur Visualisierung der SPK wurde die SPK-Komponente Spc42 mit einer C-terminalen 3mCherry-Fusion verwendet.

Abbildung 4.13 Lokalisation der Cdc5-GFP-Derivate während des Zellteilungszyklus

Die Zellen der Stämme (A) W10353 (CDC5-GFP-CaURA3 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1), (B) W10787 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-CDC5-GFP-tADH1-LEU2 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1), (C) W10788 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2-GFP-tADH1-LEU2

trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1) und (D) W10789 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2D-GFP-tADH1-LEU2 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1) wurden in XYD bei 25°C angezogen und während der exponentiellen Wachstumsphase geerntet. Anschließend wurden die Zellen mit SD++-Agarose für die Mikroskopie präpariert. Es wurden Z-Stapel aus 10 Ebenen mit einer Distanz von je 0,5 µm und einer Belichtungszeit von 200 ms aufgenommen. Endogenes Cdc5-GFP wurde mit 40% und Cdc5-GFP-Derivate mit 20% des 488 nm Lasers sowie Spc42-3mCherry mit 75% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und für die jeweiligen Zellzyklusstadien repräsentative Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm).

Für den Vergleich der Expressionslevel mittels Westernblot-Analyse (E) wurden die Stämme W10425 (CDC5-GFP-CaURA3), W10653 Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-CDC5-GFP-tADH1-LEU2), W10657 (cdc5-Δ::HIS3MX6 cdc5pm1/2-GFP-tADH1-LEU2) und W10661 (cdc5-(cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2D-GFP-tADH1-LEU2) in XYD bei 25°C angezogen, in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und aufgearbeitet. Der Nachweis von endogenem Cdc5-GFP und der Cdc5-GFP-Derivate erfolgte durch das α-Cdc5-Serum. Tubulin (Tub2) diente als Ladekontrolle und wurde anhand des α-Tub2-Serums detektiert.

In Abbildung 4.13 ist die Lokalisation von eCdc5-GFP und den Cdc5-GFP-Derivaten während des Zellteilungszyklus gezeigt. In der G1-Phase konnte weder eCdc5-GFP noch eines der Cdc5-GFP-Derivate detektiert werden, da Cdc5 in der G1-Phase instabil ist.

Während des Zellzyklus war eCdc5-GFP ab dem Beginn der S-Phase am SPK zu sehen. In der frühen M-Phase wurde eCdc5-GFP zusätzlich im Zellkern sichtbar und in der späten M-Phase meist auch am Knospenhals (Abb. 4.13 A). Die Lokalisation von Cdc5-GFP, Cdc5pm1/2-GFP und Cdc5pm1/2D-GFP unterschied sich nicht von der des eCdc5-GFP (Abb. 4.13 A – D). Die Cdc5-GFP-Derivate waren ebenfalls phasenspezifisch am SPK, im Zellkern und am Knospenhals zu detektieren. Da das Signal von eCdc5-GFP relativ schwach war, wurde bei den Cdc5-GFP-Derivaten eine stärkere Expression gewählt, die anhand der Westernblot-Analyse ermittelt wurde (Abb. 4.13 E).

Die Ergebnisse der Mikroskopie-Daten zeigen, dass die Mutation der N-terminalen Cdk1-Phosphorylierungsstellen die Lokalisation von Cdc5 nicht beeinflusst.