Degradation von Cdc5N80-GFP ist im Nukleoplasma effektiver

Da sich gezeigt hat, dass neben den Degradationssignalen die Kernlokalisation einen wichtigen Beitrag für den APC^Hct1-vermittelten Abbau von Cdc5N80-GFP in der G1-Phase leistet, war es von Interesse zu klären, ob auch die Lokalisation innerhalb des Nukleus einen Einfluss auf den Abbau haben könnte. Um dies zu testen, wurde Cdc5N80-GFP an Komponenten der Substrukturen des Zellkerns fusioniert. Zum einen an Chromatin, genauer gesagt an die Histone H2B und H1, und zum anderen an die Nukleolus-Komponente Hmo1.

Wie zuvor wurde zuerst die Lokalisation der verschiedenen Fusionsproteine in den Substrukturen des Zellkerns überprüft. Als Zellkernmarker wurde mCherry-NLS, als Histonmarker H2A-yEmRFP und als Nukleolusmarker Nop56-3mCherry verwendet.

Die Mikroskopie-Daten der Histon-Fusionen zeigten zum einen, dass die Histone H2B und H1 unterschiedlich im Zellkern lokalisierten und zum anderen, dass die Fusionsproteine entsprechend den Histonen lokalisierten. Das Signal von Cdc5N80-GFP-H2B war deutlich kompakter als das von Cdc5N80-GFP-H1 und auch als das von mCherry-NLS, welches das Nukleoplasma widerspiegelt (Abb. 4.8 A und B, 1.Reihe). Das Gleiche galt auch für GFP-H2B und GFP-H1, die als Kontrollen dienten (Abb. 4.8 C und D). Außerdem

co-lokalisierte H2B exakt mit H2A-yEmRFP, wohingegen das Cdc5N80-GFP-H1-Signal weitflächiger war als das von H2A-yEmRFP (Abb. 4.8 A und B, 2.Reihe).

Die Mikroskopie-Daten der Nukleolus-Fusion zeigten, dass der größte Teil des Cdc5N80-GFP-Hmo1-Signals als die für den Nukleolus typische halbmondförmige Struktur vorlag.

Außerdem co-lokalisierte es mit der Nukleolus-Komponente Nop56-3mCherry. Zusätzlich zu der Nukleolus-Lokalisation war Cdc5N80-GFP-Hmo1 leicht im Nukleoplasma zu detektieren (Abb. 4.8 E).

Abbildung 4.8 Co-Lokalisation von Cdc5N80-GFP-Derivaten mit Kern-, Histon- und Nukleolus-Markern Die Zellen der Stämme (A) W12364 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HTB1-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) und W12246 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HTB1-tCYC1-URA3 HTA2-yEmRFP-HIS3MX6), (B) W12365 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HHO1-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) und W12247 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HHO1-tCYC1-URA3 HTA2- yEmRFP-HIS3MX6) und (E) W11889 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HMO1-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) und W11986 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HMO1-tCYC1-URA3

NOP56-3mCherry-tCYC1-TRP1) wurden in XYR angezogen, der GAL1-Promotor für 60 min mit 2% Galaktose in der exponentiellen Wachstumsphase bei 25°C induziert und anschließend für die Mikroskopie präpariert (SRG++-Agarose). Die Zellen der Stämme (C) W12406 (ura3::pTEF2-GFP-HTB1-tCYC1-URA3 tCYC1-TRP1) und (D) W12407 (ura3::pTEF2-GFP-HHO1-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) wurden in XYD bei 25°C angezogen und in der exponentiellen Wachstumsphase mit SD++-Agar für die Mikroskopie präpariert. Es wurden Z-Stapel bestehend aus 10 Ebenen mit einer Distanz von 0,5 µm und einer Belichtungszeit von 200 ms aufgenommen. Cdc5N80-GFP-Derivate, GFP-H2B und GFP-H1 wurden mit 5% des 488 nm Lasers, mCherry-NLS und H2A-yEmRFP mit 15% und Nop56-3mCherry mit 10% des 561 nm Lasers detektiert. Die aufgenommenen Z-Stapel wurden mit der Axio Vision-Software projiziert und je eine repräsentative M-Phase-Zelle dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm).

Anschließend wurde wie zuvor die Instabilität der Histon- und des Nukleolus-Fusionsproteins in der G1-Phase überprüft. Die Westernblot-Analyse der beiden Histon-Fusionsproteine Cdc5N80-GFP-H2B und Cdc5N80-GFP-H1 zeigte, dass 30 min nach Repression des Promotors noch ein Signal detektiert werden konnte (Abb. 4.9 A und B), wohingegen zu diesem Zeitpunkt kein Cdc5N80-GFP-NLS-Signal mehr nachzuweisen war (Abb. 4.7 B).

Daraus lässt sich schließen, dass Cdc5N80-GFP-H2B und Cdc5N80-GFP-H1 geringfügig stabilisiert gegenüber Cdc5N80-GFP-NLS waren. Die Stabilisierung durch die Fusion an H1 war etwas schwächer als die durch H2B. Trotz etwa gleicher Expressionslevel in asynchron gewachsenen Zellen (Abb. 4.9 E) war der 0-Wert von Cdc5N80-GFP-H1 etwas geringer als der von Cdc5N80-GFP-H2B (Quantifizierung nicht gezeigt) und die Bande nach 30 min war nur noch schwach zu sehen (Abb. 4.9 B). Die relative Abnahme der Signale war jedoch ziemlich ähnlich (Abb. 4.9 D). Der geringe Unterschied in der Stabilität der Histon-Fusionen könnte möglicherweise durch die unterschiedliche Zugänglichkeit aufgrund der Struktur der Nukleosomen erklärt werden, da H2B als Teil des Nukleosomen-Oktamers stärker kompaktiert wird als H1 (siehe Abb. 4.8 C und D).

Die Fusion von GFP an Hmo1 beeinflusste ebenfalls die Instabilität von Cdc5N80-GFP. Das Cdc5N80-GFP-Hmo1-Signal war 45 min nach der Repression des GAL1-Promotors noch schwach zu detektieren (Abb. 4.9 C). Daraus lässt sich schließen, dass die Stabilisierung durch Hmo1 deutlicher ist als die durch die Histon-Fusionen. Dies zeigte auch die Quantifizierung der Signale. Die Abnahme von Cdc5N80-GFP-Hmo1 verlief etwas langsamer als die bei Cdc5N80-GFP-NLS und den Histon-Fusionen (Abb. 4.9 D).

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass im Gegensatz zum Zytoplasma die Substrukturen des Zellkerns, wie der Nukleolus und das Chromatin für den APC^Hct1 grundsätzlich zugänglich sind, aber den Abbau etwas verzögern.

Abbildung 4.9 Lokalisation in Substrukturen des Zellkerns verzögert den Abbau in G1

Die Zellen der Stämme (A) W12235 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HTB1-tCYC1-URA3), (B) W12236 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HHO1-tCYC1-URA3) und (C) W11831 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HMO1-tCYC1-ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-HHO1-tCYC1-URA3) wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert, wie in Abb. 4.4 beschrieben. Das G1-Abbau-Experiment mit anschließender Westernblot-Analyse und Durchflusszytometrie, die Quantifizierung der Abbaukurven (D) sowie der Vergleich der Expressionslevel von Cdc5N80-GFP-NLS und den Cdc5N80-GFP-Derivaten in asynchronen Zellen (E) wurden ebenfalls wie in Abb. 4.4 durchgeführt. Der Nachweis der Cdc5N80-GFP-Derivate erfolgte über ihr N-terminales MYC3-Epitop mit dem α-myc-Antikörper 9E10. Tubulin diente als Ladekontrolle und wurde mit dem α-Tub2-Serum nachgewiesen.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der Cdc5N80-GFP-Derivate, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 nicht nur notwendig sondern auch hinreichend für die APC^Hct1-vermittelte Degradation ist. Die KEN-Box ist das entscheidende Degron in Cdc5 und die D-Boxen tragen als Teil einer NLS indirekt zur Instabilität bei. Neben der Erkennung des Abbausignals spielt auch die Lokalisation im Zellkern, genauer gesagt im Nukleoplasma, eine wichtige Rolle bei der Degradation in der G1-Phase.