Genetische Interaktionen von cdc5mp1/2

Da weder ein Einfluss der Phoshorylierungen im N-terminalen Bereich auf die Stabilität noch auf die Lokalisation von Cdc5 gezeigt werden konnte, wurde als Nächstes die Ursache des beobachteten Phänotyps der cdc5pm1/2-Mutante anhand von genetischen Interaktionsstudien analysiert.

4.3.4.1 Synthetische Letalität von cdc5pm1/2 mit clb2-Δ und CDC14^HA10

Cdc5 und Cdk1 sind wichtige Regulatoren des Zellzyklus und beeinflussen sich gegenseitig in der Aktivität. Cdk1 aktiviert nicht nur Cdc5, sondern phosphoryliert Cdc5-Substrate, wodurch die Bindung der Substrate durch Cdc5 erleichtert wird. Cdc5 ist sowohl an der Aktivierung der Cdk1 als auch an deren Inaktivierung beim Austritt aus der Mitose beteiligt (Lee et al., 2005b; Mortensen et al., 2005; Archambault und Glover, 2009). Um die genetische Interaktion von cdc5pm1/2 mit clb2-Δ zu untersuchen, wurden die Mutanten durch Kreuzung kombiniert und die Lebensfähigkeit der Doppelmutante clb2-Δ cdc5pm1/2 anhand einer Tetradenanalyse überprüft.

Die Abbildung 4.14 zeigt, dass die clb2-Δ Mutante (2) geringfügig schlechter wuchs als Wildtyp-Zellen, wohingegen cdc5-Δ CDC5-Zellen (K) im Wachstum nicht eingeschränkt waren. Die Doppelmutante clb2-Δ cdc5-Δ CDC5 (D) war lebensfähig, aber wuchs noch schlechter als die Einzelmutante clb2-Δ. Der Phänotyp von cdc5-Δ cdc5pm1/2 wurde durch clb2-Δ noch weiter verstärkt. Die Doppelmutante clb2-Δ cdc5-Δ cdc5pm1/2 war nicht mehr lebensfähig (Abb. 4.14 rechts).

Abbildung 4.14 Genetische Interaktion von cdc5pm1/2 mit clb2-Δ

Die Stämme W8394 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9) und W8396 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) wurden mit dem Stamm K1890 (clb2-Δ::LEU2) gekreuzt und anschließend einer Tetradenanalyse unterzogen. Die haploiden Nachkommen wurden auf einer XYD-Platte vereinzelt und auf ihren Genotyp hin untersucht.

Eine weitere wichtige Funktion von Cdc5 als Bestandteil der Signalwege FEAR und MEN am Ende der Mitose ist es, Cdc14 zu aktivieren. Außerdem ist bekannt, dass beeinträchtigtes Cdc14 synthetisch letal mit cdc5-1 Mutanten und auch clb2-Δ Mutanten ist (Jaspersen et al., 1998; Yuste-Rojas und Cross, 2000; Rahal und Amon, 2008). Cdc14^HA10 ist funktionell beeinträchtigt (Geil, 2008) und wurde verwendet, um die genetische Interaktion von cdc5-Δ cdc5pm1/2 mit einer cdc14-Mutante zu testen.

CDC14^HA10 (14) hatte keinen sichtbaren Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 4.15). Die Doppelmutante CDC14^HA10 cdc5-Δ CDC5 (D) wuchs zunehmend wie die

CDC14^HA10-Zellen und WT. Dagegen war auch in diesem Fall die Doppelmutante CDC14^HA10 cdc5-Δ cdc5pm1/2 synthetisch letal (Abb. 4.15 rechts).

Abbildung 4.15 Genetische Interaktion von cdc5pm1/2 und CDC14^HA10

Die Stämme W8393 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9) und W8395 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) wurden mit dem Stamm W4754 (CDC14-HA10-LEU2) gekreuzt und anschließend einer Tetradenanalyse unterzogen. Die haploiden Nachkommen wurden auf einer XYD-Platte vereinzelt und auf ihren Genotyp hin untersucht.

Auch wenn kein Einfluss auf die Stabilität und die Lokalisation beobachtet werden konnte, lässt sich aufgrund der synthetischen Letalität von cdc5pm1/2 mit clb2-Δ und CDC14^HA10 annehmen, dass die N-terminalen Phosphorylierungen sehr wohl einen Einfluss auf die biologische Funktion von Cdc5 haben.

4.3.4.2 Überexpression von Cdc14 supprimiert den cdc5pm1/2-Phänotyp

Eine mögliche Erklärung des Phänotyps der cdc5pm1/2-Mutante könnte eine verminderte Aktivierung von Cdc14 am Ende der Mitose sein. Da bekannt ist, dass erhöhte Mengen an Cdc14 das Wachstum der cdc5-1 Mutante bei 37°C verbessern (Jaspersen et al., 1998), wurde die Auswirkung von erhöhten Mengen an Cdc14 in der cdc5pm1/2-Mutante überprüft. Dazu wurde das Wachstum mittels Tetradenanalyse und anschließendem Wachstumstest sowie das DNA-Profil der Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert.

Die Tetradenanalyse zeigte, dass erhöhte Mengen an Cdc14 (14) keinen Einfluss auf das Wachstum von WT-Zellen hatten (Abb. 4.16 A). Auch die durch CDC5 komplementierten cdc5-Δ Zellen wuchsen mit erhöhten Mengen an Cdc14 (D) wie WT (Abb. 4.16 A links).

Interessanterweise wuchsen auch cdc5-Δ cdc5pm1/2-Zellen wieder fast wie WT, wenn sie mehr Cdc14 exprimierten (D, Abb. 4.16 A rechts).

Dieses Ergebnis wurde durch den Vergleich des Wachstums von cdc5-Δ cdc5pm1/2-Stämmen mit endogenen Mengen und erhöhten Mengen von Cdc14 verdeutlicht. In Abbildung 4.16 B ist gezeigt, dass bei niedrigen Temperaturen sowohl cdc5pm1/2-Mutanten als auch cdc5-1 Mutanten durch höheren Cdc14-Level zunehmend wie WT-Zellen wuchsen. Bei 37°C konnte

das verbesserte Wachstum ebenfalls beobachtet werden, allerdings wuchsen die Zellen deutlich schlechter als bei niedrigeren Temperaturen.

Abbildung 4.16 Cdc14-Überexpression supprimiert den Phänotyp von cdc5pm1/2-Mutanten

(A) Die Stämme W8394 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9) und W8396 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) wurden mit dem Stamm W9730 (ura3::pCDC14-CDC14-GFP-tCYC1-URA3) gekreuzt und anschließend einer Tetradenanalyse unterzogen. Die haploiden Nachkommen wurden auf ihren Genotyp hin untersucht.

(B) Um das Wachstum der Stämme W9763 WT#1 tCYC1-URA3), W10318 (CDC14-GFP-tCYC1-URA3 Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9), W10319 (CDC14-GFP-(CDC14-GFP-tCYC1-URA3 cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9), W10510 (CDC14-GFP-tCYC1-URA3 cdc5-1), W10511 (ura3::pCDC14-CDC14-GFP-tCYC1-URA3 cdc5-1), W10514 (ura3::pCDC14-CDC14-GFP-tCYC1-URA3 Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9), W10515 (ura3::pCDC14-CDC14-GFP-tCYC1-URA3 cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) und W9730 WT#2 (ura3::pCDC14-CDC14-GFP-tCYC1-URA3) zu testen, wurden die Zellen über Nacht bei 25°C kultiviert. Anschließend wurden Verdünnungsreihen

ausgehend von 1 OD₆₀₀/ml in 1:10er Schritten bis 1 x 10^-5 OD₆₀₀/ml hergestellt und auf XYD-Platten aufgebracht. Die Platten wurden 2 Tage bei 25°C, 30°C und 37°C inkubiert.

(C) Für die Bestimmung des DNA-Gehalts, wurden die Zellen in XYR bei 25°C kultiviert und in ihrer exponentiellen Wachstumsphase mit 70% Ethanol fixiert. Die DNA wurde mit Sytox Green gefärbt und der DNA-Gehalt am Durchflusszytometer bestimmt (1C = G1-Phase, 2C = M-Phase, 4C = Re-Replikation).

Zudem bestätigten die Analyse der DNA-Profile die Ergebnisse aus den Wachstumsstudien.

Das sichtbar veränderte DNA-Profil von cdc5pm1/2-Mutanten bei endogener Cdc14-Menge war durch überexprimiertes Cdc14 nicht mehr zu sehen. Das DNA-Profil war vergleichbar mit dem der WT- und der CDC5-Zellen. Gleiches galt auch für die cdc5-1 Mutante (Abb. 4.16 C).

Zusammengefasst lässt sich aus den genetischen Interaktionsstudien schließen, dass die N-terminalen Phosphorylierungen wichtig für die biologische Funktion von Cdc5 sind und vermutlich für die Cdc14-Aktivierung eine Rolle spielen.