Cdc5N80 ist hinreichend für Instabilität und Lokalisation im Zellkern

DNA-Konstrukt zunächst unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors pTEF2 exprimiert und anschließend das Fusionsprotein Cdc5N80-GFP am konfokalen Mikroskop verfolgt. Zur Visualisierung des Zellkerns wurde ein stabiles mCherry-NLS Fusionsprotein (siehe 6.3.3) verwendet. Es wurden Zeitrafferaufnahmen im Abstand von fünf Minuten für die Dauer von zwei Stunden gemacht und anschließend die Signalintensitäten quantifiziert.

Abbildung 4.3 Der N-terminale Bereich von Cdc5 ist hinreichend für Instabilität in der G1-Phase und Lokalisation im Zellkern

Der Abbau des Fusionsproteins Cdc5N80-GFP wurde in vivo mittels live-cell imaging verfolgt (A). Dazu wurden die Zellen der Stämme W9312 (leu2::pTEF2-MYC3-cdc5N80-GFP-tCYC1-LEU2 ura3::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-URA3) und W10982 (leu2::pTEF2-MYC3-cdc5N80-GFP-tCYC1-LEU2 ura3::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-URA3 hct1-4::HIS3) in XYD bei 25°C angezogen und in der exponentiellen Wachstumsphase mit SD++-Agar für die Mikroskopie präpariert. Für 2 h wurde alle 5 min ein Z-Stapel aus 10 Ebenen mit einer Distanz von je 0,5 µm und einer Belichtungszeit von 200 ms aufgenommen. Cdc5N80-GFP wurde mit 2% des 488 nm Lasers und mCherry-NLS mit 12% des 561 nm Lasers detektiert. Die Z-Stapel wurden mit Image J projiziert (maximale Intensität) und ausgewählte Zeitpunkte dargestellt. Zur Quantifizierung der Signale, wurden die Signale addiert und der Hintergrund subtrahiert. Die Diagramme zeigen die Signalintensitäten der jeweiligen Tochterzellen (Pfeil) in Abhängigkeit der Zeit.

Zur Bestimmung des Abbaubeginns von Cdc5N80-GFP (B) wurden die Zellen des Stammes W11995 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-tCYC1-URA3 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1) in XYR bei

25°C angezogen und der GAL1-Promotor für 60 min mit 2% Galaktose in der exponentiellen Wachstumsphase induziert. Anschließend wurden die Zellen in XYD gewaschen und mit SD++-Agarose mikroskopiert (488 nm Laser: 5%, 561 nm Laser: 50%). Die Zellen des Stammes W10990 (CDC14-GFP-tCYC1-URA3 trp1::pSPC42-SPC42-3mCherry-tCYC1-TRP1) wurden in XYD angezogen und ebenfalls in der exponentiellen Wachstums-phase für die Mikroskopie präpariert (488 nm Laser: 15%, 561 nm Laser: 75%). Es wurden Zeitrafferaufnahmen (t = 5; z = 10; d = 0,5 µm) gemacht und der Abbaubeginn bzw. der Beginn der Cdc14-Freisetzung anhand des Abstandes zwischen den beiden Spindelpolkörpern bestimmt. Es wurden je 10 Zellen quantifiziert und die Ergebnisse in einem Boxplot-Diagramm verglichen.

Zur Analyse des Abbaus von Cdc5N80-GFP mittels Westernblot (C) wurden die Zellen der Stämme W9248 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-GFP-tCYC1-URA3) und W9250 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-tCYC1-URA3) in XYR bei 25°C angezogen und der GAL1-Promotor für 2 h mit 2% Galaktose in der exponentiellen Wachstumsphase induziert. Anschließend wurden die Zellen geerntet (cyc). Für die Expression in der G1-Phase wurden die exponentiell wachsenden Kulturen 3 h mit α-Faktor (50 ng/ml) behandelt und anschließend der GAL1-Promotor wie zuvor induziert (G1). In der Westernblot-Analyse wurden GFP und Cdc5N80-GFP über ihr N-terminales MYC3-Epitop mit dem α-myc-Antikörper 9E10 und Tubulin (Tub2) mittels α-Tub2-Serum nachgewiesen. Tubulin diente dabei als Ladekontrolle und die aufgetragenen Proben wurden auf das jeweilige Tubulin-Signal normiert.

Die Mikroskopie-Daten zeigten, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 einen Einfluss auf die Lokalisation von GFP hatte. Das Fusionsprotein Cdc5N80-GFP lokalisierte ausschließlich im Zellkern (Abb. 4.3 A), wohingegen GFP hauptsächlich im Zytoplasma zu detektieren war (Abb. 4.5 A). Aufgrund der Lokalisation des Fusionsproteins im Zellkern lässt sich folgern, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 neben den Degradationssignalen eine NLS enthält.

Zusätzlich zeigten die Mikroskopie-Daten, dass das Fusionsprotein Cdc5N80-GFP während des Zellteilungszyklus wie Cdc5 fluktuierte. Das Signal verschwand trotz konstitutiver Expression, sobald die Zellen die G1-Phase erreichten und wurde wieder sichtbar, als sie in den nächsten Teilungszyklus eintraten (Abb. 4.3 A links). Besonders gut ließ sich diese Fluktuation bei Tochterzellen beobachten (Abb. 4.3 Pfeil), weil deren G1-Phase länger andauert, um die nötige Zellgröße für das Eintreten in den Zellzyklus zu erreichen.

Da die Degradation von Cdc5 durch den APC und dessen Co-Aktivator Hct1 vermittelt wird (Charles et al., 1998), wurde untersucht, ob es sich bei der Abnahme des Cdc5N80-GFP-Signals ebenfalls um eine Hct1-vermittelte Degradation handelt. Dazu wurde die Instabilität von Cdc5N80-GFP in hct1-Δ Mutanten getestet (Abb. 4.3 A rechts). In der hct1-Δ Mutante konnte Cdc5N80-GFP während der Mitose sowie in der G1-Phase detektiert werden. Da Cdc5N80-GFP in hct1-Δ Mutanten nicht mehr zellzyklusspezifisch reguliert wurde, sondern stabilisiert war, lässt sich daraus schließen, dass der Abbau von Cdc5N80-GFP über APC^Hct1 vermittelt wird.

Als Nächstes wurde der Beginn der APC^Hct1-vermittelten Degradation von Cdc5N80-GFP analysiert. Dazu wurde die Expression von Cdc5N80-GFP unter die Kontrolle des induzierbaren Promotors pGAL1 gestellt. Die Expression wurde für 60 min mit 2% Galaktose induziert und anschließend der Abbau von Cdc5N80-GFP am Mikroskop verfolgt. Zur zeitlichen Einordnung der Degradation wurde der Abstand der SPK gemessen und die Freisetzung der Phosphatase Cdc14 aus dem Nukleolus in den Zellkern und das Zytoplasma betrachtet. Das Auftauchen von Cdc14 am dSPK wurde als Beginn der Cdc14-Freisezung gewertet. Die Cdc14-Freisetzung begann, wenn etwa 70% des maximalen Abstands der SPK erreicht waren. Dagegen begann der Abbau von Cdc5N80-GFP etwas später, wenn die Entfernung der SPK ca. 80% betrug (Abb. 4.3 B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Degradation von Cdc5 ausschließlich durch Hct1 vermittelt wird, da der Abbau erst nach der Freisetzung von Cdc14 begann, die für die Aktivierung des APC^Hct1 notwendig ist (Jaspersen et al., 1999).

Zudem konnte auch mittels Westernblot-Analyse gezeigt werden, dass Cdc5N80-GFP im Gegensatz zu GFP in der G1-Phase sehr instabil ist. Dazu wurden Cdc5N80-GFP und GFP in asynchron wachsenden und in G1-arretieren Zellen 120 min durch Induktion des GAL1-Promotors überexprimiert und anschließend die Proteinlevel im Westernblot detektiert. Trotz Überexpression von Cdc5N80-GFP konnte in G1-Zellen im Vergleich zu asynchron wachsenden Zellen (cyc) kaum ein sichtbares Signal detektiert werden. Im Gegensatz dazu war das GFP-Signal der asynchronen Kultur etwa genauso stark wie das der G1-Zellen (Abb.

4.3 C).

Anhand dieser Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 nicht nur notwendig, sondern auch hinreichend für die Instabilität in der späten Mitose sowie der G1-Phase ist und dass dieser eine NLS enthält.