6.5.1 Herstellung von Proteinlysaten aus Hefezellen
Proteinextrakte wurden durch einen mechanischen Aufschluss der Hefezellen mit Hilfe von Glasperlen hergestellt. Dazu wurden mindestens 12 OD600-Hefezellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur in Falcon-Röhrchen abzentrifugiert (2000 Upm, 2 min) und das Pellet in 1 ml eiskaltem Wasser aufgenommen. Nach dem Überführen in ein Schraubdeckelgefäß mit 0,3 g Glasperlen, wurden die Zellen bei -70°C schockgefroren. Für den Zellaufschluss wurden die Proben dann auf Eis aufgetaut, 150 μl Puffer 3 mit β-Glycerolphosphat (60 mM) zugegeben und im Kühlraum in der Retsch-Mühle 5 min bei maximaler Frequenz geschüttelt.
Anschließend wurden die Zellfragmente 3 min bei 14000 Upm und 4°C abzentrifugiert. Vom Überstand wurden 50 µl mit 50 µl 2 x Lämmli-Auftragspuffer gemischt und für 10 min bei 100°C inkubiert.
6.5.2 Proteinkonzentrations-Bestimmung nach Bradford
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration eines Extrakts wurden 5 µl des Lysat-Überstandes 1:1000 in Wasser verdünnt. Von der Verdünnung wurden 500 µl 1:2 mit Bradford-Reagenz versetzt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur von 5 min wurde die OD595, die als Maß für die Proteinkonzentration dient, gemessen. Als Referenz für die photometrische Messung wurde ein 1:2 in Wasser verdünntes Bradford-Reagenz verwendet. Durch die Bestimmung der relativen Proteinkonzentrationen war eine gleichmäßige Probenbeladung des SDS-Gels möglich.
6.5.3 Immunpräzipitation
Mittels Immunpräzipitation (IP) können gezielt einzelne Proteine aus einem Proteinrohextrakt aufgereinigt werden. Dazu wird ein Antikörper eingesetzt, der spezifisch gegen das Zielprotein oder die Epitopmarkierung des Zielproteins gerichtet ist. Protein A aus Staphylococcus aureus bindet spezifisch die schwere Kette eines Antikörpers. Durch Kopplung von Protein A an eine Agarose-Matrix kann somit das Zielprotein präzipitiert werden. Proteine, die mit dem Zielprotein interagieren, werden in der IP ebenfalls präzipitiert (Co-Immunpräzipitation, CoIP). Mittels anschließender Westernblot-Analyse lässt sich dann die Interaktion der Proteine durch Detektion des Co-Präzipitats nachweisen.
Für die Durchführung der IP wurden 50 OD600-Zellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur in mehreren Falcon-Röhrchen geerntet (2000 Upm, 2 min) und das Pellet in 1 ml kaltem Wasser aufgenommen. Die Zellsuspension aus einem Falcon wurde in ein Schraubdeckelgefäß mit 0,6 g Glaskügelchen überführt, kurz zentrifugiert und das Wasser abgenommen. Falls die geernteten Zellen nicht sofort weiter verarbeitet worden sind, wurden sie bei -70°C eingefroren und aufbewahrt. Es wurde stets auf Eis gearbeitet, um die Degradation von Proteinen durch Proteasen zu vermeiden.
Zur Herstellung der Proteinrohextrakte wurden die Zellen gegebenenfalls auf Eis angetaut und mit je 300 µl Puffer 3 mit β-Glycerolphosphat (60 mM) versetzt. Der Zellaufschluss erfolgte in der Retsch-Mühle für 5 min bei 4°C und maximaler Geschwindigkeit. Danach wurden die Zellfragmente bei 4°C und 14000 Upm für 10 min abzentrifugiert, die Überstände identischer Ansätze in einem frischen Schraubdeckelgefäß vereinigt und nochmals zentrifugiert (4°C, 14000 Upm, 15 min). Anschließend wurden die Überstände erneut in frische Schraubdeckelgefäße überführt und für eine spätere Westernblot-Analyse 25 µl des Überstands mit 25 µl 2 x Lämmli-Auftragspuffer bei 100°C für 10 min aufgekocht.
Außerdem wurde die Proteinkonzentration mittels Bradford-Methode (siehe 6.5.2) bestimmt, um die Ansätze auf eine gleiche Proteinmenge einzustellen. Es wurden in der Regel 150 – 200 OD595 Protein eingesetzt und auf ein Gesamtvolumen von 500 µl mit Puffer 3 (60 mM β-Glycerolphosphat) aufgefüllt. Dann wurde zu den Proben 100 µl des α-myc-Antikörpers 9E10 gegeben und die Ansätze 2 h bei 4°C inkubiert. Zur Ausfällung der gebildeten Immunkomplexe wurde jeder Ansatz mit 40 µl Protein A-Agarose-Kügelchen versetzt, die zuvor zweimal mit 1 ml Puffer 3 (60 mM β-Glycerolphosphat) gewaschen wurden. Die Ansätze wurden 2 h bei 4°C gerollert. Abschließend wurde das Präzipitat dreimal mit 1 ml Puffer 3 (60 mM β-Glycerolphosphat) gewaschen und nach dem letzten Waschschritt der Überstand mit Hilfe einer Hamilton-Spritze vollständig entfernt. Zu dem Präzipitat wurde 40 µl 1 x Lämmli-Auftragspuffer gegeben und 10 min bei 100°C inkubiert. Die präzipitierten Proteine und deren co-präzipitierten Interaktionspartner wurden in einer nachfolgenden Westernblot-Analyse nachgewiesen.
6.5.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mittels SDS-PAGE können Proteine im elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt werden (Lämmli, 1970). Dies geschieht unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen, da durch SDS und β-Mercaptoethanol sowohl die Sekundärstruktur der Proteine als auch Protein-Protein-Wechselwirkungen zerstört werden. β-Mercaptoethanol
reduziert die Disulfidbrücken, während negativ geladenes SDS durch Anlagerung an die Proteine ihnen eine negative Gesamtladung verleiht. Somit wandern die Proteine unabhängig von ihrer Eigenladung im elektrischen Feld zur Anode, wobei kleine Proteine schneller im Polyacrylamidgel wandern als große Proteine. Die Polyacrylamidgele bestehen aus einem Sammelgel und einem Trenngel (diskontinuierliche SDS-PAGE). Der unterschiedliche pH-Wert der Puffer und die unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen von Sammel- und Trenngel bewirken, dass sich die Proben beim Eintritt in das Trenngel in einer Bande konzentrieren und somit die Auftrennung der Proteine gleichzeitig beginnt.
Als erstes wurde das Trenngel zwischen zwei Glasplatten, die durch einen Gummi abgedichtet wurden, gefüllt und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das Isopropanol entfernt und das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Zur Aussparung der Probentaschen wurde ein Kamm in das Sammelgel gesteckt. Je nach Proteingröße wurde ein 7%iges oder 9%iges Trenngel verwendet. Die Gele wurden stets mit äquivalenten Proteinmengen (1 – 3 OD595 = 15 – 40 µg) beladen. Das aufzutragende Volumen in µl wurde anhand der gemessenen Proteinmengen mittels Bradford-Test (siehe 6.5.2) wie folgt berechnet: 1 OD595 [µl] = 1/gemessene OD595. Als Größenstandard wurde der ColorPlus Proteinmarker von NEB verwendet. Die anschließende Gelelektrophorese wurde mit einer Stromstärke von 15 – 20 mA pro Gel durchgeführt und gestoppt, sobald die blaue Bande des Lämmli-Auftragspuffers das Gel verlassen hat. Anschließend wurde das Trenngel für einen Westernblot weiter verwendet.
6.5.5 Westernblot und immunologischer Nachweis von Proteinen
Die Westernblot-Analyse dient dazu, Proteine spezifisch in Bezug auf ihre Auftrennung im Polyacrylamidgel nachzuweisen. Dabei werden die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert (Towbin et al., 1992) und anschließend mittels Antikörpern detektiert. Dazu wird zunächst ein spezifischer primärer Antikörper an das gewünschte Protein oder dessen fusioniertes Epitop gebunden, an den wiederum ein sekundärer Antikörper bindet, der an einen Infrarot-Farbstoff gekoppelt ist. Mit Hilfe des Odyssey Infrared Imagers (LI-CORE) kann dann die Fluoreszenz des Farbstoffs angeregt und detektiert werden. Das detektierte Fluoreszenzsignal ist proportional zur Proteinkonzentration, wodurch eine quantitative Auswertung möglich ist.
Zum Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran wurde als erstes ein mit Transferpuffer getränktes Whatman GB005 Papier auf die Graphitanode der Elektroblotapparatur gelegt. Als Nächstes folgte die in Transferpuffer getränkte
Nitrocellulose-Membran, dann das ebenfalls in Transferpuffer getränkte Gel und zuletzt ein weiteres, in Transferpuffer getränktes Whatman GB005 Papier. Durch Auflegen der Kathode wurde die Apparatur abgeschlossen. Der Transfer der Proteine erfolgte bei 40 mA pro Gel für 70 – 90 min. Danach wurde die Membran mit Ponceau S gefärbt, um die gleichmäßige Beladung und den Transfer auf die Membran zu überprüfen und zu dokumentieren. Um unspezifische Bindungen des primären Antikörpers zu blockieren, wurde die Membran anschließend für mindestens 1 h in TBS-T Milch (5% Magermilchpulver in TBS-T) geschwenkt. Danach folgte über Nacht die Inkubation der Membran mit dem primären Antikörper in TBS-T Milch bei 4°C auf einer Wippe. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal für je 5 min unter Schwenken bei Raumtemperatur mit TBS-T gewaschen und anschließend mit dem sekundären Antikörper (in TBS-T Milch verdünnt) für mindestens 2 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe abgedunkelt inkubiert. Danach wurde erneut dreimal für 5 min mit TBS-T gewaschen. Der spezifische Nachweis der Proteine erfolgte durch Anregung und Detektion der Fluorophor-gekoppelten Antikörper (700 nm bzw. 800 nm) mit dem Odyssey Infrared Imager der Firma LI-COR. Die Quantifizierung der Signale wurde anschließend mit Hilfe der Odyssey Application Software durchgeführt.