Kernlokalisation von Cdc5N80-GFP ist notwendig für Instabilität

Aufgrund der beobachteten Fehllokalisation von Cdc5N80db1/2-GFP im Zytoplasma wäre es denkbar, dass die Lokalisation die Instabilität in der G1-Phase beeinflusst und dass aufgrund dessen fehllokalisiertes Cdc5N80db1/2-GFP stabiler ist. Um dies zu überprüfen, wurde eine NLS an GFP, Cdc5N80-GFP und die fehllokalisierte D-Box-Mutante Cdc5N80db1/2-GFP fusioniert. Als NLS wurde ein C-terminales Fragment des Transkriptionsfaktors Swi5 (AS 614 – 663 mit S646A) verwendet, da dieser Bereich von Swi5 bereits als NLS beschrieben ist (Moll et al., 1991). Darüber hinaus stellte sich die Frage, ob die Kernlokalisation grundsätzlich für den Abbau in G1 notwendig ist und ob der Kernexport die Proteine vor ihrer Degradation schützen kann. Um dies zu überprüfen wurde neben der NLS eine Kernexportsequenz (NES) an Cdc5N80-GFP fusioniert. Als NES-Sequenz diente der C-terminale Bereich des Kernexportfaktors Nmd3 (AS 441 – 518), der für den Kernexport der großen ribosomalen Untereinheit verantwortlich ist (Gadal et al., 2001). Zunächst wurden die Auswirkungen der NLS- und der NES-Fusion auf die Lokalisation der Fusionsproteine überprüft und als Zellkernmarker mCherry-NLS verwendet. GFP-NLS und die Cdc5N80-GFP-Derivate wurden dazu unter Induktion des GAL1-Promotors für 60 min exprimiert und anschließend mikroskopiert.

Die NLS-Fusion an GFP hatte zur Folge, dass GFP-NLS verstärkt im Zellkern lokalisierte.

GFP-NLS war wie GFP sowohl in der M-Phase als auch in der G1-Phase zu detektieren (Abb. 4.6 A). Da Cdc5N80-GFP bereits ausschließlich im Zellkern akkumulierte, war es nicht verwunderlich, dass auch Cdc5N80-GFP-NLS nur im Kern lokalisierte. Ebenso wie Cdc5N80-GFP, war auch kein Signal von Cdc5N80-GFP-NLS in G1 nachzuweisen (Abb. 4.6 B). Durch die Fusion der NLS-Sequenz an Cdc5N80db1/2-GFP akkumulierte Cdc5N80db1/2-GFP-NLS in mitotischen Zellen nun zum größten Teil im Zellkern und es konnte nur noch eine leichte zytoplasmatische Lokalisation detektiert werden. In G1-Zellen konnte kaum ein GFP-Signal von Cdc5N80db1/2-GFP-NLS nachgewiesen werden (Abb. 4.6 C). Durch die Fusion der NES-Sequenz an Cdc5N80-GFP akkumulierte Cdc5N80-GFP-NES größtenteils im Zytoplasma. Neben M-Phase-Zellen waren auch G1-Zellen mit Cdc5N80-GFP-NES-Signal zu sehen (Abb. 4.6 D).

Abbildung 4.6 Cdc5N80db1/2-GFP-NLS lokalisiert hauptsächlich im Zellkern, Cdc5N80-GFP-NES dagegen im Zytoplasma

Die Zellen der Stämme (A) W12750 (ura3::pGAL1-MYC3-GFP-NLS-tCYC1-URA3 NLS-tCYC1-TRP1), (B) W12632 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-NLS-tCYC1-URA3 mCherry-NLS-tCYC1-TRP1), (C) W12633 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80db1/2-GFP-NLS-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) und (D) W11443 (ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-NES-tCYC1-URA3 trp1::pTEF2-mCherry-NLS-tCYC1-TRP1) wurden unter den gleichen Bedingungen, wie in Abb. 4.5 beschrieben, kultiviert, für die Mikroskopie präpariert und Z-Stapel aufgenommen. Cdc5N80-GFP-NLS und Cdc5N80db1/2-GFP-NLS wurde mit 5% des 488 nm Lasers, GFP-NLS und Cdc5N80-GFP-NES mit 20% des 488 nm Lasers und mCherry-NLS mit 15% des 561 nm Lasers detektiert. Die Z-Stapel wurden mit der Software Axio Vision projiziert und für die jeweiligen Zellzyklusstadien repräsentative Zellen dargestellt (Maßstabsbalken = 5 µm).

Als Nächstes wurde die Stabilität der Fusionsproteine in der G1-Phase untersucht. Wie unter 4.2.2, wurden die Zellen mit α-Faktor in der G1-Phase arretiert und anschließend die Expression induziert. Nach der Repression des GAL1-Promotors wurden die entsprechenden Zeitwerte geerntet und der Abbau der Proteine in der Westernblot-Analyse verfolgt.

Außerdem wurde wie zuvor der vollständige G1-Arrest mittels Durchflusszytometrie überprüft (Abb. 4.7 A – D, 1C = G1-Phase).

Das Signal von GFP-NLS war wie GFP in der G1-Phase stabil und auch noch 75 min nach der Repression des GAL1-Promotors zu detektieren (Abb. 4.7 A und E). Die Abnahme des Signals von Cdc5N80-GFP-NLS verlief genauso wie die von Cdc5N80-GFP. Nach 30 min konnte kein sichtbares Signal von Cdc5N80-GFP-NLS mehr detektiert werden (Abb. 4.7 B und E). Interessanterweise hatte die Fusion der NLS an Cdc5N80db1/2-GFP zur Folge, dass Cdc5N80db1/2-GFP-NLS bereits zu Beginn des Experiments nur noch schwach zu sehen und nach 45 min so gut wie verschwunden war (Abb. 4.7 C und E). Die Abbaukurven in Abbildung 4.7 G und die Quantifizierung der Expressionslevel in Abbildung 4.7 bzw. 4.4 F zeigen, dass der Abbau von Cdc5N80db1/2-GFP-NLS deutlich schneller als der von GFP verlief und dass bereits der Anfangslevel in G1 von Cdc5N80db1/2-GFP-NLS deutlich geringer war. Daraus lässt sich schließen, dass die Stabilisierung von Cdc5N80db1/2-GFP in G1 weitgehend auf die Fehllokalisation zurückzuführen ist.

Dennoch war die Abnahme von Cdc5N80db1/2-GFP-NLS immer noch etwas langsamer als die von Cdc5N80-GFP-NLS (Abb. 4.7 E). Dies lässt sich vermutlich anhand der immer noch bestehenden, aber geringen Unterschiede in der Lokalisation der beiden Fusionsproteine erklären (Abb. 4.6 B und C). Da Cdc5N80-GFP-NLS und GFP-NLS genauso instabil bzw.

stabil wie Cdc5N80-GFP und GFP waren, kann ein möglicher Einfluss der fusionierten NLS auf den Abbau der Fusionsproteine ausgeschlossen werden.

Die Fusion der NES-Sequenz an Cdc5N80-GFP hatte zur Folge, dass Cdc5N80-GFP-NES über die gesamte Dauer des Experiments gut nachzuweisen war (Abb. 4.7 D). Die Quantifizierung der Expressionslevel in asynchronen und G1-arretierten Zellen zeigte, dass Cdc5N80-GFP-NES im Gegensatz zu Cdc5N80-GFP-NLS deutlich stabilisiert war (Abb. 4.7 F). Dennoch konnte anhand der Abbaukurve eine Abnahme des Signals von Cdc5N80-GFP-NES festgestellt werden. Die Abnahme von Cdc5N80-GFP-NES war aber im Vergleich zu Cdc5N80-GFP deutlich geringer und zu Cdc5N80db1/2-GFP etwas geringer (vgl. Abb. 4.7 H und G). Da Cdc5N80-GFP-NES in Cdc5N80 ebenfalls eine NLS enthält, könnte dadurch eine Konkurrenz zwischen Kernimport und Kernexport entstanden sein.

Möglicherweise ist der kurzfristige Kernimport für die Degradation von Cdc5N80-GFP-NES verantwortlich.

Zusammengenommen lassen die Ergebnisse aus der Mikroskopie und den Westernblot-Analysen annehmen, dass der Export aus dem Zellkern Cdc5N80-GFP stabilisiert und dass die Stabilität von Cdc5N80db1/2-GFP größtenteils auf der Fehllokalisation im Zytoplasma beruht. Das bedeutet, dass die D-Boxen im Fall von Cdc5 die Stabilität indirekt als Teil einer

NLS beeinflussen und dass durch die Mutation der beiden RXXL-Sequenzen die NLS im N-terminalen Bereich von Cdc5 beeinträchtigt war.

Abbildung 4.7 Kernlokalisation ist notwendig für den Abbau von Cdc5N80-GFP in G1

Die Zellen der Stämme (A) W12234 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-GFP-NLS-tCYC1-URA3), (B) W12608 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-NLS-tCYC1-URA3), (C) W12609 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80db1/2-GFP-NLS-tCYC1-URA3) und (D) W11546 (MATa bar1-Δ::kanMX4 ura3::pGAL1-MYC3-cdc5N80-GFP-NES-tCYC1-URA3) wurden unter den gleichen Bedingungen angezogen, wie in Abb. 4.4 beschrieben. Das G1-Abbau-Experiment mit anschließender Westernblot-Analyse und Durchflusszytometrie (A – D), das Experiment zum Vergleich der Expressionslevel (F) sowie die Quantifizierung der Abbaukurven (E) und der Expressionslevel (F) wurden ebenfalls wie in Abb.

4.4 durchgeführt. Zum Vergleich der Abbaukurven von Cdc5N80db1/2-GFP und Cdc5N80db1/2-GFP-NLS (G) sowie von Cdc5N80-GFP und Cdc5N80-GFP-NES (H) wurden diese in zwei weiteren Diagrammen dargestellt.