N80 vermittelt Instabilität und Kernlokalisation

CDC5 gehört wie CDC20, CLB2 und ca. 30 weitere Gene zum CLB2-Gencluster, das ab dem Ende der S-Phase bis zur Trennung des Zellkerns in der Mitose transkribiert wird (Enserink und Kolodner, 2010). Am Ende der Mitose und in der G1-Phase wird Cdc5 APC^Hct1 -vermittelt degradiert. Für die Instabilität von Cdc5 ist der N-terminale Bereich notwendig, da die Deletion der 72 N-terminalen Aminosäuren Cdc5 stabilisiert (Charles et al., 1998;

Shirayama et al., 1998; Arnold, 2008). Die Stabilisierung von Cdc5ΔN ist sowohl in G1-arretierten Zellen als auch im Verlauf des Zellteilungszyklus zu sehen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Cdc5ΔN nicht mehr in der Lage war, zellzyklusabhängig zu fluktuieren

(siehe Abb. 4.1). Bislang gelten die beiden D-Boxen im N-terminalen Bereich als die relevanten Abbausignale in Cdc5 (Charles et al., 1998). Die N-terminale Domäne von Cdc5 enthält zusätzlich eine potentielle KEN-Box (Michael et al., 2008). Da die Mutation der D-Boxen nur eine marginale Stabilisierung in der G1-Phase bewirkt, warf dies die Frage auf, wie die Instabilität von Cdc5 durch die N-terminale Region genau reguliert wird. Um dieser Frage nachzugehen, wurde der N-terminale Bereich (N80) von Cdc5 an GFP fusioniert und die Instabilität des Fusionsproteins analysiert. Dabei zeigte sich anhand von live-cell imaging und Westernblot-Analysen, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 nicht nur notwendig, sondern auch hinreichend für die Instabilität in G1 war. Cdc5N80-GFP fluktuierte während des Zellteilungszyklus wie Cdc5 und die Degradation wurde durch APC^Hct1 vermittelt (siehe Abb. 4.3 und 4.4). Zusätzlich zu den Ergebnissen zur Instabilität zeigten die Mikroskopie-Daten von Cdc5N80-GFP, dass der N-terminale Bereich von Cdc5 auch hinreichend für die Lokalisation im Zellkern war. Das Fusionsprotein lokalisierte ausschließlich im Zellkern, im Gegensatz zu GFP, das überwiegend im Zytoplasma akkumulierte (siehe Abb. 4.3 und 4.5). Diese Ergebnisse zeigen, dass die N-terminale Domäne von Cdc5 neben den Degradationssignalen eine NLS beinhaltet.

Im Gegensatz zu den bisherigen Vermutungen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die KEN-Box das entscheidende Degron im N-terminalen Bereich von Cdc5 ist. Die Mutation von K35A und E36A stabilisierte Cdc5N80-GFP während der G1-Phase, wobei die Kernlokalisation nicht beeinflusst war (siehe Abb. 4.4 und 4.5). Dagegen tragen die beiden vermeintlichen D-Boxen nur indirekt zur Instabilität bei. Zwar hatte die Mutation der D-Boxen eine Stabilisierung von Cdc5N80-GFP in der G1-Phase zur Folge, aber zusätzlich führte die Mutation zur Fehllokalisation des Fusionsproteins ins Zytoplasma (siehe Abb. 4.4 und 4.5). Das bedeutet, dass durch die Mutation der D-Boxen die NLS in der N-terminalen Domäne beeinträchtigt wurde. Mit Hilfe eines NLS-Mappers können drei potentielle NLS im N-terminalen Bereich von Cdc5 vorausgesagt werden. Dabei wird für die monopartite NLS 55-PAQKKKREKL-64 (Abb. 5.1 A), die die D-Box 2 beinhaltet, eine exklusive Kernlokalisation und für die beiden bipartiten NLS (Abb. 5.1 B) eine eher partielle Kernlokalisation vorhergesagt.

Abbildung 5.1 Potentielle NLS in der N-terminalen Domäne von Cdc5

Die drei potentiellen NLS-Sequenzen wurden mit Hilfe des NLS-Mappers (nls-mapper.iab.keio.ac.jp/) ermittelt.

Für die monopartite NLS (A) wurde eine exklusive Kernlokalisation vorhersagt, da sie einen Score von 8 (auf einer Skala von 1 bis 10) erzielte. Die beiden bipartiten NLS-Sequenzen (B) wurden mit 6,6 und 7 bewertet. Für diese Werte wird eine partielle Kernlokalisation prognostiziert.

Durch die Fusion einer zusätzlichen NLS an die D-Box Mutante Cdc5N80db1/2-GFP konnte geklärt werden, dass die RXXL-Sequenzen nicht als D-Boxen bzw. Degron, sondern als Teil der NLS im N-terminalen Bereich zur Instabilität von Cdc5 beitragen. Cdc5N80db1/2-GFP-NLS lokalisierte wie Cdc5N80-GFP hauptsächlich im Zellkern und war in der G1-Phase deutlich instabiler als Cdc5N80db1/2-GFP (siehe Abb. 4.6 und 4.7). Zusammengefasst sprechen die Daten dafür, dass die N-terminale Domäne von Cdc5 zum einen durch die KEN-Box und zum anderen durch die NLS zur Instabilität von Cdc5 beiträgt.

Dennoch lässt sich nicht vollkommen ausschließen, dass es sich bei den RXXL-Sequenzen um ein schwaches Degron handeln könnte, da Cdc5N80db1/2-GFP durch die Fusion der zusätzlichen NLS gegenüber Cdc5N80-GFP-NLS immer noch leicht stabilisiert war (siehe Abb. 4.7). Möglicherweise kooperieren die KEN- und die RXXL-Sequenzen miteinander.

Neueste Studien zur Substrat-Bindung durch die APC-Co-Aktivatoren in S. pombe und humanen Zellen konnten in der WD40-Domäne sowohl eine KEN-Box- als auch eine D-Box-Bindestelle identifizieren (Chao et al., 2012; Tian et al., 2012). Allerdings sind die Beobachtungen hinsichtlich der Kooperation der beiden Degrons kontrovers. Chao et al.

(2012) zeigen, dass eine KEN-Box gefolgt von einer D-Box effizienter gebunden wurde als die Degrons alleine. Wohingegen Tian et al. (2012) zeigen, dass die D-Box die Ubiquitinierung von KEN-Box-Substraten reduzierte. Die Daten von Cdc5N80 sprechen eher für die Theorie von Chao et al. (2012), da die Mutation von RXXL nicht zu einer verstärkten Instabilität führte. Die verstärkte Instabilität wäre zu erwarten, wenn die D-Boxen die KEN-Box in ihrer Funktion einschränkt. Es wäre auch möglich, dass es sich bei einer der beiden RXXL-Sequenzen um eine D-Box handelt und dass die andere, vermutlich die zweite, zur NLS gehört. Um dies zu überprüfen und die NLS in N80 genauer zu lokalisieren, wäre es sinnvoll die RXXL-Sequenzen im Fusionsprotein Cdc5N80-GFP getrennt voneinander zu mutieren. Eine anschließende Analyse der Instabilität und der Lokalisation der neuen Fusionsproteine würde die Rolle der RXXL-Sequenzen in Cdc5N80 aufklären.

Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass auch im Bezug auf das volle Länge-Protein von Cdc5 die Instabilität überwiegend durch die KEN-Box vermittelt wird (Arnold, 2008). Da die Deletion der N-terminalen Domäne Cdc5 in der G1-Phase vollständig stabilisiert, die Mutation der KEN-Box aber nur größtenteils, lässt sich vermuten, dass die NLS in der N-terminalen Domäne auch in Bezug auf das volle Länge-Protein einen Beitrag zur Instabilität leistet. Jedoch ist nicht auszuschließen, dass sich innerhalb dieses Bereichs noch weitere unbekannte Signale befinden, die zur Instabilität beitragen.

Die Instabilität der humanen Plk1 wird ebenfalls durch APC^Cdh1 vermittelt, allerdings sind die Position und das Abbausignal in S. cerevisiae nicht konserviert. Plk1 wird D-Box-vermittelt vom APC^Cdh1 erkannt, die sich zwischen der Kinase-Domäne und der PBD befindet (siehe Abb. 3.4; Lindon und Pines, 2004).