Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm1/2 ist unvollständig

Zunächst wurde überprüft, welche der drei Phosphorylierungsstellen (T23, T70, S419) für den phänotypischen Effekt verantwortlich ist und ob die 5. Phosphorylierungstelle (S657) diesen Effekt weiter beeinflusst. Dazu wurden CDC5-Konstrukte mit unterschiedlichen Kombinationen der mutierten Phosphorylierungsstellen (pm) hergestellt, die unter der Kontrolle des endogenen Promotors (pCDC5) exprimiert wurden. Mit diesen Konstrukten wurde ein heterozygot diploider Stamm (CDC5/cdc5-Δ) transformiert und mit Hilfe der Tetradenanalyse die Fähigkeit der Phospho-Mutanten zur Komplementation von cdc5-Δ getestet. Lebensfähige Nachkommen wurden zusätzlich hinsichtlich ihres DNA-Profils mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Im Vergleich zu cdc5pm1/2/4 (Arnold, 2008) wurde der phänotypische Effekt durch die zusätzliche Mutation von S657A weder verstärkt noch geschwächt (Abb. 4.10 A). Die komplementierten Kolonien (K) bei cdc5pm1/2/4/5 wuchsen wie im Fall von cdc5pm1/2/4 etwas schlechter als WT-Kolonien. Auch das DNA-Profil zeigte eine starke Veränderung.

Anders als im WT war die Anzahl der Zellen in der G1- und der S-Phase deutlich reduziert und zusätzlich waren Zellen mit mehr als 2C-DNA-Gehalt vorhanden.

Abbildung 4.10 Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm-Derivate

(A) Der Stamm W2015 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6) wurde mit den Plasmiden pWS2718, pWS2715, pWS2717, pWS2719, pWS2716, pWS2944 und pWS2946 (siehe Tab. 7.2) transformiert. Anschließend wurden die daraus resultierenden heterozygot diploiden Stämme W8098 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm1/2/4/5-MYC9-LEU2), W8099 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm4-MYC9-LEU2),

W8100 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm5-MYC9-LEU2), W8101 (CDC5/

cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm4/5-MYC9-LEU2), W8097 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9-LEU2), W8492 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm1/2D-MYC9-LEU2) und W8493 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2/leu2::pCDC5-cdc5pm1/2E-MYC9-LEU2) einer Tetradenanalyse unterzogen und die Nachkommen auf ihren Genotyp hin untersucht. Zusätzlich wurde der DNA-Gehalt des WT-Stammes K699 und der haploiden Nachkommen W8186 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2/4/5-MYC9-LEU2), W8180 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm4-MYC9-LEU2), W8182 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm5-MYC9-LEU2), W8184 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm4/5-MYC9-LEU2), W8176 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9-LEU2), W8622 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2D-MYC9-LEU2) und W8624 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-cdc5pm1/2E-MYC9-LEU2) mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Dazu wurden die Zellen in XYD bei 25°C kultiviert und in ihrer exponentiellen Wachstumsphase mit 70% Ethanol fixiert. Anschließend wurde die DNA mittels Sytox Green gefärbt.

(B) Für den Vergleich der Expressionslevel mittels Westernblot-Analyse wurden die haploiden Nachkommen sowie die Stämme W9763 (WT) und W6856 (cdc5-Δ::HIS3MX6 leu2::pCDC5-CDC5-MYC9-LEU2) in XYD bei 25°C angezogen, in ihrer exponentiellen Wachstumsphase geerntet und aufgearbeitet. Der Nachweis von endogenem Cdc5 und der Cdc5-Derivate erfolgte durch das α-Cdc5-Serum. Tubulin (Tub2) diente als Ladekontrolle und wurde anhand des α-Tub2-Serums detektiert.

Der phänotypische Effekt konnte bei cdc5pm4, cdc5pm5 und cdc5pm4/5 nicht festgestellt werden. Deren Wachstum und DNA-Profile verhielten sich wie bei der Komplementation von cdc5-Δ durch CDC5 bzw. wie Wildtyp (Abb. 4.10 A; Arnold, 2008). Dagegen war die Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm1/2 immer noch beeinträchtigt. Dies zeigte sich erneut durch kleinere Kolonien in der Tetradenanalyse und durch ein verändertes DNA-Profil, das vergleichbar wie das von cdc5pm1/2/4/5 war (Abb. 4.10 A). Um zu überprüfen, ob tatsächlich die fehlenden Phosphorylierungen der Grund für den Defekt der cdc5pm1/2-Mutante sein könnten, wurden cdc5pm1/2-Mutanten hergestellt, die die Phosphorylierungen imitierten.

Dazu wurden T23 und T70 jeweils zu Aspartat (cdc5pm1/2D) und Glutamat (cdc5pm1/2E) ausgetauscht. Die Tetradenanalyse der Phospho-imitierenden Mutanten zeigte, dass bei der Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm1/2D bzw. cdc5pm1/2E das Wachstum der komplementierten Kolonien nicht beeinflusst war. Das DNA-Profil zeigte weniger starke Effekte als im Fall von cdc5pm1/2. Zwar waren weniger Zellen mit nicht-replizierter DNA zu sehen, aber keine Zellen mit re-replizierter DNA (Abb. 4.10 A). Daraus lässt sich schließen, dass die Mutation der N-terminalen Phosphorylierungsstellen für den phänotypischen Effekt der cdc5pm1/2-Mutante verantwortlich ist und dass deren Phosphorylierung für die Funktion von Cdc5 wichtig zu sein scheint.

Um sicher zu stellen, dass der beobachtete Effekt nicht durch Unterschiede bezüglich der Expressionslevel zu Stande kam, wurden die Proteinmengen von endogenem Cdc5, des Wildtyp-Konstrukts Cdc5 und der Phospho-Mutanten mittels Westernblot-Analyse überprüft.

Die Abbildung 4.10 B zeigt, dass die Expressionslevel der Phospho-Mutanten relativ ähnlich waren, jedoch etwas geringer als der des Wildtyp-Konstrukts Cdc5. Da allerdings die Proteinmengen aller Cdc5-Derivate höher als die des endogenen Cdc5 (WT) waren, kann angenommen werden, dass der phänotypische Effekt bei der Komplementation von cdc5-Δ nicht auf zu geringer Expression, sondern auf den Mutationen beruht.

Als Nächstes wurde die Komplementation von cdc5-Δ durch endogene Mengen von cdc5pm1/2 überprüft. Um die Einfachintegration von DNA-Konstrukten zu erzeugen, wurden bei der Hefetransformation spezielle integrative Plasmide und ein zweifaches Selektionsverfahren eingesetzt (siehe 6.2.7.2). Die daraus resultierenden Stämme wurden anschließend mit einem WT-Stamm gekreuzt und zur Sporulation gebracht. Anhand der vereinzelten Sporen nach der Tetradenanlyse ließ sich das Wachstum der durch endogene Mengen komplementierten Zellen beobachten. Zudem wurde wieder eine Analyse des DNA-Profils mittels Durchflusszytometrie und der Expressionslevel mittels Westernblot-Analyse durchgeführt.

Die Tetradenanalyse zeigte, dass das Wildtyp-Konstrukt CDC5 auch bei endogenen Mengen in der Lage war, cdc5-Δ zu komplementieren. Die komplementierten Sporen (K) wuchsen wie WT. Allerdings zeigte sich anhand der DNA-Profile eine leichte Beeinträchtigung der Zellen.

Der 1C-Peak war etwas kleiner als der des WT (Abb. 4.11 A). Der entstandene Wachstumsdefekt bei der Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm1/2 war anhand der komplementierten Sporen mit endogener Cdc5pm1/2-Menge nun noch deutlicher zu sehen, da die komplementierten Sporen deutlich langsamer als WT-Zellen wuchsen. Dieses Ergebnis wurde auch durch die DNA-Profile bestätigt. Der 1C-Peak von in Glukose gewachsenen cdc5pm1/2-Zellen war nicht mehr zu sehen und in Raffinose gewachsenen Zellen sehr stark reduziert. In beiden Fällen war erneut ein Peak größer als 2C zu sehen (Abb. 4.11 A). Die Komplementation von cdc5-Δ durch cdc5pm1/2D nach endogener Expression war ähnlich wie die von CDC5. Das Wachstum der Sporen aus der Tetradenanalyse war kaum beeinträchtigt. Allerdings wiesen die DNA-Profile, vor allem das der in Raffinose gewachsenen Zellen, eine leichte Reduzierung des 1C-Peaks auf. Die Analyse der Expressionslevel mittels Westernblot zeigte, dass die Expression der Cdc5-Derivate vergleichbar mit der des endogenen Cdc5 (WT) waren (Abb. 4.11 B).

Abbildung 4.11 Komplementation von cdc5-Δ durch endogene Mengen der CDC5-Derivate

Zur Herstellung der Stämme mit Einfachintegration wurde der Stamm W2015 (CDC5/cdc5-Δ::HIS3MX6) mit den disintegrator Plasmiden pWS2821, pWS2826 und pWS2976 (siehe Tab. 7.2) transformiert. Die aus der Tetradenanalyse resultierenden Nachkommen wurden zunächst zur erneuten homologen Rekombination auf XYD kultiviert und anschließend der Selektion auf 5-FOA-Platten unterzogen. Zur Identifizierung der Stämme mit Einfachintegration wurden die positiven Klone auf XYD, SD-H, SD-MET und SD-U ausgestrichen.

(A) Um das Wachstum der komplementierten Stämme mit Einfachintegration zu testen, wurden die Stämme W8393 (cdc5-Δ::HIS3MX6 CDC5-MYC9), W8395 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) und W8626 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2D-MYC9) mit dem Stamm W9763 (WT) gekreuzt, danach eine Tetradenanalyse durchgeführt und die haploiden Nachkommen auf ihren Genotyp hin untersucht. Um die DNA-Profile zu vergleichen, wurden die Zellen der Stämme W8394, W8396 und W8627 in XYD und XYR bei 25°C kultiviert und in ihrer exponentiellen Wachstumsphase mit 70% Ethanol fixiert. Die DNA der fixierten Zellen wurden mit Sytox Green gefärbt und der DNA-Gehalt mittels Durchflusszytometrie gemessen.

(B) Für den Vergleich der Expressionslevel mittels Westernblot-Analyse wurden die Stämme W9763, W10318 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-CDC5-MYC9), W10319 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) und W10413 (cdc5-Δ::HIS3MX6 met15::pCDC5-cdc5pm1/2D-met15::pCDC5-cdc5pm1/2-MYC9) in XYD bei 25°C kultiviert, in ihrer exponentiellen Wachstumsphase geerntet und aufgearbeitet. Der Nachweis von endogenem Cdc5 und der Cdc5-Derivate erfolgte durch das α-Cdc5-Serum. Tubulin (Tub2) diente als Ladekontrolle und wurde anhand des α-Tub2-Serums detektiert.

Die Ergebnisse der Komplementation von cdc5-Δ durch endogene Expression von cdc5pm1/2 bestätigen die Vermutung, dass die beiden N-terminalen Phosphorylierungen für die Funktion von Cdc5 bedeutend sein könnten.

4.3.2 Mutation der N-terminalen Phosphorylierungsstellen hat keinen Einfluss