5 Literaturübersicht
5.9 Vimentin
Die Masse von Vimentin wird mit 54-57kDa angegeben (Fuchs und Weber, 1994;
Steinert und Roop, 1988). Vimentin ist ein zytoplasmatisches Intermediärfilament vom Typ III, und wird von mesenchymalen Zellen gebildet (Herrmann und Aebi, 2000). Als Beispiele werden unter anderem Fibroblasten, Chondrozyten, Makrophagen oder Endothelzellen genannt (Osborn, 1983). Im Zytoplasma formt es filamentartige Strukturen von ca. 10-15nm Länge (Steinert und Roop, 1988) und ist so eines von vielen strukturellen Elementen. Außer in reifen (mature) Filamenten tritt Vimentin auch in anderen Formen wie kurzen Filamenten (squiggles), oder nicht-filamentösen Vorläufern (particles) in Zellen auf (Chou et al., 2007). Diese unterschiedlichen Formen können auch ineinander übergehen (Chou et al., 2007).
Vimentin kommt auch im Zytoskelett der myometrialen Zellen vor (Yu und Lopez Bernal, 1998), in Telozyten ist es hauptsächlich in den Zellfortsätzen vorhanden (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010).
Literaturübersicht 5.10 Mastzellen
Bei einer Doppelfärbung mit CD117 und Vimentin zur Detektion von Telozyten werden Mastzellen ebenfalls detektiert (Popescu et al., 2005a; Salama, 2013).
Vimentin im Zytoskelett der Mastzellen unterliegt Schwankungen, die durch die Aktivierung der Zellen bedingt sind (Draber et al., 2012). Mastzellen wurden in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts von W. Waldeyer und Paul Ehrlich anhand des metachromatischen Färbeverhaltens ihrer Granula beschrieben (Yong, 1997). Der Name „Mastzelle“ geht auf Ehrlich zurück, für den die Zellen aufgrund ihrer reichhaltigen Granula „gemästet“ erschienen (Yong, 1997). Mastzellen stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab (Valent et al., 1991) und sind bei Vertebraten in vielen unterschiedlichen Geweben anzutreffen, wo sie je nach Lokalisation rund, spindelförmig, sternförmig oder filiform erscheinen (Yong, 1997). Yong fasste die morphologischen Eigenschaften von Mastzellen zusammen: sie haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 12,6-13,5µm, die Granula nehmen 50-55% des Zytoplasmas ein, der Zellkern hat einen Durchmesser von 4-7µm (Yong, 1997).
Mastzellen können aufgrund ihres metachromatischen Verhaltens histologisch relativ einfach nachgewiesen werden, sie heben sich bei Färbung mit Toluidinblau durch eine rote oder violette Farbe vom sonst blau gefärbten Gewebe ab (Ehrlich, 1877).
5.10.1 Mastzellen im Uterus
Uterine Mastzellen können von runder, ovaler oder unregelmäßiger Gestalt sein (Liu et al., 2012). Die Verteilung von Mastzellen im Uterus ist nicht konstant, sondern variiert je nach Zyklusstand oder dem Stand der Trächtigkeit (Brandon und Bibby, 1979; Likar und Likar, 1964; Liu et al., 2012). Likar et al. zogen den Schluss, dass uterine Mastzellen sich meistens in der Nähe von Blutgefäßen befinden (Likar und Likar, 1964). Im Uterus des Menschen wurden in dem zum Lumen gerichteten Anteil des Myometriums mehr Mastzellen gefunden als im äußeren Anteil (Mori et al., 1997), Milne et al. fanden heraus, dass die Mehrheit der Mastzellen im humanen Uterus im Myometrium zu finden ist (Milne et al., 2001), Karaca et al. kamen für die Ziege zu dem gleichen Schluss (Karaca et al., 2009).
Für den Uterus des Rindes beobachteten Kuther et al. dahingegen die meisten Mastzellen in der Lamina propria des Endometriums, im Str. longitudinale die wenigsten. Es ist unklar, ob es sich dabei um tragende oder nicht tragende Tiere
Literaturübersicht
handelte (Kuther et al., 1998). Bei Likar et al. wurden myometriale Mastzellen hauptsächlich im lockeren Bindegewebe um die Gefäße des Str. vasculare gefunden (Likar und Likar, 1964). Weis konnte beim Rind eine Zunahme von uterinen Mastzellen mit fortschreitendem Alter feststellen, was er in einer Verdickung der Uteruswand und einer Vermehrung von Blutgefäßen nach mehrmaligen Graviditäten begründet sah (Weis, 1956).
Weiterhin schwankt die Verteilung uteriner Mastzellen je nach Trächtigkeitsstatus. In einer Studie mit Meishan-Schweinen veränderte sich das Verhältnis von Mastzellen in Endometrium zu Myometrium dahingehend, dass anfangs mehr Mastzellen im Endometrium als im Myometrium zu finden waren, während an Tag 50 mehr Mastzellen im Myometrium als im Endometrium zu sehen waren (Liu et al., 2012).
Laut Weis ist die Gesamtzahl an uterinen Mastzellen im Rind bei trächtigen und nicht trächtigen Tieren wahrscheinlich gleich hoch, dass in der Trächtigkeit weniger beobachtet werden, könnte auf die trächtigkeitsbedingte Wanddehnung zurückzuführen sein (Weis, 1956).
Die Funktionsweisen von Mastzellen im Uterus sind noch nicht erschöpfend geklärt, es wird davon ausgegangen, dass sie Entzündungen fördern und Einfluss auf den Beginn der Wehentätigkeit haben können (Menzies et al., 2011).
In Mensch, Ratte und Meerschweinchen wurde gezeigt, dass Mastzellen die Kontraktilität des Uterus beeinflussen können (Bytautiene et al., 2004, 2008; Rudolph et al., 1993).
5.11 NO
NO, Kurzform für nitric oxide oder Stickstoffmonoxid ist ein Entzündungsmediator und ein Dilatator von glatten Muskelzellen, das Molekül spielt im Entzündungsgeschehen eine wichtige Rolle (Tripathi et al., 2007). Die Bildung von NO im Körper wurde von Coleman und Rosselli et al. zusammengefasst: Im Körper wird es durch NO-Synthasen (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin gebildet (Rosselli et al., 1998). NOS kommen in drei verschiedenen Formen vor: Die neuronale NOS (NOS1) und die endotheliale NOS (NOS3) werden zusammen als konstitutive NO-Synthasen bezeichnet (Rosselli et al., 1998). NOS1 und NOS3 werden durch physiologische Stimuli und ein intrazelluläres Ca2+ - Signal aktiviert, die
induktive-Literaturübersicht
NO-Synthase (NOS2 oder iNOS) wird dahingegen erst als Antwort auf einen Entzündungsstimulus durch Transkription und Translation gebildet (Abb.2) (Rosselli et al., 1998). Als Entzündungsstimuli kommen Lipopolysaccharide oder Zytokine in Frage (Coleman, 2001).
Während die NO-Produktion durch die beiden konstitutiven NOS schnell, stetig und auf niedrigem Level erfolgt, wird nach Translation der iNOS eine anhaltende hohe Menge an NO produziert (Coleman, 2001). Die geringen NO-Mengen der konstituiven NO-Synthasen führen über die Guanylylzyklase zur Bildung von cGMP, und somit zu einer Zellantwort (Abb.2) (Coleman, 2001). Die hohen NO-Mengen werden in Gegenwart von Sauerstoff schnell oxidiert und führen zur Bildung von reaktiven nitricoxide species (RNOS), die einen Einfluss auf viele zelluläre Vorgänge haben können (Abb.2) (Coleman, 2001).
5.11.1 NO im Uterus
NO-Synthasen werden auch im Uterus exprimiert, während in Uteri von nicht trächtigen Ratten die Expression von iNOS durch intrauterine Infektionen gesteigert wird, ist deren Expression in Uteri trächtiger Ratten nicht mehr steigerbar (Fang et al., 2001). Diese Hochregulation während der Trächtigkeit ist wahrscheinlich durch Progesteron bedingt (Yallampalli et al., 1998). Fang et al. stellten die Vermutung auf, dass dieses System während der Trächtigkeit maximal ausgelastet ist, um Infektionen entgegenzuwirken und eine Relaxation der glatten Muskelzellen zu gewährleisten (Fang et al., 2001).
NO wird ebenfalls mit der Kontraktilität des Uterus in Verbindung gebracht. So sind relaxierende Effekte von NO durch den Inhibitor der NOS L-nitro-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME) reversibel, bei Gabe von SNP (Sodiumnitroprussid), welches als NO-Donor fungiert, kommen die uterinen Kontraktionen jedoch zum Erliegen (Garfield et al., 1995).
Im Rind konnten Li et al. einen Zusammenhang zwischen Endometritis und NO zeigen: Bei Kühen mit klinischer oder subklinischer Endometritis wurden erhöhte NO-Konzentrationen im Uterinsekret sowie Blutplasma gemessen, außerdem war in Biopsien des Endometriums ein erhöhter Gehalt an iNOS-mRNA zu verzeichnen (Li et al., 2010). Den stärksten Anstieg sowohl von NO als auch iNOS zeigten dabei
Literaturübersicht
Tiere mit klinischer Endometritis (Li et al., 2010). Shixin et al. konnten bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung in den fetalen Anteilen der Plazenta eine höhere Expression an iNOS-RNA und iNOS-Protein feststellen. Sie vermuteten durch eine erhöhte Produktion an NO eine verminderte Kontraktilität des Uterus und damit eine Begünstigung für das Entstehen von Nachgeburtsverhaltungen (Shixin et al., 2011).
Das Verhalten des Myometriums scheint in Bezug auf NO jedoch vom Trächtigkeitsstadium und der Spezies abhängig zu sein: Yallampalli et al.
beschrieben für Ratten einen starken relaxierenden Effekt von NO auf das Myometrium während der Trächtigkeit, zum Geburtszeitpunkt jedoch eine verringerte Produktion von endogenem NO (Yallampalli et al., 1993).
Abb.2: Schema der NOS, modifiziert nach Coleman und Tripathi et al. (Coleman, 2001; Tripathi et al., 2007). Induktive und konstituive NO-Synthasen werden auf unterschiedlichen Wegen stimuliert und haben unterschiedlich lange Antworten. Bei Gebärmutterentzündungen des Rindes ist die induktive NOS=iNOS=NOS2 von Bedeutung.
Literaturübersicht 5.12 Kaliumhaushalt beim Rind
Kalium kommt in den Vorgängen an der Zellmembran eine bedeutende Rolle zu (Kap.5.4.1).
Wiederkäuer nehmen mit dem Futter große Mengen an Kalium auf (Ward, 1966).
Diese hohen Kaliummengen werden nach der gastrointestinalen Resorption von extra- nach intrazellulär verschoben und später renal eliminiert. Die Na/K-ATPase wird durch Insulin angeregt (Bia und DeFronzo, 1981) und ist damit für die Verschiebung von Kalium in die Zellen verantwortlich. Unmittelbar nach der Futteraufnahme erhöht sich außerdem die Kaliumausscheidung über die Nieren (Morita et al., 2000; Rabinowitz et al., 1988). Stagniert die Futteraufnahme, kann es zu einem Absinken der Kaliumkonzentration im Plasma kommen, die renale Ausscheidung von Kalium sinkt auch an Fastentagen nicht auf null (Clabough und Swanson, 1989; Rabinowitz et al., 1988). Eine stagnierende Futteraufnahme scheint sich von selber zu potenzieren: Kühe, die mit einer Kalium-Mangel-Ration gefüttert wurden, zeigten eine signifikant geringere Futteraufnahme als Kühe denen genügend Kalium in der Ration zur Verfügung stand (Pradhan und Hemken, 1968). Der Kaliumhaushalt kann demnach durch erhöhte Insulinspiegel oder eine reduzierte Futteraufnahme gestört werden.
Therapeutische Maßnahmen zur Behandlung peripartaler Ketosen können den Kaliumgehalt im Blut weiterhin erniedrigen (Peek et al., 2000). Der Plasmaspiegel an Kalium kann hierbei über insulinbedingte Aktivierung der Na/K-ATPase und über eine Glucose induzierte osmotische Diurese gesenkt werden (Leonhard-Marek et al., 2010). Neben der renalen Exkretion wird Kalium zu 1,5g pro kg Milch über das Euter ausgeschieden (Goff, 2004). Für den physiologischen Plasmakaliumspiegel einer Holstein-Milchkuh sind in der Literatur unterschiedliche Angaben zu finden, von im Mittel 4,0mmol/L (Cozzi et al., 2011), bis zu einem Median von 5,15mmol/L (Kalaitzakis et al., 2010). Als schwere Hypokaliämien werden von Goff Plasmakaliumkonzentrationen von unter 2,5mmol/L beschrieben (Goff, 2004). In einzelnen Fällen konnten Plasmakaliumkonzentrationen von unter 2mmol/L beobachtet werden (Kalaitzakis et al., 2010). Hypokaliämien treten bei vielen pathologischen Zuständen auf (Constable et al., 2013), und stehen bei Rindern häufig im Zusammenhang mit Erkrankungen des Verdauungstraktes (Schänzle,
Literaturübersicht
2002). Sattler et al. beobachteten einen Kaliummangel bei Anorexie im Zusammenhang mit einer Hypomotilität oder Atonie des Pansens (Sattler et al., 1998). Hypokaliämien gehen außerdem häufig mit Festliegen einher (Peek et al., 2000; Sattler et al., 1998), sie scheinen aber nicht zwangsläufig alleinige Ursache für Muskelschwäche zu sein (Schänzle, 2002). Die Therapien von Hypokaliämien gehen zum Teil mit hohen Verlustraten einher (Peek et al., 2000).
Türck und Leonhard-Marek konnten an der glatten Muskulatur des Labmagens in vitro zeigen, dass pathophysiologisch niedrige Konzentrationen von Kalium oder eine erhöhte extrazelluläre Konzentration von Insulin in der Lage sind die Aktivität der glatten Muskelzellen zu hemmen (Türck und Leonhard-Marek, 2010). Die verminderte kontraktile Aktivität der glatten Muskelzellen im Labmagen steht dabei in Zusammenhang mit einer durch unterschiedliche extrazelluläre Kaliumkonzentrationen hervorgerufenen Veränderung der Potentialdifferenz über der Zellmembran (Zurr, 2012; Zurr und Leonhard-Marek, 2012).
Material und Methoden 6 Material und Methoden
6.1 Tiere
Bei den durchgeführten Versuchen handelte es sich ausschließlich um in-vitro- Versuche. Das dafür verwendete Gewebe stammte entweder von geschlachteten Tieren oder Tieren an denen eine Kaiserschnittoperation durchgeführt wurde. Auf die Haltung eigener Versuchstiere konnte deshalb verzichtet werden.
6.1.1 Schlachthoftiere
Bei den geschlachteten Tieren handelte es sich in der Regel um schwarzbunte Rinder der Rasse Holstein-Frisian unterschiedlicher Laktationsnummer. Die Tiere wurden per Bolzenschuss betäubt und unmittelbar danach durch Blutentzug getötet.
Etwa 15min nach Eintritt des Todes wurde die Bauchhöhle eröffnet und das Magen-Darm-Konvolut einschließlich der weiblichen Reproduktionsorgane entnommen und auf ein separates Fließband verfrachtet. An diesem Fließband wurden Uterus sowie anhängende Eileiter und Ovarien adspektorisch und palpatorisch untersucht. Dabei wurde die Integrität der Organe beurteilt, nur optisch unauffällige Uteri wurden weiter in Betracht gezogen. Uteri, bei denen sich pathologische Veränderungen in Form von Entzündungen, eingetrübten oder übelriechenden Fruchtwässern zeigten oder zu vermuten waren, wurden aussortiert. Für Uteri mit entzündlichen Veränderungen wurde bei in vitro-Versuchen ein anderes kontraktiles Verhalten als für nicht entzündete Uteri ermittelt (Hirsbrunner et al., 2010). Bei den Ovarien wurde auf das Vorhandensein von Funktionsgebilden geachtet. Uteri mit inaktiven Ovarien oder Mißbildungen an Ovarien oder deren ableitenden Wegen wurden ebenfalls aussortiert.
Tiere, an denen keine Anzeichen einer Trächtigkeit in Form eines Fetus oder eines Corpus luteum graviditatis an den Ovarien zu erkennen waren, wurden als nicht trächtig klassifiziert. Es wurden nur solche nicht trächtige Uteri verwendet, die mindestens das Frühpuerperium überschritten hatten und makroskopisch eine typische Größe aufwiesen (Kap.5.2).
Tiere, die am Ovar ein Corpus luteum graviditatis und bei Eröffnung des Uterus Fruchthüllen und einen je nach Trächtigkeitsfortschritt entwickelten Fetus erkennen ließen, wurden als trächtig klassifiziert. Das Stadium der Trächtigkeit wurde anhand
Material und Methoden
der morphologischen Entwicklung und Größe des vorhandenen Fetus in volle Monate eingeteilt.
Analog zu Versuchen von Kaufmann und Hirsbrunner (Kaufmann et al., 2008) wurde aus dem kranialen Drittel eines Uterushornes ein ca. 5cm x 5cm großes Stück der kompletten Gebärmutterwand entnommen. Bei trächtigen Tieren wurde die Probe aus dem die Frucht beherbergenden Horn entnommen, außerdem wurde darauf geachtet jeweils dasjenige Areal zu beproben, das den weitesten Abstand zu den umliegenden Plazentomen aufwies. Die Gewebeprobe wurde unmittelbar nach der Entnahme in gekühlten (ca. 6°C) und Carbogen-begasten KH-Puffer überführt und in einem dicht verschlossenen temperaturisoliertem Gefäß in das Labor gebracht (KH:
siehe Kap.10.17.1; Carbogen: 95% CO2 + 5% O2). Die nächsten Versuchsschritte folgten nach 3h.
6.1.2 Kaiserschnitttiere
Neben den Schlachthoftieren bestand in Kooperation mit der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover die Möglichkeit Gewebeproben von Tieren, an denen ein Kaiserschnitt durchgeführt wurde, zu verwenden.
Die Kaiserschnittoperationen fanden unter Schmerzausschaltung mittels Epiduralanästhesie (3ml Procasel® 2%, Selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH, Weyarn-Holzolling, Deutschland) sowie paravertebralem Block und Schnittlinieninfiltration statt (insgesamt 200ml Isocain® 2%, Selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH, Weyarn-Holzolling, Deutschland; Verabreichung subcutan und intramusculär). Ferner wurde den Tieren 10ml des Tocolytikums Clenbuterol intravenös verabreicht (Planipart®, Boehringer Ingelheim, Vetmedia, Deutschland).
Aus der Operationswunde wurde mittels Operationsschere ein mindestens 5cm breiter länglicher Streifen der kompletten Uteruswand entnommen und unmittelbar darauf in gekühlten (ca. 6°C) und Carbogen-begasten KH-Puffer überführt (KH:
siehe Anhang; Carbogen: 95% CO2 + 5% O2). Die nächsten Versuchsschritte folgten nach 5min.
6.1.3 Einteilung der Tiere
Die Tiere wurden je nach Trächtigkeitsstatus in unterschiedliche Gruppen eingeteilt.
Material und Methoden
Für elektrophysiologische Untersuchungen (allgemein und unter Kaliumeinfluss):
a) Nicht trächtig / N. tr. (geschlachtete nicht trächtige Tiere, N=19 Tiere)
b) Monat 1-4 / M 1-4 / 1. Trächtigkeitshälfte (geschlachtete Tiere zwischen dem ersten und vierten Monat der Trächtigkeit, N=6 Tiere)
c) Monat 5-9 / M 5-9 / 2. Trächtigkeitshälfte (geschlachtete Tiere zwischen dem fünften und neunten Monat der Trächtigkeit, N=4 Tiere)
d) Kaiserschnitt / KS (Kaiserschnitttiere, N=5 Tiere) Für histologische Untersuchungen (allgemein):
a) Nicht trächtig / N. tr. (geschlachtete nicht trächtige Tiere, N=3 Tiere)
b) Trächtigkeitsmitte (geschlachtete Tiere im 4. oder 5. Monat der Trächtigkeit, N=4 Tiere)
c) Kaiserschnitt / KS (Kaiserschnitttiere, N=2 Tiere)
Die elektrophysiologische und histologische Betrachtung in den NO-Versuchen fand auf Tierebene statt, so dass hierfür keine Gruppen gebildet wurden.
6.2 Elektrophysiologie
6.2.1 Präparation
Zur Präparation wurde das jeweilige Gewebestück mittels entomologischen Fixiernadeln auf einer mit Sylgard beschichteten und KH-befüllten (37°C, Carbogen-begast) Petrischale fixiert. Die Probe der Uteruswand wurde dabei so ausgerichtet, dass die serosale Seite nach unten zeigte und die endometriale Seite obenauf lag.
Das Gewebe wurde während der gesamten Präparation regelmäßig mit KH-Puffer (37°C, Carbogen-begast) begossen. Nach Entfernung des Endometriums wurden die beiden Anteile der Muskulatur mittels Präparationsschere voneinander getrennt. Die dafür optische Leitlinie zur Präparation war der zwischen Str. circulare und Str.
longitudinale befindliche Gefäßplexus (Abb.1B).
Die beiden Muskelanteile wurden einzeln mit der jeweils dem Gefäßplexus zugewandten Seite nach oben hin in der Petrischale aufgespannt und weiter
Material und Methoden
präpariert. Sichtbare Plexusreste wurden an beiden Muskelanteilen mittels Scherenschlag bis in das Muskelgewebe hinein entfernt. Die dem Str. longitudinale anhaftende Serosa wurde nicht entfernt. Von beiden Muskelproben wurde ein jeweils 0,5cm x 0,5cm großes Stück zur Messung mit der Mikroelektrodenapparatur entnommen. Die übrigen Anteile des Gewebes wurden entweder sofort für einen parallel stattfindenden Kontraktionsversuch verwendet, oder in einem luftdicht verschlossenen Gefäß in begastem KH-Puffer bei 6°C für weitere Messungen aufbewahrt. Die Gewebe wurden für Messungen bis zu zwei folgenden Tagen unter regelmäßigem Austausch des Puffers aufbewahrt (Kap.10.9).
6.2.2 Mikroelektrodenmessungen
Die Mikroelektrodentechnik stellt eine Methode zur Erfassung von Potentialdifferenzen über der Zellmembran dar. Mit einer feinen Glaselektrode werden einzelne Zellen punktiert. Um eine Spannung zwischen Intra- und Extrazellularraum ermitteln zu können, wird an das Medium, das die Zellen umgibt und somit den Extrazellularraum darstellt, eine Referenzelektrode angesetzt. Die für diese Arbeit verwendeten Mikroelektrodenmessungen wurden in Anlehnung an die Methode von Zurr vorgenommen (Zurr, 2012).
6.2.3 Apparatur
Das vorpräparierte quadratische Gewebestück wurde mit der dem Plexus zugewandten Seite nach oben in eine mit Sylgard beschichtete Perfusionskammer gespannt, die ein Volumen von ca. 2ml fasste. Die Fixierung wurde unter moderater Spannung in den 4 Ecken des quadratischen Gewebestückes mittels Nadeln vorgenommen. Die Perfusionskammer befand sich auf einem höhenverstellbaren Stativ unter der Mikroelektrode, Mikrometerschrauben erlaubten eine manuelle dreidimensionale Bewegung der Mikroelektroden. Mikroelektrode und Referenzelektrode, eine Ag/AgCl-Elektrode, die in einer 3M KCl-Lösung stand, waren elektrisch mit einem Mikroelektrodenverstärker (Biomedical Instruments, München, Deutschland) verbunden. Die Perfusionskammer und die Lösung der Referenzelektrode wurden durch einen Kunststoffschlauch, der mit KH-Puffer und Agar (3%) gefüllt war, verbunden. Der Mikroelektrodenverstärker diente zur Messung und Verstärkung der elektrischen Spannungen zwischen den beiden Kompartimenten. Die im Mikroelektrodenverstärker ermittelten Daten wurden an ein
Material und Methoden
Oszilloskop (DSO 420, Gould, Ilford, UK) und an einen Flachschreiber (BD 41; Kipp
& Zonen BV, Delft, Niederlande) weitergegeben. Die Perfusionskammer wurde während des gesamten Versuchs fortlaufend mit Pufferlösungen durchspült, die Gefäße der jeweiligen Lösungen standen in einem Wasserbad, das auf 40°C erwärmt war. Um den pH-Wert der Lösungen stabil zu halten wurde jedes der Gefäße mit Carbogen begast. Die Lösungen wurden durch Kunststoffschläuche in die Perfusionskammer geleitet, der Wechsel zwischen den einzelnen Lösungen konnte mittels eines mechanischen Verteilerschalters vollzogen werden. Durch eine Erhöhung des Wasserbades um 30cm gegenüber der Perfusionskammer erfolgte das Durchspülen der Kammer durch die Schwerkraft, der so erreichte Fluss der Pufferlösung betrug ca. 2ml pro min. Der Abtransport der Flüssigkeiten fand ebenfalls über die Schwerkraft statt: Durch einen Zellstoffdocht (Präzisionswischtücher, KIMTECH Science, Kimberly-Clark Europe Limited/Professional Sector, Reigate, UK) wurde überschüssige Flüssigkeit aus der Perfusionskammer in ein Becherglas geleitet. Die gesamte Apparatur befand sich auf einem schwingungsgedämpften Tisch, der zur Abschirmung von äußeren elektrischen Einflüssen von einem geerdeten Faradyschen Käfig überbaut war.
Dieser Käfig war zur Seite des Experimentators offen, ein weiterer kleiner ebenfalls geerdeter Faradayscher Käfig, der nur das untersuchte Gewebe und die Mikroelektrode von allen Seiten umschloss, sorgte für eine zusätzliche Abschirmung.
6.2.4 Mikroelektroden
Die verwendeten Mikroelektroden wurden am Tag ihrer Verwendung jeweils einzeln aus Glaskapillaren (GB150F-8P with filament, SCIENCE PRODUCTS GmbH, Hofheim, Deutschland) hergestellt. Die Kapillaren wurden vertikal in einen Needle/Pipette Puller (Model 750, Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen, Deutschland) eingespannt und mittig durch zwei seitliche Heizdrähte erwärmt. Durch die dabei erreichte Ausdehnung des Materials und eine Zugkraft, die durch ein an der unteren Hälfte der Kapillare angebrachtes Gewicht erfolgte, konnten aus den Kapillaren Mikroelektroden zur Zellpunktion hergestellt werden. Die Mikroelektroden wurden in einem Exsikkator mit 0,5mmol/L KCl befüllt. Eine Wasserstrahlpumpe lieferte den dafür benötigten Unterdruck. Die Elektroden wurden vor ihrer Verwendung mikroskopisch evaluiert, Elektroden mit beschädigter Spitze wurden aussortiert. Auch zwischen den einzelnen Messungen wurden die Mikroelektroden
Material und Methoden
regelmäßig mikroskopisch überprüft und bei Verbreiterung an der Spitze oder sonstigen Beschädigungen ausgetauscht.
6.2.5 Versuchsdurchführung
Punktion der Zellen
Das in der Perfusionskammer befindliche zu untersuchende Gewebestück wurde so ausgerichtet, dass es sich mittig unter der Mikroelektrode befand und einen rechten Winkel zu dieser bildete. Mittels Mikrometerschrauben wurde die Mikroelektrode zuerst langsam in die über dem Gewebestück stehende Flüssigkeit geschoben.
Dieser Wert wurde als 0mV des Membranpotentials kalibriert, da sich in diesem Zustand beide Elektroden im gleichen Kompartiment befanden. Die Mikroelektrode wurde durch manuelle Bedienung der Mikrometerschraube weiter vorgeschoben, so dass das Gewebe unter makroskopischer Sichtkontrolle penetriert werden konnte.
Dieser Wert wurde als 0mV des Membranpotentials kalibriert, da sich in diesem Zustand beide Elektroden im gleichen Kompartiment befanden. Die Mikroelektrode wurde durch manuelle Bedienung der Mikrometerschraube weiter vorgeschoben, so dass das Gewebe unter makroskopischer Sichtkontrolle penetriert werden konnte.