6 Material und Methoden
6.2 Elektrophysiologie
6.2.9 Datenanalyse
Für statistische Berechnungen wurden die Daten mit dem Programm SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics ausgewertet. Graphiken wurden entweder mit SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics oder mit Excel 2007 erstellt. Da bei den meisten Daten keine Normalverteilung der Ursprungswerte vorlag, wurden entweder nichtparametrische Tests angewandt oder es fand eine deskriptive Auswertung unter Zuhilfenahme der graphischen Darstellung der Werte statt. Da die RMP im einzelnen Tier eine höhere Schwankung zeigten als zwischen den Tieren (Abb.5) gingen die einzelnen Zellen in die Auswertung ein, ohne vorher auf Tierebene gemittelt zu werden, da dies einen großen Teil der Varianz unterschlagen hätte.
Grundlegendes elektrophysiologisches Verhalten des bovinen Myometriums
Für die statistischen Auswertungen des RMP wurden Werte aus den Vorversuchen, sowie Messungen bei 5,4mmol/L KCl aus den beiden Messprotokollen zum Kaliumversuch verwendet. Es wurden Zellen mit und ohne Potentialschwankungen getrennt betrachtet. Da die Daten sehr weit streuten und eine Normalverteilung bei den meisten Gruppen nicht gegeben war, wurde zur Auswertung des Einflusses des
Material und Methoden
Trächtigkeitsstatus (Nicht trächtig; Monat 1-4; Monat 5-9; Kaiserschnitt) der Kruskal-Wallis-Test verwendet. Der Einfluss des Gewebes (Str. circulare/Str. longitudinale) wurde mithilfe des Wilcoxon-Zwei-Stichprobentests (zweiseitige Z-Approximation, comparitionwise error considered) berechnet.
Zur Auswertung der Potentialschwankungen wurden die Frequenzen der Potentialschwankungen mit bestimmten Amplitudenhöhen in einem Zeitfenster von einer bis zu sechs Minuten (je nach Stabilität der Punktion) je Zelle ausgezählt und pro Minute gemittelt. Die für die einzelne Zelle ermittelten Frequenzen wurden für die jeweilige zu betrachtende Trächtigkeitsgruppe gemittelt. Der Faktor Trächtigkeitsstatus wurde für die Frequenzen der Potentialschwankungen mit Amplituden ≥1mV; ≥3mV und ≥8mV mittels Kruskal-Wallis-Test ermittelt. Die Frequenzen und Amplitudenhöhen der Potentialschwankungen wurden als Mittelwerte graphisch aufgetragen und deskriptiv betrachtet.
Kaliumversuch
Für die Auswertung des Kaliumeinflusses auf das RMP wurden die in den Kaliumversuchen 1 und 2 untersuchten Tiere ausgewertet. Der Einfluss der unterschiedlichen extrazellulären Kaliumkonzentrationen wurde für Str. circulare und Str. longitudinale zu jeder der 4 Trächtigkeitsgruppen in Zellen mit und ohne Potentialschwankungen jeweils mittels Kruskal-Wallis-Test bestimmt. Die Beschreibung der Potentialschwankungen fand analog zum grundlegenden elektrophysiologischen Verhalten des Myometriums statt. Hier wurden die unterschiedlichen Kaliumkonzentrationen in beiden Muskelanteilen je Trächtigkeitsstatus verglichen.
SNP-Versuch
Die Betrachtung des NO-Einflusses fand deskriptiv statt.
Material und Methoden 6.3 Histologie
6.3.1 Probenvorbereitung
Die zur histologischen Untersuchung verwendeten Gewebeproben wurden mittels einer in einen Klingenhalter eingespannten Mikrotomklinge auf eine Größe von ca.
0,5cm x 1cm präpariert und anschließend zwei Tage lang in einer Formollöung fixiert (Formol nach Lillie). Danach wurden die fixierten Proben jeweils einzeln in eine Einbettungskapsel aus Kunststoff gegeben und in dieser zwei bis drei Stunden lang unter fließendem Wasser gespült, um Formalinreste zu entfernen. Die folgende Aufbewahrung bis zur Durchführung der folgenden Schritte erfolgte in 70 prozentigen Ethanol bei Raumtemperatur (RT).
6.3.2 Einbettung
Bei der Einbettung wurden die Hohlräume des Formalin- fixierten Gewebes komplett mit Paraffin ausgefüllt, um ein späteres Schneiden in situ zu gewährleisten. Die Einbettung erfolgte über Nacht in einem Einbettungsautomaten (ASP 300S, Leica Biosystems GmbH, Nussloch, Deutschland) bei folgendem Protokoll (Tab.4):
Tab.4: Protokoll des Einbettungsautomaten einer Einbettstation (Paraffinausgießstation EG1150H, Leica Instruments GmbH,
Material und Methoden
Nussloch) manuell in Paraffinblöcke eingebettet. Dafür wurden die Einbettungskapseln geöffnet, die Proben entnommen und in passende, auf 60°C vorerwärmte Metallformen gelegt und mit flüssigem Paraffin übergossen. Der beschriftete Teil der Einbettungskapsel wurde zur Abdeckung und späteren Identifizierung der ausgehärteten Paraffinblöcke verwendet. Nach dem Ausgießen wurden die Metallformen auf 5°C ausgehärtet (Kühlplatte EG1150C, Leica Instruments GmbH, Nussloch, Deutschland). Die Aufbewahrung der Paraffinblöcke erfolgte nach Entfernung der Metallformen in dafür vorgesehenen Aufbewahrungsboxen (Medite Medizinprodukte, Braunschweig, Deutschland) bei Raumtemperatur und Dunkelheit.
6.3.3 Schneiden
Mittels eines Rotationsmikrotoms (Leitz 1512, Leica Instruments, Nussloch, Deutschland) wurden geeignete Schnitte erstellt. Dafür wurde jeweils ein Paraffinblock in die vorgesehene Halterung eingespannt, die Anschnittfläche mittels Justiervorrichtungen in eine zur Mikrotomklinge (Microtome Blades S35, FEATHER, Japan) parallelen Postition überführt und durch manuelle Bedienung des Rotationsrades der Block relativ zur Klinge auf und ab bewegt. Der automatische Vorschub wurde auf 4µm eingestellt. Die dadurch generierten Schnitte wurden mit Hilfe eines befeuchteten Pinsels in ein mit destilliertem Wasser gefülltes, auf 40°C erwärmtes Wasserbad (Paraffinstreckbad GFL Typ 1052, Gesellschaft für Labortechnik GmbH Burgwedel) überführt, das zur Glättung der einzelnen Schnitte diente. Die Schnitte wurden auf angewinkelt eingetauchte Objektträger aus Glas (HistoBond® adhäsive Objektträger, Paul Marienfeld GmbH&Co.KG, Lauda-Königshofen) gezogen und über Nacht bei 60°C in einem Wärmeschrank getrocknet.
Die Aufbewahrung der so erzeugten Schnitte erfolgte bis zur Weiterverarbeitung in histologischen Schnittkästen bei Raumtemperatur und Dunkelheit.
6.3.4 Standardfärbungen
6.3.4.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Mit Hilfe der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) konnten die Zellkerne und das Zytoplasma der Gewebe beurteilt werden. Durch das basische Hämatoxylin des Hämalauns wird eine violette Färbung der basophilen Zellkerne bewirkt, wohingegen
Material und Methoden
das azidophile Zytoplasma der Zellen eine pinke Farbe durch den saueren Farbstoff Eosin erhält. Zur morphologischen Beurteilung des jeweiligen Präparates wurde an mindestens einem Schnitt eines jeden angeschnittenen Blockes eine HE-Färbung vorgenommen.
Die Färbemethode kann in die vier Schritte Entparaffinierung, Rehydratation, Färbung, Dehydratation sowie ein anschließendes Eindecken der Schnitte eingeteilt werden. Das verwendete Färbeprotokoll zur HE-Färbung ist in Tabelle 5 dargestellt.
Tab.5: Protokoll der HE-Färbung, Lösungen: Kap.10.18.1.
Die Behandlung mit Toluidinblau ist eine weitere histologische Standardfärbung, mit deren Hilfe Zellen mit metachromatischen Eigenschaften dargestellt werden können.
Die basophile Granula von Mastzellen reagiert mit Toluidinblau zu einem violetten
Material und Methoden
Farbstoff, der diese Zellen von den verschiedenen Blautönen der anderen Zellen im glatten Muskelgewebe durch eine Violett-Färbung hervorhebt (Yong, 1997)
Diese Methode folgte dem gleichen Grundschema wie die HE- Färbung. Da es sich um eine monochromatische Färbung handelte, kam neben Toluidinblau kein weiterer Farbstoff zum Einsatz.
Die Küvetten und Färbeschiffchen wurden wie für die HE-Färbung bestückt.
6.3.5 Immunhistochemie
Mit Hilfe der Immunhistochemie kann man einen histologischen Schnitt anhand der Lokalisation von bestimmten Antigenen beurteilen. Nach verschiedenen Vorbehandlungen erfolgt eine Inkubation mit einem geeigneten Antikörper, der das zu untersuchende Antigen detektiert. Dieser sogenannte Primärantikörper wird dann durch einen weiteren Antikörper, der gegen die Spezies, in der der Primärantikörper
Material und Methoden
generiert wurde, gerichtet ist, detektiert. Zur Visualisierung ist an den Sekundärantikörper das Enzym Meerrettich-Peroxidase gekoppelt, das nach Zugabe eines passenden Substrates einen Farbumschlag an der jeweiligen Lokalisation bewirkt.
Im vorliegenden Versuch sollten Zellen anhand ihrer Co-Expression von CD117 und Vimentin identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll zur Doppelfärbung etabliert, bei dem nacheinander zuerst die Expression von CD117 mittels Primär- und Sekundärantikörper und anschließend die Expression von Vimentin mittels Primär- und Sekundärantikörper erfolgten. Zur Detektion von CD117 wurde der Antikörper Polyclonal Rabbit Anti-Human CD117, c-kit (Dako, Glostrup, Dänemark) verwendet, da dieser Antikörper auch im Rind zu einer Detektion von CD117 führt (Tsikolia et al., 2009). Als Sekundärantikörper diente hierfür Dako EnVision + System-HRP (DAB) For use with Rabbit Primary Antibodies (Dako, Glostrup, Dänemark). Die Visualisierung erfolgte durch das Substrat 3,3‘ Diaminobenzidin (DAB), das durch die Meerrettich-Peroxidase des Sekundärantikörpers in einen braunen unlöslichen Farbstoff umgewandelt wird.
Die Detektion von Vimentin wurde mit Hilfe des Antikörpers Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone Vim 3B4 (Dako, Glostrup, Dänemak) vorgenommen. Hierbei diente Dako EnVision + System-HRP (DAB) For use with Mouse Primary Antibodies (Dako, Glostrup, Dänemark) als Sekundärantikörper. Der Sekundärantikörper wurde durch das Substrat HISTOPRIME® Histogreen Substratkit für Peroxidase (Linaris Biologische Produkte GmbH, Dossenheim, Deutschland) detektiert, das an den Stellen, an denen es zur Antikörperbindung kam mittels Meerrettich-Peroxidase in einen grünen Farbstoff umgewandelt wurde.
Zur Darstellung anderer Strukturen des jeweiligen histologischen Schnittes wurde außerdem eine kurze Gegenfärbung mit Hämalaun nach Delafield durchgeführt, so dass letztendlich drei unterschiedliche Farben pro Schnitt zu sehen waren: Braun zur Detektion von CD117, Grün zur Detektion von Vimentin und Blau-Violett als Detektion der Zellkerne.
Material und Methoden 6.3.6 Färbeprotokoll Doppelfärbung
Tag 1
Die Doppelfärbung umfasste ein dreitägiges Protokoll, an dessen Beginn wie bei den anderen Färbemethoden die Entparaffinierung der Schnitte stand. Nach Inkubation in zwei Xylolbädern wurden die Schnitte nacheinander in Isopropanol, absolutem Alkohol, 80%igem Alkohol mit Zusatz von 0,6% Wasserstoffperoxid und schließlich in 70%igem Alkohol rehydriert, worauf ein dreimaliges Bad in jeweils frischem PBS folgte. Danach wurden die Schnitte 10min lang in EDTA-Puffer, dessen pH- Wert mit Natronlauge auf 9,0 eingestellt wurde bei 96-99°C gekocht. Diese Vorbehandlung diente dem Demaskieren der Antigene. Alternativ wurden einige Schnitte durch ein dreißigminütiges Kochen bei 96-99°C in TEC-Puffer vorbehandelt, da sich in der ersten Vorbehandlung mehrere Schnitte von den Objektträgern ablösten, was sich auch durch Wiederholungen des Versuches mit weiteren Schnitten desselben betreffenden Blockes nicht beheben ließ.
Die Vorbehandlung der Schnitte fand in Objektträgerschiffchen in einem 2L fassenden Becherglas auf einer Heizplatte mit Magnetrührer (Magnetrührer MR Hei-Standard, Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Deutschland) statt.
Die Temperatur wurde mit einem in der Lösung stehenden Thermometer regelmäßig kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Die Durchmischung der Lösung wurde durch eine moderate Rotation des Magnetrührers gewährleistet. Die Inkubationszeit wurde erst bei Erreichen einer Temperatur von mindestens 96°C gestartet. Nach Ende der Inkubation wurde das Becherglas von der Heizplatte genommen und auf einer weiteren Rührplatte unter fortlaufender Rotation des Magnetrührers bis auf 60°C abgekühlt. Es schloss sich ein dreimaliges Bad in jeweils frischem PBS an.
Zur Blockierung von unspezifischen Bindungsstellen wurden die Schnitte danach einzeln mit 20%igem Ziegenserum (NGS, Normal Goat Serum) behandelt. Die einzelnen Objektträger wurden dafür mit einem Papiertaschentuch so trockengewischt, dass ein kleiner Flüssigkeitsfilm aus PBS nur noch den Schnitt bedeckte. Die Objektträger wurden dann waagerecht nebeneinander in eine mit feuchten Tüchern ausgelegte Plexiglasbox gelegt um ein Austrocknen zu verhindern.
Auf jeden Schnitt wurden 50µl des in PBS gelösten NGS pipettiert. Nach einer
Material und Methoden
erste Primärantikörper (Polyclonal Rabbit Anti Human CD117, c-kit, DAKO, Glostrup, Dänemark) der mittels Antikörperverdünner (Diamond: Antibody Diluent, Cell Marque, Rocklin, CA 95677, USA) 1:100 (1:200 bei TEC-Puffer) verdünnt wurde in einer Menge von 50µl auf die Schnitte pipettiert. Die Schnitte wurden so in befeuchteten Plexiglaskästen über Nacht bei 4°C inkubiert, um den CD117-Antikörpern eine spezifische Bindung an ihr Antigen zu ermöglichen.
Tag 2
Am zweiten Morgen wurden die Schnitte dreimal in je frischem PBS gespült um nicht gebundene Antikörper abzuspülen, überschüssiges PBS wurde anschließend abgewischt und mittels Tropfflasche wurde der Sekundärantikörper (DakoEnVision+
System-HRP (DAB) For use with Rabbit Primary Antibodies, DAKO, Glostrup, Dänemark) auf die im feuchten Plexiglaskasten liegenden Objektträger gegeben.
Nach einer Inkubation von 30min erfolgte ein erneutes dreimaliges Spülen in PBS zur Entfernung von überschüssigem Antikörper. Danach wurde die überschüssige Flüssigkeit wieder mittels Papiertaschentuch weggewischt und die Objektträger in den feuchten Kasten gelegt. Zur Visualisierung der CD117-Antigene wurde das Substrat DAB auf die Schnitte pipettiert. Die Inkubationsdauer hierfür betrug 5min und wurde durch regelmäßige mikroskopische Kontrolle überwacht. Die Schnitte wurden anschließend für 5sec in PBS inkubiert und dann für 10min unter fließendem Leitungswasser gespült, um überschüssiges Reagenz zu entfernen. Es folgte ein kurzes Schwenken in 0,1%iger Salzsäure und eine erneute Inkubation in je dreimal frischem PBS und eine erneute Behandlung mit NGS, die in gleicher Weise wie am ersten Tag durchgeführt wurde. Die Zugabe und Inkubation des zweiten Primärantikörpers (Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone Vim 3B4 DAKO, Glostrup, Dänemark), der jedoch 1:1000 verdünnt wurde, erfolgte in Analogie zum ersten Primärantikörper.
Tag 3
Nicht gebundene Antikörper wurden durch dreimaliges Spülen in je frischem TBS-T-Puffer entfernt, nach Abwischen der überschüssigen Flüssigkeit wurde die Behandlung mit dem zweiten Sekundärantikörper (Dako EnVision+ System-HRP (DAB) For use with Mouse Primary Antibodies, DAKO, Glostrup, Dänemark) ebenfalls in Analogie zum ersten Sekundärantikörper vorgenommen. Es folgte ein
Material und Methoden
dreimaliges Waschen in TBS-T-Puffer zur Entfernung von nicht gebundenen Antikörpern. Die Visualisierung der Vimentin-Antigene fand mit dem Substrat Histogreen (HISTOPRIME®, HistoGreen, HRP-Substrate-Kit, Linaris, Biologische Produkte GmbH, Wertheim, Deutschland) analog zur Behandlung mit DAB und unter mikroskopischer Kontrolle statt. Dieser Schritt wurde durch eine fünfsekündige Inkubation in TBS-T und ein zehnminütiges Spülen unter fließendem Wasser beendet. Für die Gegenfärbung des Gewebes wurden die Objektträger nach dem Abspülen des überschüssigen Reagenz für ein bis zwei Sekunden in eine Küvette mit Hämalaun nach Delafield getaucht und zur Farbreaktion anschließend für 15min unter fließendem Wasser gespült. Es folgte ein Bad in PBS und die anschließende Dehydrierung. Dafür wurden die Schnitte erst je 30sec in drei Küvetten mit absolutem Alkohol und zwei Küvetten mit Xylol geschwenkt. Im Anschluss fand das Eindecken mit Eukitt statt.
Die Reaktionen, mit Ausnahme der Inkubation mit dem Primärantikörper, fanden bei Raumtemperatur statt, die Objektträger wurden in Objektträgerschiffchen mit maximal 19 Objektträgern in den Lösungen inkubiert. Die Lösungen befanden sich in Küvetten mit einem Füllstand von 200ml. Die Alkoholreihen am Anfang und Ende des Versuches wurden für maximal sechs Durchgänge verwendet.
Ein detailliertes Protokoll der Doppelfärbung ist in Kap.10.16 zu finden.
6.3.6.1 Färbeprotokoll Einzelmarkierung
Zur einzelnen Darstellung der Verteilung von CD117 und Vimentin im bovinen Uterus wurden auch Präparate erstellt, in denen entweder CD117 oder Vimentin mittels DAB detektiert wurde. Das Färbeprotokoll für CD117 entsprach dem Protokoll der Doppelfärbung bis Tag 2. Nach Abspülen der überschüssigen DAB-Reste wurden die Schnitte mit Hämalaun gegengefärbt, dehydriert und mit Eukitt eingedeckt. Für die Detektion von Vimentin wurde genauso vorgegangen. Hier wurde der Polyclonal Rabbit Anti-Human CD117, c-kit (Dako, Glostrup, Dänemark) durch Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone Vim 3B4 (Dako, Glostrup, Dänemark) ersetzt und das entsprechende Anti-mouse-Detektionssystem verwendet.
Material und Methoden 6.3.7 Auswertung Histologie
Die Auswertung der histologischen Präparate fand lichtmikroskopisch statt (Mikroskop Axioskop, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena; Mikroskop-Kamera DP-70, Olympus Europa GmbH, Hamburg; Software DP-Soft, Olympus Europa GmbH, Hamburg). Die aufgenommenen Bilder wurden als JPEG-Datei gespeichert. Die Gewebe der in der Histologie verwendeten Tiere sind in Tab.7 aufgelistet.
Tab.7: Histologisch untersuchte Tiere. Jedes Kreuz steht für eine Gewebeprobe des Str. circulare und des Str. longitudinale. Die Tiere 1-4 wurden im NO-Versuch in der Mikroelektrode untersucht. Die Proben der Tiere 6-9 wurden direkt auf dem Schlachthof präpariert und in Formalinlösung überführt.
Die Zahlen in Klammern geben den jeweiligen Monat der Trächtigkeit an.
Tiere Trächtigkeitsstatus Behandlung Versuche
ohne KH SNP frisch SNP zerfallen Histologie Mikroelektrode
Tier 1 nicht trächtig x x x x x
Tier 2 Trächtigkeitsmitte (4) x x x x x Tier 3 Trächtigkeitsmitte (5) x x x x x
Tier 4 Kaiserschnitt x x x x x
Tier 5 Kaiserschnitt x x x x
Tier 6 nicht trächtig x x
Tier 7 nicht trächtig x x
Tier 8 Trächtigkeitsmitte (5) x x
Tier 9 Trächtigkeitsmitte (5) x x
6.3.7.1 Immunhistochemische Doppelmarkierung
Für die Immunhistochemische Doppelmarkierung zur Erhebung der grundsätzlichen Zellverteilung wurden alle 9 Tiere verwendet, es wurden die Gruppen ohne Behandlung und mit KH Behandlung ausgewertet. Ohne Behandlung waren solche Proben, die auf dem Schlachthof direkt in Formol überführt wurden, die mit KH behandelten Proben wurden erst nach einer mehrstündigen Inkubation in KH in Formol überführt. Die Auswertung zum NO-Versuch fand in den Tieren 1-5 statt.
Material und Methoden Auswertungsschema
Für jedes Tier wurden für das Str. circulare und das Str. longitudinale jeweils drei unterschiedliche Lokalisationen ausgewertet. Je Lokalisation und Gewebe wurden mindestens zwei (bis zu acht) histologische Präparate erstellt, von denen das jeweils beste Färbeergebnis zur weiteren Auswertung verwendet wurde. Von jedem in die Auswertung eingegangenen Präparat wurden 10 bis 20 Bilder (221µm x 166,4µm) in der 400fachen Vergrößerung aufgenommen, die einen repräsentativen Querschnitt über das Präparat darstellten. Bei der Aufnahme der Bilder zur Auswertung der Zellzahl im Myometrium wurde darauf geachtet, dass keine Drüsen, Subserosa oder großen Gefäße mit in das Gesichtsfeld fielen, um ein möglichst klares Bild der Verhältnisse im Myometrium zu bekommen. In den untersuchten Bildern wurden folgende Gruppen erfasst (Abb.4)
Abb.4: Auswertungsschema CD117/VIM positive Zellen waren entweder Telozyten verdächtige Zellen, Mastzellen, Endothelzellen, oder ließen sich nicht eindeutig zuordnen. Weitere Erläuterungen siehe Text.
CD117 positive Zellen: Zellen die durch DAB eine Braunfärbung zeigten.
CD117/Vimentin (CD117/VIM) positive Zellen: Zellen die sowohl eine Braun- (DAB) als auch eine Grünfärbung (Histogreen) zeigten.
Mastzellen: Zellen, die eine kräftige Braunfärbung für CD117 zeigten und ggf. auch Vimentin positiv waren. Außerdem waren Mastzellen von runder bis ovoider Form und hatten Granula im Zytoplasma.
Telozyten verdächtige Zellen: Zellen, die eine Braunfärbung sowie eine Grünfärbung
Material und Methoden
Zellfortsätze erkennen ließen oder die Andeutung eines solchen Fortsatzes vermuten ließen.
Nicht eindeutige Zellen: Zellen, die nicht eindeutig den anderen Gruppen zuzuordnen waren. Hierunter konnten Mastzellen in einer sehr elongierten Form fallen, sowie Endothelzellen, die ebenfalls eine positive Reaktion auf CD117 und Vimentin aufwiesen und nicht klar als Endothelzellen zu erkennen waren. Außerdem wurden in dieser Gruppe Zellen erfasst, die Zellfortsätze zeigten, jedoch nur eine Grünfärbung (für Vimentin) und keine Braunfärbung (für CD117) erkennen ließen.
Zusätzlich zu den absoluten Zellzahlen wurde der Anteil derjenigen CD117/Vimentin positiven Zellen erfasst, die in der Umgebung von myometrialen Blutgefäßen lagen.
Die Zellen je Bild wurden den einzelnen Zellgruppen zugeordnet. Je Präparat wurde die Summe aus 10 ausgewerteten Bildern gebildet. Die Ergebnisse von drei Präparaten unterschiedlicher Lokalisation je Tier wurden gemittelt, die Auswertung fand aufgrund der geringen Tierzahl der Kaiserschnittgruppe deskriptiv und graphisch statt (SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics, Excel 2007).
Dabei wurden die Gewebe (Str. circulare und Str. longitudinale) und der Trächtigkeitsverlauf (Nicht trächtig, Trächtigkeitsmitte, Kaiserschnitt) untereinander verglichen.
6.3.7.2 Mastzellen
Zur Abgrenzung von Telozyten verdächtigen Zellen und Mastzellen wurden die Lokalisation und Morphologie von Mastzellen in den Präparaten der Doppelfärbung und den mit Toluidinblau gefärbten Präparaten miteinander verglichen. Hierbei fand keine Quantifizierung statt.
6.3.7.3 HE Färbung zur Quantifizierung der Zelldichte
Von einem Präparat je Tier des Str. longitudinale wurden in drei Bildern der 400fachen Vergrößerung (221µm x 166,4µm) die Anzahlen der Zellkerne ausgezählt und je Bild gemittelt. In den gleichen Bildern wurde ebenfalls der längste Durchmesser von jeweils mindestens 10-20 Zellkernen vermessen und ebenfalls erst je Bild und danach je Tier gemittelt. (Nicht trächtig=3 Tiere, Trächtigkeitsmitte=3 Tiere, Trächtig (Kaiserschnitt)=2 Tiere). Die Auswertung der Zelldichte fand aufgrund
Material und Methoden
der geringen Tierzahl der Kaiserschnittgruppe deskriptiv statt (SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics).
6.3.7.4 Einfluss von SNP als NO-Donor auf das Auftreten von CD117-positiven Zellen im bovinen Myometrium
Von Tier 1 bis Tier 5 wurden hierfür jeweils drei Gewebeproben unterschiedlicher Lokalisation des Str. circulare und des Str. longitudinale wie unter Kap.6.2.6.2 beschrieben in KH, SNP+ und SNP- inkubiert. Die Zellen wurden wie unter 6.3.7.1 beschrieben quantifiziert. Die Auswertung der Daten fand deskriptiv statt (Excel 2007).
Ergebnisse 7 Ergebnisse
7.1 Elektrophysiologie
7.1.1 RMP (Ruhemembranpotential)
Für die Auswertungen der Potentialdifferenzen wurde die einzelne punktierte Zelle als biologische Einheit betrachtet. Die Werte für RMP im einzelnen Tier lagen weiter auseinander als zwischen den Tieren (Abb.5).
Abb.5: RMP im Str. circulare. Zellen bei einem KH-Puffer mit einem KCl-Gehalt von 5,4mmol/L. Es
Abb.5: RMP im Str. circulare. Zellen bei einem KH-Puffer mit einem KCl-Gehalt von 5,4mmol/L. Es