6 Material und Methoden
6.3 Histologie
6.3.6 Färbeprotokoll Doppelfärbung
6.3.6.1 Färbeprotokoll Einzelmarkierung
Zur einzelnen Darstellung der Verteilung von CD117 und Vimentin im bovinen Uterus wurden auch Präparate erstellt, in denen entweder CD117 oder Vimentin mittels DAB detektiert wurde. Das Färbeprotokoll für CD117 entsprach dem Protokoll der Doppelfärbung bis Tag 2. Nach Abspülen der überschüssigen DAB-Reste wurden die Schnitte mit Hämalaun gegengefärbt, dehydriert und mit Eukitt eingedeckt. Für die Detektion von Vimentin wurde genauso vorgegangen. Hier wurde der Polyclonal Rabbit Anti-Human CD117, c-kit (Dako, Glostrup, Dänemark) durch Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone Vim 3B4 (Dako, Glostrup, Dänemark) ersetzt und das entsprechende Anti-mouse-Detektionssystem verwendet.
Material und Methoden 6.3.7 Auswertung Histologie
Die Auswertung der histologischen Präparate fand lichtmikroskopisch statt (Mikroskop Axioskop, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena; Mikroskop-Kamera DP-70, Olympus Europa GmbH, Hamburg; Software DP-Soft, Olympus Europa GmbH, Hamburg). Die aufgenommenen Bilder wurden als JPEG-Datei gespeichert. Die Gewebe der in der Histologie verwendeten Tiere sind in Tab.7 aufgelistet.
Tab.7: Histologisch untersuchte Tiere. Jedes Kreuz steht für eine Gewebeprobe des Str. circulare und des Str. longitudinale. Die Tiere 1-4 wurden im NO-Versuch in der Mikroelektrode untersucht. Die Proben der Tiere 6-9 wurden direkt auf dem Schlachthof präpariert und in Formalinlösung überführt.
Die Zahlen in Klammern geben den jeweiligen Monat der Trächtigkeit an.
Tiere Trächtigkeitsstatus Behandlung Versuche
ohne KH SNP frisch SNP zerfallen Histologie Mikroelektrode
Tier 1 nicht trächtig x x x x x
Tier 2 Trächtigkeitsmitte (4) x x x x x Tier 3 Trächtigkeitsmitte (5) x x x x x
Tier 4 Kaiserschnitt x x x x x
Tier 5 Kaiserschnitt x x x x
Tier 6 nicht trächtig x x
Tier 7 nicht trächtig x x
Tier 8 Trächtigkeitsmitte (5) x x
Tier 9 Trächtigkeitsmitte (5) x x
6.3.7.1 Immunhistochemische Doppelmarkierung
Für die Immunhistochemische Doppelmarkierung zur Erhebung der grundsätzlichen Zellverteilung wurden alle 9 Tiere verwendet, es wurden die Gruppen ohne Behandlung und mit KH Behandlung ausgewertet. Ohne Behandlung waren solche Proben, die auf dem Schlachthof direkt in Formol überführt wurden, die mit KH behandelten Proben wurden erst nach einer mehrstündigen Inkubation in KH in Formol überführt. Die Auswertung zum NO-Versuch fand in den Tieren 1-5 statt.
Material und Methoden Auswertungsschema
Für jedes Tier wurden für das Str. circulare und das Str. longitudinale jeweils drei unterschiedliche Lokalisationen ausgewertet. Je Lokalisation und Gewebe wurden mindestens zwei (bis zu acht) histologische Präparate erstellt, von denen das jeweils beste Färbeergebnis zur weiteren Auswertung verwendet wurde. Von jedem in die Auswertung eingegangenen Präparat wurden 10 bis 20 Bilder (221µm x 166,4µm) in der 400fachen Vergrößerung aufgenommen, die einen repräsentativen Querschnitt über das Präparat darstellten. Bei der Aufnahme der Bilder zur Auswertung der Zellzahl im Myometrium wurde darauf geachtet, dass keine Drüsen, Subserosa oder großen Gefäße mit in das Gesichtsfeld fielen, um ein möglichst klares Bild der Verhältnisse im Myometrium zu bekommen. In den untersuchten Bildern wurden folgende Gruppen erfasst (Abb.4)
Abb.4: Auswertungsschema CD117/VIM positive Zellen waren entweder Telozyten verdächtige Zellen, Mastzellen, Endothelzellen, oder ließen sich nicht eindeutig zuordnen. Weitere Erläuterungen siehe Text.
CD117 positive Zellen: Zellen die durch DAB eine Braunfärbung zeigten.
CD117/Vimentin (CD117/VIM) positive Zellen: Zellen die sowohl eine Braun- (DAB) als auch eine Grünfärbung (Histogreen) zeigten.
Mastzellen: Zellen, die eine kräftige Braunfärbung für CD117 zeigten und ggf. auch Vimentin positiv waren. Außerdem waren Mastzellen von runder bis ovoider Form und hatten Granula im Zytoplasma.
Telozyten verdächtige Zellen: Zellen, die eine Braunfärbung sowie eine Grünfärbung
Material und Methoden
Zellfortsätze erkennen ließen oder die Andeutung eines solchen Fortsatzes vermuten ließen.
Nicht eindeutige Zellen: Zellen, die nicht eindeutig den anderen Gruppen zuzuordnen waren. Hierunter konnten Mastzellen in einer sehr elongierten Form fallen, sowie Endothelzellen, die ebenfalls eine positive Reaktion auf CD117 und Vimentin aufwiesen und nicht klar als Endothelzellen zu erkennen waren. Außerdem wurden in dieser Gruppe Zellen erfasst, die Zellfortsätze zeigten, jedoch nur eine Grünfärbung (für Vimentin) und keine Braunfärbung (für CD117) erkennen ließen.
Zusätzlich zu den absoluten Zellzahlen wurde der Anteil derjenigen CD117/Vimentin positiven Zellen erfasst, die in der Umgebung von myometrialen Blutgefäßen lagen.
Die Zellen je Bild wurden den einzelnen Zellgruppen zugeordnet. Je Präparat wurde die Summe aus 10 ausgewerteten Bildern gebildet. Die Ergebnisse von drei Präparaten unterschiedlicher Lokalisation je Tier wurden gemittelt, die Auswertung fand aufgrund der geringen Tierzahl der Kaiserschnittgruppe deskriptiv und graphisch statt (SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics, Excel 2007).
Dabei wurden die Gewebe (Str. circulare und Str. longitudinale) und der Trächtigkeitsverlauf (Nicht trächtig, Trächtigkeitsmitte, Kaiserschnitt) untereinander verglichen.
6.3.7.2 Mastzellen
Zur Abgrenzung von Telozyten verdächtigen Zellen und Mastzellen wurden die Lokalisation und Morphologie von Mastzellen in den Präparaten der Doppelfärbung und den mit Toluidinblau gefärbten Präparaten miteinander verglichen. Hierbei fand keine Quantifizierung statt.
6.3.7.3 HE Färbung zur Quantifizierung der Zelldichte
Von einem Präparat je Tier des Str. longitudinale wurden in drei Bildern der 400fachen Vergrößerung (221µm x 166,4µm) die Anzahlen der Zellkerne ausgezählt und je Bild gemittelt. In den gleichen Bildern wurde ebenfalls der längste Durchmesser von jeweils mindestens 10-20 Zellkernen vermessen und ebenfalls erst je Bild und danach je Tier gemittelt. (Nicht trächtig=3 Tiere, Trächtigkeitsmitte=3 Tiere, Trächtig (Kaiserschnitt)=2 Tiere). Die Auswertung der Zelldichte fand aufgrund
Material und Methoden
der geringen Tierzahl der Kaiserschnittgruppe deskriptiv statt (SAS Enterprise Guide 4.3 OnDemand for Academics).
6.3.7.4 Einfluss von SNP als NO-Donor auf das Auftreten von CD117-positiven Zellen im bovinen Myometrium
Von Tier 1 bis Tier 5 wurden hierfür jeweils drei Gewebeproben unterschiedlicher Lokalisation des Str. circulare und des Str. longitudinale wie unter Kap.6.2.6.2 beschrieben in KH, SNP+ und SNP- inkubiert. Die Zellen wurden wie unter 6.3.7.1 beschrieben quantifiziert. Die Auswertung der Daten fand deskriptiv statt (Excel 2007).
Ergebnisse 7 Ergebnisse
7.1 Elektrophysiologie
7.1.1 RMP (Ruhemembranpotential)
Für die Auswertungen der Potentialdifferenzen wurde die einzelne punktierte Zelle als biologische Einheit betrachtet. Die Werte für RMP im einzelnen Tier lagen weiter auseinander als zwischen den Tieren (Abb.5).
Abb.5: RMP im Str. circulare. Zellen bei einem KH-Puffer mit einem KCl-Gehalt von 5,4mmol/L. Es wurden nur Punktionen berücksichtigt, deren Quotient des Membranpotentials von Zeitpunkt 80sec und Zeitpunkt 20sec mindestens 0,75 betrug. In vertikaler Richtung ist das RMP in mV aufgetragen (y-Achse). Jeder Punkt entspricht einer Zellpunktion, die vertikal übereinandergestapelten Punkte gehören jeweils zu einem Tier (x-Achse). Die Schwankungsbreite im einzelnen Tier ist höher als die Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren.
Ergebnisse
Nach erfolgreicher Punktion kam es vom erreichten negativsten Wert (PDM Max) meist zu einem weiteren abrupten Anstieg der Potentialdifferenz.
Abb.6: Korrelation von PDM Max und RMP, es wurden alle punktierten Zellen verschiedener Versuche (ohne SNP-Tiere) verwendet, deren Quotient des Membranpotentials von Zeitpunkt 80sec und Zeitpunkt 20sec mindestens 0,75 betrug.
Der Anstieg des RMP aller relevanten erfassten Zellen (n=1695) betrug im Mittel +3,15mV von PD20 zu PD80. Nach Aussortierung derjenigen Punktionen, deren Quotient des Verhältnisses PD80sec/PD20sec kleiner als 0,75 war, betrug der Anstieg der erfassten Zellen (n=1270) nur noch +0,66mV im Mittel. Diese Filterung führte zu dem Ausschluss von 25% der im Flachschreiber erfassten Zellen.
Bei einer Gegenüberstellung von den Zellen die zu Beginn einer Messung punktiert wurden, und den Zellen, die nach teilweise mehrstündiger Messung des einzelnen Gewebes punktiert wurden (KCL-Konzentration bei 5,4mmol/L KCL, Punktion 1 gegenüber Punktion 8) ließ sich kein signifikanter Unterschied Wilcoxon Zwei-Stichprobentest ermitteln (Tab.8). Es konnte also davon ausgegangen werden, dass ein zeitlicher Unterschied innerhalb der Messungen vernachlässigt werden kann.
Ergebnisse Str. longitudinale 0,5087 0,6650 0,3153 0,1113
Die Gewebe wurden bis zu zwei Tage lang für die Untersuchung aufbewahrt (Kap.10.9). Vergleicht man die gemessenen RMP des Str. circulare aller Kaliumkonzentrationen bei jeweils drei Tieren die an unterschiedlichen Tagen in der Mikroelektrode gemessen wurden (Tag 0, Tag 1 und Tag 2), lässt sich zwar ein signifikanter Unterschied des Messtages im Kruskal-Wallis-Test feststellen, bei Betrachtung des zeitlichen Verlaufs stellt sich dies aber nicht als regelmäßige Veränderung des RMP dar (Anhang). Die Mediane für das RMP von Tag 0 (-17,4mV) und Tag 2 (-16,8mV) waren ähnlich.
7.1.2 Unterschiedliche Typen des Membranpotentials
Die neun PDM-Typen (Tab.3) waren je nach Gewebetyp (Str. circulare bzw. Str.
longitudinale) oder Trächtigkeitsstatus unterschiedlich verteilt (Tab.9). Der insgesamt am häufigsten vertretene PDM-Typ war der PDM-Typ 0, die anderen Typen zeigen je nach Gewebe oder Trächtigkeit mehr oder weniger große Schwankungen.
Die PDM-Typen wurden für die weiteren Auswertungen zusammengefasst. Die Gruppen PDM-Typ 5 und PDM-Typ 8 wurden aus methodischen Gesichtspunkten ausgeschlossen und nicht weiter berücksichtigt, da sie als fehlgeschlagene Punktionen angesehen wurden, durch die sich keine eindeutige Aussage treffen ließ.
Die weiteren PDM-Typen wurden je nach Auftreten von spontanen Schwankungen des RMP in zwei Gruppen unterteilt:
1.) Zellen ohne Potentialschwankungen PDM-Typen 0 und 4
2.) Zellen mit Potentialschwankungen PDM-Typen 1; 2; 3; 6 und 7 7.1.3 Anteil von Zellen MIT und OHNE Potentialschwankungen
Der Anteil von Zellen mit Potentialschwankungen schien im Str. circulare bei trächtigen Tieren höher zu sein als der von nicht trächtigen Tieren (Abb.7). Im Str.
longitudinale ließ sich ein solcher Trend nicht vermuten, hier schien der Anteil an
Ergebnisse
Zellen mit Potentialschwankungen außer bei den nicht trächtigen Tieren geringer zu sein als im Str. circulare.
Tab.9: Verteilung von PDM-Typen nach Gewebe und Trächtigkeit in %. N. tr.=nicht trächtig; M 1-4=Monat 1-4; M 5-9=Monat 5-9; KS=Kaiserschnitt. n=Anzahl der punktierten Zellen bei einem KH-Puffer mit einem KCl-Gehalt von 5,4mmol/L. Es wurden nur Punktionen berücksichtigt, deren Quotient des Membranpotentials von Zeitpunkt 80sec und Zeitpunkt 20sec mindestens 0,75 betrug. Die Verteilung der PDM-Typen variierte je nach Gewebe und Trächtigkeitsstatus.
Str. circulare Str. longitudinale
PDM N. tr. M 1-4 M 5-9 KS N. tr. M 1-4 M 5-9 KS
0 47,8 26,7 29,2 25,0 23,4 35,1 33,3 36,8
1 4,3 2,2 10,4 0,0 3,9 2,7 4,5 2,6
2 5,4 6,7 2,1 10,0 6,5 5,4 1,5 10,5
3 4,3 0,0 4,2 7,5 1,3 10,8 9,1 2,6
4 4,3 6,7 8,3 5,0 16,9 0,0 12,1 18,4
5 6,5 2,2 2,1 5,0 2,6 2,7 7,6 7,9
6 9,8 15,6 8,3 10,0 18,2 10,8 6,1 2,6
7 8,7 26,7 25,0 30,0 6,5 13,5 12,1 15,8
8 8,7 13,3 10,4 7,5 20,8 18,9 13,6 2,6
n = 92 45 48 40 77 37 66 38
Abb.7: Anteil der Zellen mit Potentialschwankungen in % der punktierten Zellen bei einem KH-Puffer mit 5,4mmol/L KCl. Es wurden nur Punktionen berücksichtigt, deren Quotient des Membranpotentials von Zeitpunkt 80sec und Zeitpunkt 20sec mindestens 0,75 betrug. x-Achse:
Trächtigkeitsverlauf, Anzahl der punktierten Zellen: Str. circulare: n=78; n=38; n=42; n=35 Zellen; Str.
longitudinale: n=59; n=29; n=52; n=34 Zellen. y-Achse: prozentuale Verteilung von Zellen mit und ohne Schwankungen. Der Anteil der Zellen mit Potentialschwankungen betrug je nach Gewebe und Trächtigkeitsstatus 40–60%.
Ergebnisse
7.1.4 RMP in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe
7.1.4.1 Zellen OHNE Potentialschwankungen
Die Höhen der Potentialdifferenzen über der Membran in Zellen ohne Potentialschwankungen im RMP (Abb.8) waren vom jeweiligen Trächtigkeitsstatus abhängig (Abb.9). Sowohl im Str. circulare als auch im Str. longitudinale ergab sich ein signifikanter Unterschied für die Trächtigkeit. Aus der graphischen Darstellung heraus ist ersichtlich, dass die RMP mit zunehmender Trächtigkeit negativer wurden (Abb.9). Während die Medianwerte für die RMP bei nicht trächtigen Tieren bei -15,2mV (Str. circulare) bzw. -14,5mV (Str. longitudinale) lagen, nahmen sie bei Kaiserschnitttieren -22,1mV (Str. circulare), bzw. -22,0mV (Str. longitudinale) an. Die beiden Gewebelokalisationen zeigten nur bei Tieren in der ersten Hälfte der Trächtigkeit einen signifikanten Unterschied. In diesem Trächtigkeitsstadium betrug der Medianwert von RMP im Str. circulare -19,3 mV und im Str. longitudinale -14,6 mV (Abb.9).
Abb.8: Beispiel eines RMP einer Zelle ohne Potentialschwankungen.
Nach der Punktion (Stern) fiel das RMP abrupt auf einen bestimmten Wert ab (Pfeilspitze). x-Achse: Zeit; y-Achse:
RMP in mV.
Ergebnisse
Abb.9: RMP der Zellen OHNE Potentialschwankungen des bovinen Myometrium in vitro. Auf der x-Achse ist die fortschreitende Trächtigkeit aufgetragen. Gewebe: C=Str. circulare, L=Str. longitudinale, Die Anzahl bezieht sich auf die ausgewerteten Zellen. Box-Whiskers-Plots, Balken entsprechen Medianen, Whiskers dem 1,5fachen des Interquartilabstandes. Ausreißer sind als Punkte dargestellt.
Einfluss von Trächtigkeit: Im Str. circulare: P=0,0022; Im Str. longitudinale: P=0,0001. Einfluss von Gewebe: Nicht trächtig: P=0,1426; Monat 1-4: P=0,0046; Monat 5-9: P=0,3379; KS: P=0,9254
7.1.4.2 Zellen MIT Potentialschwankungen
Bei den Zellen, die Potentialschwankungen des Grundpotentials zeigten, wies nur das Str. circulare einen signifikanten Einfluss des Trächtigkeitsstadiums auf das RMP auf (Abb.11). Auch hierbei nahm RMP mit fortschreitender Trächtigkeit negativere Werte an, der Medianwert für RMP bei Zellen des Str. circulare nicht trächtiger Tieren betrug hier -17,7mV und nahm bei Kaiserschnitttieren einen Wert von -33,1mV an. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Muskelschichten konnte nicht ermittelt werden, hier gab es jedoch eine Tendenz für die Kaiserschnittgruppe. Den -33,1mV im Str. circulare standen hierbei -23,4mV als Medianwert für das Str. longitudinale gegenüber.
Ergebnisse
Abb.10: Beispiel eines RMP mit spontanen Depolarisationen (Potentialschwankungen). Nach der Punktion (Stern) fiel das RMP abrupt auf einen bestimmten Wert ab. Vom RMP gingen Depolarisationen mit unterschiedlichen Amplitudenhöhen aus (Pfeilspitzen). Neben den Depolarisationen waren bei einzelnen Messungen auch Artefakte zu verzeichnen, die bei der Sichtkontrolle im Oszilloskop kein regelmäßiges Muster zeigten (ausgehölte Pfeile). x-Achse: Zeit; y-Achse: RMP in mV.
Ergebnisse
Abb.11: RMP der Zellen MIT Potentialschwankungen des bovinen Myometrium in vitro. Auf der x-Achse ist die fortschreitende Trächtigkeit aufgetragen. Gewebe: C=Str. circulare, L=Str. longitudinale, Die Anzahl bezieht sich auf die ausgewerteten Zellen. Box-Whiskers-Plots, Balken entsprechen Medianen, Whiskers dem 1,5fachen des Interquartilabstandes. Ausreißer sind als Punkte dargestellt.
Einfluss von Trächtigkeit: Im Str. circulare: P=0,0242; Im Str. longitudinale: P=0,4637. Einfluss von Gewebe: Nicht trächtig: P=0,7088; Monat 1-4: P=0,2779; Monat 5-9: P=0,7498; KS: P=0,0628.
Zusammenfassend ließ sich für den Trächtigkeitsverlauf feststellen, dass Zellen ohne Schwankungen des RMP mit fortschreitender Trächtigkeit signifikant negativer werdende RMP aufwiesen. Für Zellen mit Potentialschwankungen konnte dies nur im Str. circulare gezeigt werden. Für das Gewebe ließ sich kein eindeutiger Einfluss feststellen, nominell hatten Zellen des Str. longitudinale ein etwas positiveres RMP gegenüber den Zellen des Str. circulare.
Ergebnisse 7.1.5 Schwankungen des RMP
7.1.5.1 Frequenzen der RMP-Schwankungen in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe
Die Punktionskurven der PDM-Typen 1; 2; 3; 5; 6 und 7 zeigten spontane Depolarisationen der Potentialdifferenz über der Zellmembran (Tab.3). PDM-Typ 5 wurde aus methodischen Gründen aussortiert (Kap.6.2.8), bei Typ 3 und PDM-Typ 7 handelte es sich um Potentialschwankungen mit einer im Vergleich zu den anderen Gruppen hohen Frequenz (über 10 pro Minute), diese Potentialschwankungen waren aufgrund ihres Erscheinungsbildes zum Teil nicht von Aktionspotentialen zu unterscheiden. Die Punktionskurven der PDM-Typen 1; 2 und 6 entsprachen graphisch dem Erscheinungsbild von vorangegangenen Untersuchungen zu slow waves im Labmagen, die mit gleicher Methode erfasst wurden (Zurr, 2012). Zur Auswertung der Potentialschwankungen wurden deshalb diese PDM-Typen erfasst.
Die Dauer der einzelnen Potentialschwankungen betrug in Punktionen der PDM-Typen 1 und 6 jeweils wenige Sekunden, die Potentialschwankungen des Typs 1 neigten bei einigen Punktionen dazu in der Nähe des Grundpotentials miteinander zu verschmelzen. Die Punktionen vom PDM-Typ 2 wiesen länger andauernde Potentialschwankungen auf, die je nach Verschmelzungsgrad Ihrer Einzelschwankungen auch über 10 sec dauern konnten.
Das Auftreten von Potentialschwankungen schien in einigen Punktionen mit fortschreitender Punktionsdauer schon nach einigen Minuten abzunehmen oder komplett zum Erliegen zu kommen. Einige andere Punktionen zeigten hingegen auch nach über 20min Messung noch ein ungemindertes Auftreten von Potentialschwankungen.
Für die Betrachtung der Frequenzen und Amplituden wurden im Gegensatz zur Betrachtung des RMP die Mittelwerte verwendet. Zwar war hier auch nicht bei allen Gruppen eine Normalverteilung gegeben, aber bei Verwendung der Medianen wären hierbei die Schwankungen mit höheren Amplituden unterrepräsentiert gewesen (Vergleiche dazu Kap.10.3-6).
Ergebnisse
Abb.12: Mittlere Frequenz der spontanen Depolarisationen mit Amplituden ≥1mV; ≥3mV und
≥8mV im Str. circulare und Str. longitudinale im Trächtigkeitsverlauf. Die Frequenzen wurden in 1-6 min je nach Stabilität der Punktion ausgewertet. x-Achse: Trächtigkeit; Anzahl der ausgewerteten Zellen: Str. circulare: n=14; n=11; n=10; n=8 Zellen; Str. longitudinale: n=18; n=6; n=8; n=5 Zellen. y-Achse Frequenz der spontanen Depolarisationen/min. Die Frequenzen der Potentialschwankungen
≥3mV (Nicht trächtig bzw. am Anfang der Trächtigkeit) bzw. ≥8mV (Ende der Trächtigkeit, Kaiserschnitt) entsprechen nominell ungefähr den in vitro ermittelten Kontraktionsfrequenzen. (Martina Münch, Hannover, persönliche Kommunikation, unveröffentlicht). Weitere Werte siehe Anhang.
Die mittleren Frequenzen der Potentialschwankungen nahmen im Trächtigkeitsverlauf nominell zu, was am deutlichsten an den Frequenzen der Schwankungen von ≥3mV zu erkennen war (Abb.12). Im Str. circulare kam es von Geweben nicht trächtiger Tiere bis zu Geweben von Kaiserschnitttieren zu einer Steigerung von 1,5/min auf 2,5/min. Im Str. longitudinale kam es erst zu einer Abnahme von nicht trächtig zu Monat 1-4 und dann zu einem Anstieg auf 3,1/min in Geweben von Kaiserschnitttieren. Die Frequenz der Potentialschwankungen mit einer Amplitude von ≥8mV stellte sich im Str. longitudinale im Trächtigkeitsverlauf signifikant unterschiedlich dar (Tab.10).
Tab.10: Kruskal-Wallis-Test zum Einfluss des Trächtigkeitsstatus auf die Frequenzen von Potentialschwankungen mit unterschiedlicher Amplitudenhöhe im Str. circulare und Str.
longitudinale. n=Anzahl der punktierten Zellen.
Nicht
trächtig Monat 1-4 Monat 5-9 Kaiserschnitt ≥1mV ≥3mV ≥8mV
P P P
Str. circ n=14 n=11 n=10 n=8 0,7316 0,4636 0,5594
Ergebnisse
7.1.5.2 Amplituden der RMP-Schwankungen in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe
Neben den Frequenzen änderten sich im Trächtigkeitsverlauf auch die Amplituden der auftretenden Potentialschwankungen (Abb.13). Im nicht trächtigen Zustand betrug der Anteil an Potentialschwankungen mit Amplituden bis 5mV im Str. circulare 75% und im Str. longitudinale 71%. Zu Beginn der Trächtigkeit steigerten sich diese Wert auf 85% bzw. 90% und nahmen im weiteren Trächtigkeitsverlauf dann zugunsten von Potentialschwankungen mit größeren Amplituden von über 5mV ab.
Zum Zeitpunkt des Kaiserschnittes hatten im Str. circulare 35% der auftretenden Schwankungen eine Amplitude von über 5mV, im Str. longitudinale betrug dieser Anteil 47%.
Abb.13: Verteilung der Amplituden der spontanen Depolarisationen im Trächtigkeitsverlauf. x-Achse: Trächtigkeitsverlauf; Anzahl der ausgewerteten Zellen: Str. circulare: Nicht trächtig: n=14;
Monat 1-4: n=11; Monat 5-9: n=10; Kaiserschnitt: n=8 Zellen; Str. longitudinale: Nicht trächtig: n=18;
Monat 1-4 n=6; Monat 5-9: n=8; Kaiserschnitt: n=5 Zellen. y-Achse: Anteil der jeweiligen Amplitudenhöhe in %. Den überwiegenden Anteil haben Potentialschwankungen mit kleinen Amplituden (bis 5mV). Der Anteil an Potentialschwankungen mit höherer Amplitude nimmt im Trächtigkeitsverlauf zu. Weitere Werte siehe Anhang.
Zusammenfassend ließ sich zu den Potentialschwankungen feststellen, dass sie sich im Verlauf der Trächtigkeit änderten. Es kam zu einer Zunahme der Frequenz, der
Ergebnisse
Anteil an Potentialschwankungen mit höheren Amplituden nahm im Laufe der Trächtigkeit zu.
7.1.6 Einfluss von Kalium auf das Membranpotential
7.1.6.1 Einfluss von Kalium auf das RMP
Die punktierten Zellen ohne Potentialschwankungen zeigten mit einer Ausnahme keinen statistisch nachweisbaren Effekt der veränderten Kaliumkonzentration auf das RMP (Tab.11). Bei dieser Ausnahme handelte es sich um Zellen ohne Potentialschwankungen aus dem Str. longitudinale von Tieren zum Zeitpunkt des Kaiserschnitts. Die graphische Darstellung der Werte zeigte einen Anstieg der RMP bei einer extrazellulären Kaliumkonzentration von 1mmol/L KCl (Abb.14). Weiterhin ergab sich im Str. circulare bei Geweben von Tieren im Monat 1-4 eine Tendenz (Tab.11). Auch hierbei war das RMP bei 1mmol/L KCl im Vergleich zu den anderen Kaliumkonzentrationen erhöht. Bei den anderen Gruppen von Zellen ohne Potentialschwankungen ließ sich graphisch keine einheitliche Änderung des RMP durch erniedrigte sowie erhöhte Konzentrationen an KCl feststellen (Abb.14).
Die punktierten Zellen mit Potentialschwankungen ließen graphisch einen markanteren Einfluss von niedrigen Konzentrationen an KCl vermuten (Abb.15). Bei den nicht trächtigen Tieren lag RMP bei einer extrazellulären Konzentration von 1mmol/L KCl niedriger als bei den übrigen Kaliumkonzentrationen. Im Str. circulare betrug der Medianwert bei 1mmol/L KCl -21,6 mV, der bei 5,4mmol/L KCl -17,7 mV.
Im Str. longitudinale war dieser Unterschied noch größer, hier betrug der Medianwert bei 1mmol/L KCl -27,3 mV, dem bei einer Konzentration von 5,4mmol/L KCl ein Wert von -17,5 mV gegenüberstand.
Bei Tieren in der ersten Trächtigkeitshälfte (Monat 1-4) lagen die Mediane der RMP bei unterschiedlichen Kaliumkonzentrationen nahezu auf einer Linie. Im Str. circulare war eine Einknickung bei 2,5mmol/L KCl zu beobachten, die Mediane betrugen -23,4 mV bei 1mmol/L KCl, -29,3 mV bei 2,5mmol/L KCl und -20,3 mV bei 5,4mmol/L KCl (Abb.15).
Bei Tieren in der zweiten Trächtigkeitshälfte (Monat 5-9) nahmen die Differenzen im RMP zwischen hypo- und normokaliämischen Kaliumkonzentrationen weiter zu. Im
Ergebnisse
5,4mmol/L KCl. Im Str. longitudinale war auch hier ein Abknicken der Kurve bei 2,5mmol/L zu sehen. Das RMP war dort um mehr als 17mV negativer als beim entsprechenden normokaliämischen Zustand (Abb.15). Für das Str. longitudinale in der zweiten Trächtigkeitshälfte ließ sich dieser Effekt auch darstellen (P=0,025)
5,4mmol/L KCl. Im Str. longitudinale war auch hier ein Abknicken der Kurve bei 2,5mmol/L zu sehen. Das RMP war dort um mehr als 17mV negativer als beim entsprechenden normokaliämischen Zustand (Abb.15). Für das Str. longitudinale in der zweiten Trächtigkeitshälfte ließ sich dieser Effekt auch darstellen (P=0,025)