Tierärztliche Hochschule Hannover
Physiologisches Institut Anatomisches Institut
Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen des bovinen Myometriums im Trächtigkeitsverlauf und unter
dem Einfluss von Kalium und NO
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von
Matthias Gerhard Wagener aus Kaufbeuren
Hannover 2014
Supervisorin: PD Dr. Sabine Leonhard-Marek
Betreuungsgruppe: PD Dr. Sabine Leonhard-Marek Prof. Dr. Christiane Pfarrer Prof. Dr. Kerstin E. Müller
1. Gutachten: PD Dr. Sabine Leonhard-Marek
Physiologisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Kerstin E. Müller
Klinik für Klauentiere, Freie Universität Berlin
2. Gutachten: Prof. Dr. Axel Wehrend
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz, Justus- Liebig-Universität Gießen
Datum der Disputation: 04.11.2014
Förderung:
Die These wurde durch ein Promotionsstipendium der Konrad-Adenauer-Stiftung gefördert.
Teile der Arbeit wurden durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.
Teile der Arbeit wurden bereits als mündliche Vorträge und Einträge in Abstractbände veröffentlicht.
Charakterisierung der Membranpotentiale und slow waves in Myometriumzellen des Rindes
Matthias G. Wagener, Martina Münch, Sabine Leonhard-Marek
20. Tagung der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, 16.02. – 18.02.2012 in München, S. 35
Mechanische und elektrische Aktivität des Rinderuterus im Trächtigkeitsverlauf M. Münch, M.G. Wagener, S. Leonhard-Marek
9. Berlin-Brandenburgischer Rindertag, 04. bis 06. Oktober 2012
CUVILLIER VERLAG, Göttingen 2012, ISBN 978-3-95404-217-3, S. 140-142
Influence of potassium on contractility of bovine myometrium Wagener, M.G., Münch, M. and Leonhard-Marek, S.
15th International Conference on Production Diseases in Farm Animals, ICPD 2013, Uppsala, Sweden 24-28 June 2013
© 2013 SLU, ISBN 978-91-576-9150-7, S. 42
Wir pflügen, und wir streuen den Samen auf das Land, doch Wachstum und Gedeihen steht in des Himmels Hand:
der tut mit leisem Wehen sich mild und heimlich auf und träuft, wenn heim wir gehen, Wuchs und Gedeihen drauf
Alle gute Gabe kommt her von Gott dem Herrn, drum dankt ihm dankt, drum dankt ihm dankt
und hofft auf ihn!
Er sendet Tau und Regen und Sonn und Mondenschein er wickelt seinen Segen gar zart und künstlich ein und bringt ihn dann behende in unser Feld und Brot es geht durch unsre Hände, kommt aber her von Gott.
Alle gute Gabe kommt her von Gott dem Herrn, drum dankt ihm dankt, drum dankt ihm dankt
und hofft auf ihn!
Was nah ist und was ferne, von Gott kommt alles her, der Strohhalm und die Sterne, das Sandkorn und das Meer.
Von ihm sind Büsch und Blätter und Korn und Obst von ihm das schöne Frühlingswetter und Schnee und Ungestüm.
Alle gute Gabe kommt her von Gott dem Herrn, drum dankt ihm dankt, drum dankt ihm dankt
und hofft auf ihn!
Er läßt die Sonn aufgehen, er stellt des Mondes Lauf;
er läßt die Winde wehen und tut die Wolken auf.
Er schenkt uns soviel Freude, er macht uns frisch und rot;
er gibt den Kühen Weide und seinen Kindern Brot.
Alle gute Gabe kommt her von Gott dem Herrn, drum dankt ihm dankt, drum dankt ihm dankt
und hofft auf ihn!
Matthias Claudius 1783
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungsverzeichnis ... XI
2 Summary ... 1
3 Zusammenfassung... 3
4 Einleitung und Zielsetzung ... 7
5 Literaturübersicht ... 11
5.1 Aufbau des bovinen Uterus (nicht trächtiger Zustand)... 11
5.1.1 Perimetrium... 11
5.1.2 Myometrium ... 11
5.1.3 Endometrium... 12
5.2 Morphologische Veränderungen des Uterus ... 14
5.3 Kontraktilität des Uterus ... 15
5.3.1 Funktion der glatten Muskelzellen ... 17
5.4 Membranpotential der uterinen Muskelzellen ... 18
5.4.1 RMP ... 18
5.4.2 Slow waves ... 20
5.5 Schrittmacherzellen im Uterus? ... 21
5.6 Schrittmacherzellen im Darm (ICC) ... 21
5.6.1 Geschichte der ICC ... 21
5.6.2 Morphologie der ICC ... 22
5.6.3 Lokalisation der ICC im Darm ... 22
5.6.4 Funktion der ICC ... 23
5.6.5 Immunhistochemischer Nachweis von ICC ... 23
5.6.6 ICC im Rind... 23
5.7 Telozyten ... 24
5.7.1 Morphologie der Telozyten ... 24
5.7.2 Geschichte der Telozyten ... 25
5.7.3 Telozyten in weiblichen Reproduktionsorganen ... 26
5.7.4 Nachweis von Telozyten ... 26
5.7.4.1 Klassische histologische Färbemethoden ... 26
5.7.4.2 Immunologische Färbemethoden ... 27
5.8 CD117 ... 30
5.9 Vimentin ... 30
Inhaltsverzeichnis
5.10 Mastzellen ... 31
5.10.1 Mastzellen im Uterus ... 31
5.11 NO ... 32
5.11.1 NO im Uterus ... 33
5.12 Kaliumhaushalt beim Rind ... 35
6 Material und Methoden ... 37
6.1 Tiere ... 37
6.1.1 Schlachthoftiere ... 37
6.1.2 Kaiserschnitttiere ... 38
6.1.3 Einteilung der Tiere ... 38
6.2 Elektrophysiologie ... 39
6.2.1 Präparation ... 39
6.2.2 Mikroelektrodenmessungen ... 40
6.2.3 Apparatur ... 40
6.2.4 Mikroelektroden ... 41
6.2.5 Versuchsdurchführung ... 42
6.2.6 Versuchsprotokolle Mikroelektrode ... 43
6.2.6.1 Generelle Eigenschaften; Kalium ... 43
6.2.6.2 NO ... 44
SNP ... 44
6.2.7 Auswertung der Schreiberprotokolle ... 45
6.2.7.1 Erfassen des RMP ... 45
6.2.7.2 Erfassen der Potentialschwankungen... 46
6.2.7.3 PDM-Typen ... 47
6.2.8 Datenerfassung ... 48
6.2.9 Datenanalyse ... 49
6.3 Histologie ... 51
6.3.1 Probenvorbereitung ... 51
6.3.2 Einbettung ... 51
6.3.3 Schneiden ... 52
6.3.4 Standardfärbungen ... 52
6.3.4.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 52
6.3.4.2 Toluidinblau- Färbung ... 53
Inhaltsverzeichnis
6.3.5 Immunhistochemie ... 54
6.3.6 Färbeprotokoll Doppelfärbung... 56
6.3.6.1 Färbeprotokoll Einzelmarkierung ... 58
6.3.7 Auswertung Histologie ... 59
6.3.7.1 Immunhistochemische Doppelmarkierung ... 59
6.3.7.2 Mastzellen ... 61
6.3.7.3 HE Färbung zur Quantifizierung der Zelldichte ... 61
6.3.7.4 Einfluss von SNP als NO-Donor auf das Auftreten von CD117- positiven Zellen im bovinen Myometrium ... 62
7 Ergebnisse ... 63
7.1 Elektrophysiologie ... 63
7.1.1 RMP (Ruhemembranpotential) ... 63
7.1.2 Unterschiedliche Typen des Membranpotentials ... 65
7.1.3 Anteil von Zellen MIT und OHNE Potentialschwankungen ... 65
7.1.4 RMP in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe ... 67
7.1.4.1 Zellen OHNE Potentialschwankungen ... 67
7.1.4.2 Zellen MIT Potentialschwankungen ... 68
7.1.5 Schwankungen des RMP ... 71
7.1.5.1 Frequenzen der RMP-Schwankungen in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe ... 71
7.1.5.2 Amplituden der RMP-Schwankungen in Abhängigkeit von Trächtigkeit und Gewebe ... 73
7.1.6 Einfluss von Kalium auf das Membranpotential ... 74
7.1.6.1 Einfluss von Kalium auf das RMP ... 74
7.1.6.2 Einfluss von Kalium auf die Frequenzen der Potentialschwankungen 79 7.1.6.3 Einfluss von Kalium auf die Amplituden der Potentialschwankungen 79 7.1.7 Einfluss von SNP auf RMP und Potentialschwankungen ... 83
7.2 Histologie ... 87
7.2.1 HE - Färbungen ... 87
7.2.1.1 Histologie der elektrophysiologisch untersuchten Gewebe ... 87
7.2.1.2 Veränderung der Zelldichte und der Zellkerngröße im bovinen Myometrium im Verlauf der Trächtigkeit ... 90
7.2.2 Immunhistochemie ... 91
7.2.2.1 CD117 im bovinen Uterus ... 91
Inhaltsverzeichnis
7.2.2.2 Vimentin im bovinen Uterus ... 92
7.2.2.3 Doppelfärbung - Telozyten verdächtige Zellen im Trächtigkeitsverlauf 95 7.2.3 Mastzellen mit Kontrollfärbung durch Toluidinblau ... 98
7.2.4 Quantifizierung der Zelltypen im Trächtigkeitsverlauf ... 102
7.2.4.1 CD117 und CD117/VIM ... 102
7.2.4.2 Mastzellen ... 103
7.2.4.3 Telozyten verdächtige Zellen ... 104
7.2.4.4 Nicht eindeutige Zellen ... 105
7.2.5 Absolute und relative Anzahl der Zellen im Trächtigkeitsverlauf ... 106
7.2.6 Übersichtstabelle zur Zellverteilung ... 107
7.2.7 Anzahl der Zellen mit Gefäßassoziation ... 107
7.2.8 Einfluss von SNP auf das Auftreten von CD117 positiven Zellen ... 108
7.2.8.1 CD117/VIM ... 109
7.2.8.2 Mastzellen ... 110
7.2.8.3 Telozyten verdächtige Zellen ... 110
7.2.8.4 Nicht eindeutige Zellen ... 111
8 Diskussion ... 113
8.1 Elektrophysiologie ... 113
8.1.1 Ruhemembranpotential (RMP) ... 113
8.1.2 Potentialschwankungen ... 116
8.1.3 RMP in Abhängigkeit vom Trächtigkeitsverlauf und Gewebe ... 118
8.1.4 Beeinflussung der RMP durch Kalium ... 119
8.1.5 Frequenzen der Potentialschwankungen ... 122
8.1.6 Beeinflussung der Potentialschwankungen durch Kalium ... 124
8.2 Morphologische Veränderung des Uterus im Trächtigkeitsverlauf ... 126
8.3 Immunhistochemische Untersuchungen ... 127
8.3.1 CD117 ... 127
8.3.2 Vimentin ... 128
8.3.3 CD117/VIM positive Zellen ... 129
8.3.4 Mastzellen ... 129
8.3.5 Telozyten verdächtige Zellen ... 131
8.3.6 Nicht eindeutige Zellen ... 131
Inhaltsverzeichnis
8.4 Einfluss von SNP als NO-Donor ... 134
8.5 Schlussfolgerungen, klinische Bedeutung ... 138
9 Literaturverzeichnis ... 141
10 Anhang ... 155
10.1 RMP in mV in Zellen OHNE Potentialschwankungen ... 155
10.2 RMP in mV in Zellen MIT Potentialschwankungen ... 156
10.3 Frequenz der Potentialschwankungen/min, Nicht trächtig ... 157
10.4 Frequenz der Potentialschwankungen/min, Monat 1-4... 158
10.5 Frequenz der Potentialschwankungen/min, Monat 5-9... 159
10.6 Frequenz der Potentialschwankungen/min, Kaiserschnitt ... 160
10.7 SNP-Versuch, RMP in mV, Zellen OHNE Potentialschwankungen ... 161
10.8 SNP-Versuch, RMP in mV, in Zellen MIT Potentialschwankungen ... 162
10.9 Einfluss des Messtages auf das RMP ... 163
10.10 Anzahl der Zellkerne im Bild im Str. longitudinale ... 163
10.11 Größe der Zellkerne in µm im Str. longitudinale ... 163
10.12 Verteilung aller CD117 positiven Zellen/mm² ... 164
10.13 Anzahl der ausgezählten Zellen Str. circulare ... 165
10.14 Anzahl der ausgezählten Zellen Str. longitduinale ... 166
10.15 Anzahl der Zellen im SNP-Versuch ... 167
10.16 Protokoll der immunhistochemischen Doppelfärbung... 169
10.17 Chemikalien in der Elektrophysiologie ... 171
10.17.1 Lösungen ... 171
10.17.2 Chemikalien ... 172
10.18 Chemikalien in der Histologie ... 172
10.18.1 Lösungen ... 172
10.18.2 Chemikalien ... 176
10.18.3 In der Immunhistochemie verwendete Antikörper und Detektionssysteme ... 178
11 Danksagung... 179
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
µm Mikrometer
Abb. Abbildung
Ag/AgCl Silber/Silberchlorid Aqua dest. Aqua destillata
ATP Adenosintriphosphat
ATPase Adenosintriphosphatase
AUC Area under Curve
C Stratum circulare
ca. circa
Ca2+ Ionisiertes Calcium
CaCl2 Calciumchlorid
CD117 CD117, c-kit. siehe Kap.5.8
CD117/VIM CD117 und Vimentin positiv CD1a Cluster of Differentiation 1a (Gen) CD34 Cluster of Differentiation 34 (Gen) CD44 Cluster of Differentiation 44 (Gen) CD45 Cluster of Differentiation 45 (Gen) CD62P Cluster of Differentiation 62P (Gen) CD68 Cluster of Differentiation 68 (Gen) CD90 Cluster of Differentiation 90 (Gen)
cm Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
CV DAB
CD117/VIM
3,3‘-Diaminobezidin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ER Östrogenrezeptor
et al. Und Andere
g Gramm
GFAP Glial fibrillary acidic protein (saures Gliafaserprotein)
GnRH Gonadoliberin
Abkürzungsverzeichnis
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
hcG Humanes Choriongonadotropin
HCl Salzsäure
HE Hämatoxylin-Eosin
HRP Horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase) ICC Interstitielle Zelle nach Cajal
ICC-CM ICC der Zirkulärmuskulatur
ICC-DMP ICC des tiefen muskulären Plexus
ICC-IM Intramuskuläre ICC
ICC-LM ICC der Longitudinalmuskulatur ICC-MY ICC des myenterischen Plexus
ICC-SM ICC der Submukosa
ICC-SMP ICC des submukösen Plexus
IFN-Ү Interferon-Gamma
IL-1 Interleukin-1
iNOS Induktive NO-Synthase
Kap. Kapitel
KATP-Kanäle ATP-aktivierte Kaliumkanäle
KCl Kaliumchlorid
KCl 1 KH mit 1mmol/L KCl
KCl 10 KH mit 10mmol/L KCl
KCl 2,5 KH mit 2,5mmol/L KCl
KCl 5,4 KH mit 5,4mmol/L KCl
kDa Kilo Dalton
kg Kilogramm
KH Krebs-Henseleit-Puffer
KS Kaiserschnitt/Kaiserschnitttiere
L (als Abkürzung) Stratum longitudinale L (als Einheit) Liter
L-NAME L-nitro-Arginin-Methyl-Ester
LPS Lipopolysaccharid
M Molar
Abkürzungsverzeichnis
M 1-4 Trächtigkeitsmonat 1-4
M 5-9 Trächtigkeitsmonat 5-9
Mastz. Mastzelle
Max Maximum
Med Median
MgCl2 Magnesiumchlorid
Min Minimum
min Minute
ml Milliliter
mmol/L Millimol pro Liter
mRNA Messenger-Ribonukleinsäure (Boten RNA)
mV Millivolt
MW Mittelwert
N Anzahl der Tiere
n Anzahl der Zellen
N. tr. Nicht trächtig
Na/K-ATPase Natrium-Kalium-Pumpe Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl Natriumchlorid
NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
NaOH Natriumhydroxid
NE Nicht eindeutige Zelle
NGS Ziegenserum (normal goat serum)
NK1 Neurokinin 1
NO Stickstoffmonoxid (Nitric oxide)
NOS NO-Synthase
NOS1 NO-Synthase 1
NOS2 NO-Synthase 2
NOS3 NO-Synthase 3
NSE Neuronenspezifische Enolase
O2 Sauerstoff
OQ Oberes Quartil
Abkürzungsverzeichnis
P Signifikanzwert
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PDGFRα Platelet-derived growth factor receptor α PDGFRβ Platelet-derived growth factor receptor β
PDM Potentialdifferenz über der Membran
PGP9.5 Protein Gene Protein 9.5
PR Progesteronrezeptor
RMP Ruhemembranpotential
RNOS Reaktive nitricoxide species
RT Raumtemperatur
s.u. Siehe unten
S-100 S-100-Protein
SAS Statistikprogramm
SD Standardabweichung
sec Sekunde
SMA Smooth muscle actin
SMM Smooth muscle myosin
SNP Sodiumnitroprussid (Natriumnitroprussid)
SNP- KH mit zerfallenem SNP
SNP+ KH mit frischem SNP
Str. Stratum
Str. circ Stratum circulare Str. long Stratum longitudinale
Tab. Tabelle
TBS Tris-gepufferte Salzlösung (tris buffered saline)
TBS-T TBS mit Tween20
TEC Tris-EDTA-Citrat-Puffer
TNF-α Tumornekrosefaktor-α
Tr. Trächtigkeitsstatus
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TV Telozyten verdächtige Zelle
UQ Unteres Quartil
Abkürzungsverzeichnis
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VIP Vasoactive intestinal polypeptide
z.B. Zum Beispiel
Abkürzungsverzeichnis
Summary 2 Summary
“Electrophysiological and histological studies of the bovine myometrium during pregnancy and under the influence of potassium and NO”
By Matthias Gerhard Wagener
Diseases of the reproductive organs, especially the uterus, have got a huge impact on health and economic efficiency in dairy farming. Contractility of the uterus plays a crucial role for reproduction. Depending on cycle phase or pregnancy there is a change in activity and quiescence of this organ, which is necessary for fetal development. Similar to the intestine, the myometrium is able to exhibit spontaneous activity.
In a first study, electrophysiological properties of this spontaneous myometrial activity were characterized during pregnancy. Changes of the membrane potential in intestinal muscle cells are called “slow waves”. They are generated by special pacemaker cells and cause spontaneous activity of smooth muscle cells. Resting membrane potential (RMP) and changes in membrane potential were studied by microelectrodes in circular and longitudinal layers of myometrial tissues of non pregnant animals, animals in month 1-4 of pregnancy, month 5-9 of pregnancy and animals that underwent a sectio. Frequencies of changes in membrane potential were evaluated for several classes of amplitudes. Besides registering physiological changes in myometral contractility, the influence of different extracellular potassium concentrations and the influence of nitric oxide (NO) as mediator of inflammation on RMP and alterations in membrane potential were investigated. These in vitro studies were meant to study effects of hypokalemia or metritis, which could occur in the postpartum period.
Microelectrode measurements revealed two populations of cells: with and without changes in membrane potential. During pregnancy RMP became more negative and frequency of changes in membrane potential increased in some of the evaluated groups.
An influence of different extracellular potassium concentrations on RMP was only observed in cells with changes in membrane potential. In these cells low potassium
Summary
caused a hyperpolarization of RMP in tissues from animals in the second half of pregnancy or at sectio.
A reglar effect of potassium on the frequency of changes in membrane potential was not observed. After incubation with NO, tissues of four animals showed no regular effect on RMP or occurrence of changes in membrane potential.
In a second study pacemaker cells of the uterus were investigated. Telocytes which are similar to pacemaker cells in the intestine have been found in several tissues in the last years. Although they have been described for the uterus in some species, they had not been found yet in the bovine uterus.
By histological double staining with CD117 and vimentin, which are markers for telocytes, positive cells were detected within the myometrium. Cells showing typical morphological signs for telocytes were found and called suspicious telocytes. Other cells that were detected by this doublestaining were mast cells and endothelial cells.
Suspicious telocytes and also mast cells, were quantified in circular and longitudinal layers of not pregnant animals, animals at mid pregnancy and animals that underwent a sectio.
Total number of cells that were positive for CD117 and vimentin was much higher than the sum of mast cells and suspicious telocytes. Many cells could not be differentiated clearly. Total number of suspicious telocytes and mast cells was changing during pregnancy: tissues of pregnant animals revealed less mast cells than tissues of non pregnant animals (nominal). Total number of suspicious telocytes was increasing in mid pregnancy and decreasing in sectio animals. Percentage of all CD117 and vimentin positive cells was continuously increasing during pregnancy.
Cells were also quantified after incubation with NO. The number of CD117 and vimentin positive cells was nominally decreasing after NO-incubation in the circular layers.
This study showed an effect of pregnancy on myometrial electricity. Low potassium concentrations are able to hyperpolarize RMP. An inhibition of uterine motility which is caused by low potassium has to be evaluated in further contractile studies.
Further cells that might be possible pacemaker cells have been detected in the
Zusammenfassung 3 Zusammenfassung
„Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen des bovinen Myometriums im Trächtigkeitsverlauf und unter dem Einfluss von Kalium und NO“
Von Matthias Gerhard Wagener
Erkrankungen des Reproduktionstraktes haben einen großen Einfluss auf Gesundheit und Wirtschaftlichkeit von Milchkühen. Besonders häufig kommt es zu Erkrankungen der Gebärmutter, deren Kontraktilität eine wichtige funktionelle Rolle im Reproduktionsgeschehen spielt. Zustände der Aktivität und der Ruhe des Myometriums wechseln sich je nach Zyklus- oder Trächtigkeitsstatus des Organes ab, was für die Produktion von Nachkommen unerlässlich ist. Das Myometrium ist dabei in der Lage, ähnlich wie der Darm, eine spontane Aktivität zu entfalten.
In einem ersten Teil dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen Grundlagen dieser spontanen Aktivität des Myometriums in verschiedenen Trächtigkeitsstadien näher charakterisiert. Schwankungen im Membranpotential kennt man vom Darm als
„slow waves“ die dort durch spezielle Schrittmacherzellen generiert werden und die Grundlage für eine spontane Aktivität der glatten Muskulatur darstellen. Für die Charakterisierung im Uterus wurden das Ruhemembranpotential (RMP) und die Potentialschwankungen des RMP mit Hilfe der Mikroelektrodentechnik untersucht.
Für eine Aussage über den Trächtigkeitsverlauf wurde das Verhalten des Str.
circulare und des Str. longitudinale von nicht trächtigen Tieren, trächtigen Tieren im Monat 1-4, im Monat 5-9 und Tieren zum Zeitpunkt eines Kaiserschnitts miteinander verglichen. Die Frequenzen der Potentialschwankungen wurden für unterschiedliche Amplitudenhöhen der Schwankungen ermittelt. Neben diesen grundlegenden Daten wurde der Einfluss unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen sowie der Einfluss des Entzündungsmediators NO auf das RMP und die Potentialschwankungen ermittelt. Diese in vitro Versuche sollten mögliche peripartale Zustände der Hypokaliämie und der Gebärmutterentzündung in der Kuh darstellen und ihre Wirkung auf das Myometrium untersuchen.
Die mittels Mikroelektrode untersuchten Zellen konnten in zwei Populationen unterteilt werden, Zellen mit Potentialschwankungen und Zellen ohne
Zusammenfassung
Potentialschwankungen. Im Trächtigkeitsverlauf zeigten sich ein negativer werdendes RMP sowie ein Anstieg der Potentialschwankungsfrequenz in einigen Gruppen. Unterschiedliche extrazelluläre Kaliumkonzentrationen hatten nur einen Einfluss auf das RMP von Zellen mit Potentialschwankungen, bei Geweben von Tieren in der fortgeschrittenen Trächtigkeit und zum Zeitpunkt eines Kaiserschnitts kam es bei niedrigen Kaliumkonzentrationen dort zu einer Hyperpolarisation des RMP. In den untersuchten Gruppen konnte kein einheitlicher Effekt von Kalium auf die Potentialschwankungsfrequenzen ermittelt werden. Nach Inkubation in einer NO- abspaltenden Lösung ließ sich in Geweben von vier Tieren kein einheitlicher Effekt auf das RMP und das Auftreten von Potentialschwankungen zeigen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob es im bovinen Myometrium Schrittmacherzellen gibt, die denen im Darm entsprechen. Ähnliche Zellen, sogenannte Telozyten, wurden in den letzten Jahren in unterschiedlichen Geweben, unter anderem auch in der Gebärmutter verschiedener Spezies nachgewiesen. Eine Beschreibung dieser Zellen für den Uterus des Rindes lag bisher jedoch noch nicht vor.
Anhand immunhistologischer Untersuchungen von bovinem Myometrium wurden in einer Doppelfärbung mit CD117 und Vimentin, zwei Markern für Telozyten, positive Zellen im Myometrium detektiert. Neben den Mastzellen und Endothelzellen, die mit diesen beiden Antikörpern ebenfalls detektiert werden, konnten auf morphologischer Grundlage Zellen nachgewiesen werden, die den in der Literatur beschriebenen Telozyten entsprechen. Sie wurden deshalb als Telozyten verdächtig angesprochen.
Diese Zellen wurden im Str. circulare und Str. longitudinale in Geweben von nicht trächtigen Tieren, Tieren in der Mitte der Trächtigkeit und Tieren zum Zeitpunkt des Kaiserschnitts quantifiziert. Aufgrund der Verwechslungsmöglichkeit mit Mastzellen wurden diese ebenfalls beschrieben und quantifiziert.
Die Gesamtzahl an CD117 und Vimentin positiven Zellen lag weit über der Summe an Mastzellen und Telozyten verdächtigen Zellen, viele Zellen konnten nicht eindeutig klassifiziert werden. Die absolute Anzahl der Telozyten verdächtigen Zellen sowie der Mastzellen änderte sich im Verlauf der Trächtigkeit. Während in Geweben von trächtigen Tieren nominell weniger Mastzellen gefunden wurden als in denen von nicht trächtigen Tieren, nahm die Anzahl an Telozyten verdächtigen Zellen in der
Zusammenfassung
Mitte der Trächtigkeit nominell zu und bei den Tieren zum Zeitpunkt des Kaiserschnitts wieder ab. Bei einer Betrachtung der Gesamtzahl an CD117 und Vimentin positiven Zellen kam es jedoch über den gesamten Trächtigkeitsverlauf zu einem prozentualen Anstieg dieser Zellen an der Gesamtzellzahl.
In einem weiteren Ansatz wurde eine Quantifizierung derselben Zellen nach einer Inkubation in einer NO-abspaltenden Lösung vorgenommen. Hier zeigte sich ein nomineller Rückgang an CD117 und Vimentin doppeltmarkierten Zellen unter NO- Einfluss im Str. circulare der untersuchten Tiere.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass die elektrischen Vorgänge im Myometrium vom jeweiligen Trächtigkeitsstatus abhängig sind. Niedrige Kaliumkonzentrationen können zu einer Hyperpolarisation des RMP führen. Eine kaliumbedingte Hemmung der Uterusmotilität, wie sie für den Labmagen beschrieben wurde, muss jedoch noch in Kontraktilitätsstudien verifiziert werden.
Ferner wurden Zellen nachgewiesen, die im bovinen Uterus als mögliche Schrittmacherzellen in Frage kommen könnten. Eine Schrittmacherrolle dieser Zellen wird aktuell noch kontrovers diskutiert.
Zusammenfassung
Einleitung und Zielsetzung 4 Einleitung und Zielsetzung
In der Milchviehhaltung spielt der Reproduktionstrakt der Kuh eine entscheidende Rolle. Erkrankungen der Reproduktionsorgane führen, neben Gesichtspunkten die den Tierschutz betreffen, zu geringeren Aufnahmeraten (Fourichon et al., 2000), geringerer Milchmenge (Rajala und Grohn, 1998; Sheldon et al., 2006) und damit zu wirtschaftlichen Einbußen (Overton und Fetrow, 2008).
Besonders häufig sind Erkrankungen der Gebärmutter, bis zu 50% der Kühe entwickeln eine puerperale Metritis (LeBlanc, 2012). Prädisponierend für solche intrauterinen Infektionen sind Nachgeburtsverhaltungen (Sheldon et al., 2008).
Normalerweise werden die Fruchthüllen innerhalb von 6h nach der Geburt ausgestoßen, ist dies nach 24h noch nicht geschehen, spricht man von einer Nachgeburtsverhaltung (Sheldon et al., 2008). Die Nachgeburtsverhaltung ist ein multifaktorielles Geschehen (Potter et al.), Risikofaktoren sind Abort, Zwillingsträchtigkeiten, Milchfieber, eingeleitete Geburten und fortgeschrittenes Alter (LeBlanc, 2008). Eine reduzierte Kontraktilität des Uterus wird ebenfalls als mögliches Risiko für uterine Infektionen genannt (Carnevale und Ginther, 1992).
Neben der Expulsion der Nachgeburt ist die Kontraktilität des Uterus auch von großer Bedeutung für den Spermientransport, um die Befruchtung zu gewährleisten, die Erhaltung der Trächtigkeit und später die Austreibung der Frucht durch die Wehentätigkeit (Aguilar und Mitchell, 2010). Die spontane Kontraktilität des bovinen Uterus wurde im in vitro-Ansatz bisher schon unter verschiedenen Fragestellungen untersucht. In der Literatur finden sich jedoch keine Daten über die Membranpotentiale der glatten Muskelzellen des Rinderuterus, die eine wichtige Rolle für die Erregbarkeit und die resultierenden Kontraktionen spielen (Aguilar und Mitchell, 2010).
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Erfassung von Grunddaten zur Charakterisierung des Membranpotentials der bovinen Myometriumzellen. Ferner sollten auftretende slow waves, die für eine rhythmische Erregung im Gastrointestinaltrakt sorgen (Thuneberg, 1999) und auch im Uterus vorkommen (Sanborn, 2000), genauer beschrieben werden. In einer vorausgegangenen Studie konnte beim Rind ein Zusammenhang zwischen den Membranpotentialen, deren slow waves und der Kontraktilität am Labmagen hergestellt werden (Zurr und
Einleitung und Zielsetzung
Leonhard-Marek, 2012). Da in früheren Studien am Uterus anderer Spezies gezeigt wurde, dass die Membranpotentiale sich im Verlauf der Trächtigkeit ändern (Casteels und Kuriyama, 1965; Kuriyama und Suzuki, 1976), sollten für die aktuelle Arbeit Tiere unterschiedlicher Trächtigkeitsstadien verwendet werden, um ein breites Bild über den Trächtigkeitsverlauf zu erhalten.
Für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials spielt Kalium eine wichtige Rolle (Brainard et al., 2007), in einer vorausgegangenen Studie wurde gezeigt, dass eine verminderte extrazelluläre Kaliumkonzentration die Kontraktilität der glatten Muskulatur des Labmagens herabsetzen kann und damit an der Pathogenese der Labmagenverlagerung beteiligt sein könnte (Türck und Leonhard-Marek, 2010). Im Uterus der Ratte wurde ebenfalls ein Effekt unterschiedlicher Kaliumkonzentrationen auf das Membranpotential der glatten Muskelzellen beobachtet (Jung, 1959a).
Klinisch können Hypokaliämien gemeinsam mit anderen pathologischen Zuständen auftreten (Constable et al., 2013), durch eine reduzierte Futteraufnahme kann es zu einem Absinken des Kaliumgehaltes im Plasma kommen (Clabough und Swanson, 1989). Im multifaktoriellen Geschehen der Nachgeburtsverhaltung ist es demnach denkbar, dass auch die uterine Kontraktilität ähnlich wie im Labmagen, durch einen Kaliummangel beeinflusst werden könnte.
Als zweites Ziel der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss extrazellulärer Kaliumkonzentrationen auf das Membranpotential und die slow waves erfasst werden, um Rückschlusse auf eine klinische Relevanz von Hypokaliämien für die Nachgeburtsverhaltung des Rindes ziehen zu können.
Im Rahmen einer Nachgeburtsverhaltung ist vermutlich der Entzündungsmediator NO an einer Hemmung der uterinen Kontraktionen beteiligt (Shixin et al., 2011). Bei Kühen mit Endometritis wurde eine erhöhte Menge an NO und eine erhöhte Expression der induktiven NO-Synthase gegenüber gesunden Kühen festgestellt (Li et al., 2010).
Das uterine Muskelgewebe von an Metritis erkrankten Kühen zeigte in vitro ein anderes Kontraktionsverhalten als das gesunder Uteri (Hirsbrunner et al., 2010). Um einen Einfluss von Entzündungen auf das Membranpotential zu erfassen, sollte als drittes Ziel dieser Arbeit Muskelgewebe nach NO-Behandlung untersucht werden.
Einleitung und Zielsetzung
Neben diesen funktionellen Fragestellungen wurde in dieser Arbeit weiterhin den anatomischen Grundlagen für die spontane Kontraktilität des bovinen Uterus nachgegangen. Im Gastrointestinaltrakt sind bestimmte Schrittmacherzellen, die Interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC) für eine autonome Motilität der glatten Muskulatur verantwortlich (Thuneberg, 1999). Ähnliche Zellen, die Telozyten genannt werden, wurden seitdem in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben, einschließlich des Uterus, gefunden (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010). Eine Schrittmacherrolle dieser Zellen wird bisher jedoch kontrovers diskutiert (Takaki et al., 2010). Eine Beschreibung für den bovinen Uterus war in der Literatur bisher nicht zu finden. Deshalb bestand das vierte Ziel dieser Arbeit in einer histologischen Untersuchung des Rinderuterus, bei der das Vorkommen von Telozyten charakterisiert werden sollte. Da NO bei Entzündungen des Darmes an der Zerstörung des Netzwerkes der ICC beteiligt war (Yanagida et al., 2007; Yanagida et al., 2004), ergab sich zuletzt die Fragestellung, inwieweit NO einen Einfluss auf die Integrität von möglichen Schrittmacherzellen im Rinderuterus haben könnte. Durch eine Behandlung von myometrialen Gewebeproben mit NO und einer anschließenden histologischen Evaluierung der Integrität möglicher Schrittmacherzellen sollte ein Einfluss von Entzündungsgeschehen auf morphologische Grundlagen als fünftes Ziel untersucht werden.
Einleitung und Zielsetzung
Literaturübersicht 5 Literaturübersicht
5.1 Aufbau des bovinen Uterus (nicht trächtiger Zustand)
Die Gebärmutter (Uterus) ist ein Hohlorgan (Gille, 2008) dessen Wand aus mehreren Schichten besteht. Betrachtet man den Wandbau von der äußeren Oberfläche des Organs zum Lumen hin, lässt sich der Uterus in drei Hauptanteile unterteilen:
Perimetrium, Myometrium und Endometrium (Liebich, 1999b).
5.1.1 Perimetrium
Das Perimetrium setzt sich zum Lumen hin wiederum zusammen aus Tunica serosa, Tela subserosa und, je nach Autor, dem Stratum musculare longitudinale (Str.
longitudinale) (Liebich, 1999b).
Die Tunica serosa ist ein einschichtiges Epithel (Mesothel) und bildet den Überzug des Organs und Kontaktfläche mit der Bauchhöhle (Abb.1C). Die Tela subserosa setzt sich aus Bindegewebe des breiten Gebärmutterbandes (Mesometrium) fort, in ihm werden die im Mesometrium an das Organ herantretende Blut- und Lymphgefäße sowie Nerven geführt (Leiser, 1999). Das Mesometrium enthält ebenfalls Anteile an glatter Muskulatur, aus dieser glatten Muskulatur des breiten Gebärmutterbandes geht laut Leiser wiederum das Str. longitudinale hervor. Bei Liebich wird diese Muskelschicht deshalb dem Perimetrium zugeordnet (Liebich, 1999b).
Dieser anatomischen Zuordnung kann man eine funktionelle Zuordnung gegenüberstellen und das Str. longitudinale der Gebärmuttermuskelschicht, dem Myometrium zuordnen (Gille, 2008; Leiser, 1999).
5.1.2 Myometrium
Aus funktioneller Sicht kann dem Myometrium das Str. longitudinale (Abb.1C) sowie das Stratum musculare circulare (Str. circulare) (Abb.1A) zugeordnet werden. Beide Anteile werden durch das Stratum vasculare (Abb.1B) getrennt (Leiser, 1999). Für die Betrachtungen in dieser Arbeit wurden Str. circulare und Str. longitudinale nach dem Ansatz von Leiser dem Myometrium zugerechnet.
Literaturübersicht
Die glatten Muskelzellen des äußeren Str. longitudinale (Myozyten) sind im longitudinalen Verlauf zum Organ angeordnet (Liebich, 1999b). Das etwas stärker ausgebildete Str. circulare stellt den inneren Anteil des Myometriums dar (Abb.1C) (Leiser, 1999). Der Faserverlauf dieser circulären Muskelschicht lässt sich beim Rind zwar als allgemein circulär bezeichnen, jedoch handelt es sich hierbei nicht um konzentrisch geschlossene Ringe (Leibrecht, 1953).
Das Stratum vasculare (Abb.1B), eine makroskopisch sichtbare Gefäßschicht, die beide muskulären Anteile des Uterus voneinander trennt, enthält größere Arterien, Venen und Lymphgefäße (Liebich, 1999b).
Im Gegensatz zu den Verhältnissen beim Rind wurde bei der humanen Gebärmutter im Laufe des letzten Jahrhunderts davon abgesehen die Muskelschicht in unterschiedliche Schichten zu unterteilen, sie wird deshalb als einheitliche Schicht aufgefasst, die aus miteinander verflochtenen Muskelfasern besteht (Leibrecht, 1953). Auch in neuerer Literatur wird die Unterteilung der Muskelschichten immer noch in Frage gestellt (Young, 2007).
5.1.3 Endometrium
Das Endometrium ist die das Lumen des Uterus auskleidende Schicht, sie enthält tubulär verzweigte Uterindrüsen (Glandulae uterinae) die bis an die Muskelschicht reichen können (Abb.1A) (Liebich, 1999b). Dort häufen sich auch Immunzellen (Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen) (Liebich, 1999b). Die Schleimhaut der Gebärmutter unterliegt in ihrem Aufbau zyklusabhängigen Schwankungen (Hölscher, 1921).
Literaturübersicht
Abb.1: Histologischer Aufbau des bovinen Uterus. A: Endometrium und Str. circulare, Messbalken=50µm; B: Str. vasculare, Messbalken=200µm; C: Str. longitudinale, Serosa und Subserosa, Messbalken=50µm.
Literaturübersicht 5.2 Morphologische Veränderungen des Uterus
Gestalt und Funktion des Uterus unterliegen großen Schwankungen (Ledermair, 1959). Der nicht tragende Uterus eines Kalbes vor der ersten Trächtigkeit ist in seinem Gewicht und seinen Ausmaßen geringer als der nicht tragende Uterus eines Rindes nach der ersten Kalbung (Dohm, 1936). Mit zunehmendem Alter und nach mehreren Trächtigkeiten stellen sich anatomisch erkennbare Veränderungen ein (Seiferle, 1933), zum Beispiel kommt es zur Vergrößerung der uterinen Blutgefäße (Ellenbogen, 1930).
Während der Trächtigkeit kommt es zu besonders tiefgreifenden Veränderungen.
Thiele untersuchte die Entwicklung der Gebärmutter schwarzbunter Rinder vom zweiten bis neunten Trächtigkeitsmonat und stellte dabei eine Gesamtzunahme um das 67-fache fest (0,769kg auf 51,5kg mit Inhalt; 0,514kg auf 8,1kg ohne Inhalt;
0,514kg auf 5kg ohne Inhalt und ohne Karunkel, das Karunkelwachstum hatte einen großen Anteil an der Gewichtsentwicklung) (Thiele, 1972). Länge und Durchmesser des tragenden Gebärmutterhornes nahmen jeweils um ein Sechsfaches zu (Thiele, 1972).
Im Rahmen des Puerperiums kehrt der Uterus wieder auf die Ausmaße des nicht trächtigen Organes zurück. Diese Rückbildungsvorgänge vollziehen sich innerhalb weniger Tage, nach 20-25 Tagen hat sich das Gewicht des Uterus auf 1kg reduziert (Grunert, 1993). Nach Ende des Puerperiums von ca. 50 Tagen beträgt das Gewicht ca. 0,7kg (Grunert, 1993). Ermöglicht werden diese dramatischen Größenveränderungen durch eine Hypertrophie der glatten Muskelzellen, was histologisch an einem Auseinanderrücken der Zellkerne beobachtet werden kann (Müller, 1933). Die Zelllänge einer glatten Muskelzelle im humanen Uterus beträgt im nicht graviden Zustand 50µm-90µm, ihre Breite 2,5µm-5µm, im graviden Zustand lassen sich diese Parameter dagegen mit 500µm-800µm beziehungsweise 8µm- 10µm angeben (Stieve, 1929). In Kühen verschiedener Trächtigkeitsstadien konnte außerdem eine Vergrößerung der Zellkerne beobachtet werden: Für den nicht trächtigen Zustand wurden in der Studie von Müller Ausmaße von 4µm x 8µm x 3µm ermittelt, die schon nach sieben Trächtigkeitswochen eine Vergrößerung zeigten (Müller, 1933). Nach vier Monaten erreichten die Zellkerne eine Länge von bis zu 20µm, danach war keine Vergrößerung mehr zu verzeichnen (Müller, 1933).
Literaturübersicht
Im Trächtigkeitsverlauf ändert sich ebenfalls die Verteilung von Gap junctions im Myometrium, durch hormonelle Regulation kommt es gegen Ende der Trächtigkeit zu einer vermehrten Expression (Garfield et al., 1980). Garfield et al. stellten bei in vitro- Versuchen nach Gabe von Östrogen und Progesteron eine veränderte Expression von Gap junctions fest. Östrogen hatte einen stimulierenden Effekt, während eine zusätzliche Gabe von Progesteron zu einem Rückgang der Gap junctions führte (Garfield et al., 1980). Diese verstärkte Expression von Gap junctions nahe des Geburtszeitpunktes dient einer Koordination der Wehentätigkeit, die durch verstärkte elektrische Kopplung zwischen den glatten Muskelzellen des Uterus ermöglicht wird (Evans und Martin, 2002; Miyoshi et al., 1996). Weiterhin wurde gezeigt, dass die Expression von Gap junctions auch in zyklischen Tieren von Progesteron abhängig zu sein scheint, so wurden im Myometrium des Schweines in der Lutealphase weniger Gap junctions ermittelt als präovulatorisch (Karasinski et al., 2010).
Neben den Veränderungen im Myometrium kommt es durch die Implantation des Embryos auch im Endometrium zu tiefgreifenden Umbauvorgängen. Hier bildet sich beim Rind eine Placenta cotyledonaria aus, die sich aus 30-150 einzelnen Plazentomen zusammensetzt, die je nach Lokalisation eine unterschiedliche Größe haben (Schnorr, 2006).
5.3 Kontraktilität des Uterus
Ein physiologisches Kontraktionsverhalten der Gebärmutter ist essentiell für vielfältige Vorgänge im Reproduktionsgeschehen. Aguilar und Mitchell nennen Menstruation, Spermientransport, Transport des Embryos, Einnistung, Erhaltung der Trächtigkeit, und Geburt (Aguilar und Mitchell, 2010). 90% der Geburtsarbeit werden durch uterine Kontraktionen geleistet (Gillette und Holm, 1963), eine reduzierte Kontraktilität könnte dazu führen, dass nach der Geburt in der Gebärmutter verbleibendes Material nicht richtig ausgestoßen wird (Carnevale und Ginther, 1992).
Nicht ausgestoßene Teile der Plazenta können zu Gebärmutterentzündungen führen (Sheldon et al., 2008).
Die uterine Kontraktilität beim Rind kann sowohl in vivo als auch in vitro untersucht werden (Benz, 2010; Gorriz-Martin, 2013; Müller, 1992).
Literaturübersicht
In vivo angewendete Methoden sind beispielsweise die intrauterine Druckmessung (Gillette und Holm, 1963; Hays und Vandemark, 1953; Hirsbrunner et al., 1998), die Untersuchung mittels Dehnungsmeßstreifen (Bass und Callantine, 1964) und die Elektromyographie (Gajewski und Faundez, 1992; Hanzen, 1981). Die Kontraktionen während der uterinen Involution können durch in den Uterus implantierte Sonomikrometriekristalle bestimmt werden (Benz, 2010).
Für in vitro-Messungen von uterinen Kontraktionen werden isolierte Proben des Myometriums in Organbäder verbracht und spontane Kontraktionen dort mittels isometrischer Kraftaufnehmer erfasst (Gorriz-Martin, 2013; Hirsbrunner et al., 2002;
Kaufmann et al., 2008)
Für das Rind konnten mit dieser Methode physiologische Grunddaten der spontanen Motilität des Uterus erhoben werden. So konnten Hirsbrunner et al. einen Unterschied im Kontraktionsverhalten von circulären und longitudinalen Muskelpräparaten zeigen, longitudinale Präparate zeigten eine höhere Aktivität als circuläre Praparate (Hirsbrunner et al., 2002). Einen Unterschied im Kontraktionsverhalten zwischen Östrus und Diöstrus konnte nur für circuläre Präparate gezeigt werden, die dafür untersuchten Parameter waren AUC (Area under curve), mittlere Amplitude und Kontraktionsfrequenz (Hirsbrunner et al., 2002).
Circuläre Präparate kontrahierten acht bis 20 mal in 30min, longitudinale Präparate sechs bis 24 mal in 30min (Hirsbrunner et al., 2002). Kaufmann et al. stellten fest, dass das Kontraktionsverhalten im Rinderuterus von der Lokalisation abhängig ist, Präparate in der Nähe der Uterushornspitze zeigten eine höhere Aktivität als Präparate in Nähe des Corpus (Kaufmann et al., 2008). Weitere in vitro- Untersuchungen beschäftigen sich mit dem Einfluss einer Endometritis auf die uterine Motilität (Hirsbrunner et al., 2010), oder dem Einfluss verschiedener Hormone wie Oxytocin (Müller, 1992), hcG (Angioni et al., 2011), GnRH (Giammarino et al., 2009), Progesteron (Gorriz-Martin, 2013) oder 17βÖstradiol (Gorriz-Martin, 2013). In verschiedenen Spezies wurden mittels Kontraktilitätsstudien am Uterus bis 2001 über 20 verschiedene Rezeptoren mit jeweils wiederum zahlreichen Untertypen untersucht (Crankshaw, 2001).
Weiterhin wurde der Einfluss von Antibiotika auf die in vitro-Kontraktilität untersucht (Ocal et al., 2004). Bei in vivo-Untersuchungen mit Xylazin und Clenbuterol,
Literaturübersicht
Medikamente die während Kaiserschnittoperationen verwendet werden, zeigte sich nach intramuskulärer Injektion von Xylazin eine massive Aktivitätssteigerung, während eine kleine Epiduralanästhesie ohne Einfluss blieb (Bucheli, 1984).
Clenbuterol, das tocolytisch wirkt, führte zu einer geringen Abnahme der Kontraktionsbereitschaft (Bucheli, 1984).
5.3.1 Funktion der glatten Muskelzellen
Die Kontraktionen der Gebärmutter liegen in der elektrischen Aktivität des Myometriums begründet (Kao, 1989), welches histologisch glatte Muskelzellen aufweist. Glatte Muskulatur findet sich neben der Gebärmutter in vielen anderen unterschiedlichen Organen des Organismus (Gabella, 2012). Im Gegensatz zur Skelettmuskulatur verfügt glatte Muskulatur nicht über eine erkennbar geordnete Myofibrillenstruktur, weshalb sie als „glatt“ bezeichnet wird (Liebich, 1999a). Glatte Muskelzellen sind spindelförmig, der ovale Zellkern liegt stets zentral (Liebich, 1999a). Im Uterus unterliegen sie trächtigkeitsbedingten Veränderungen (Kap.5.2).
Die kontraktilen Vorgänge wurden von Aguilar und Mitchell zusammengefasst.
Danach kommt es durch Phosphorylierung zu einem Aneinandervorbeigleiten von dicken Myosin- und dünnen Aktifilamenten, die entlang der Längsachse der spindelförmigen Muskelzellen angeordnet sind (Aguilar und Mitchell, 2010). Da die sich dabei aufeinander zubewegenden Aktinfilamente mit ihrem Ende jeweils durch
„Dense Bodies“ mit dem Zytoskelett der Zelle verankert sind, kommt es zur Verkürzung der ganzen Zelle (Aguilar und Mitchell, 2010). Die Kräfte, die durch glatte Muskulatur generiert werden können, können nach Gabella mit 200-400mN/mm angegeben werden (Gabella, 1984).
Literaturübersicht 5.4 Membranpotential der uterinen Muskelzellen
Bei der Betrachtung des Membranpotentials der glatten Muskelzellen im Uterus ist es sinnvoll eine Unterteilung vorzunehmen: Einerseits in das Ruhemembranpotential (RMP) und andererseits in rhythmische Schwankungen, die auch slow waves genannt werden (Aguilar und Mitchell, 2010; Sanborn, 2000). Für die Ausprägung des Membranpotentials ist dabei die Aktivität von Ionenkanälen, Austauschern und Pumpen, die eine Hyper- oder Depolarisation der Zellmembran bewirken können, von entscheidender Bedeutung (Berridge, 2008).
5.4.1 RMP
Das RMP ist eine Potentialdifferenz zwischen Intra- und Extrazellularraum, die durch Unterschiede in der Verteilung von Elektrolyten und der Permeabilität der Zellmembran für diese Elektrolyte hervorgerufen wird (Ledermair, 1959), von diesen Elektrolyten ist eine intrazelluläre höhere Kaliumkonzentration ausschlaggebend (Jung, 1959b). Deshalb spielen auch mehrere unterschiedliche Kaliumkanäle bei der Aufrechterhaltung des RMP eine wichtige Rolle (Aguilar und Mitchell, 2010). Khan et al. listen calciumaktivierte Kaliumkanäle, spannungsabhängige Kaliumkanäle und ATP-sensitive Kaliumkanäle, die in den glatten Muskelzellen des Uterus zu finden sind (Khan et al., 2001). Als besonders wichtigen Kanal nennen sie dabei den „BKCa“ oder „maxiK channel“, der sowohl im trächtigen als auch nicht trächtigen Zustand des Uterus häufig exprimiert wird und an der Kontrolle des Tonus der glatten Muskelzellen beteiligt ist (Khan et al., 2001).
Das RMP von uterinen glatten Muskelzellen kann je nach Methode (Zellkultur oder Gewebe) und Spezies unterschiedliche Werte annehmen (Tab.1), so sind in der Literatur Angaben zwischen -23mV und -78mV zu finden (Kuriyama und Suzuki, 1976; Persianinov et al., 1974). Das RMP zeigt dabei auch eine Abhängigkeit vom Trächtigkeitsstatus des Tieres: In Versuchen mit Ratten hat sich ergeben, dass es während der Trächtigkeit erst zu einem Absinken des RMP kam, das dann kurz vor der Geburt aber wieder positiv wurde (Tab.1) (Casteels und Kuriyama, 1965;
Kuriyama und Suzuki, 1976).
Neben unterschiedlichen Trächtigkeitsstufen wurden auch die Effekte unterschiedlicher Substanzen auf das RMP beschrieben (Tab.1), unter anderem von
Literaturübersicht
erhöhten sowie erniedrigten extrazellulären Kaliumkonzentrationen eine Depolarisation des RMP fest.
Tab.1: Auswahl einzelner Studien über das RMP der glatten Muskelzellen im Uterus in verschiedenen Gewebelokalisationen, zu unterschiedlichen Trächtigkeitsstadien und bei verschiedenen Behandlungen. Für detailliertere Informationen siehe (Kao, 1989)
Autor Jahr Spezies RMP
Woodbury und
McIntry 1954
Mensch, Kaninchen, Meerschweinchen, Katze
-20mV bis -40mV verschiedene Spezies, siehe Diskussion
Goto und Csapo 1959 Kaninchen
Östrogen niedrig: -30mV bis -35mV;
Östrogeneinfluss: -43mV bis -48mV;
Progesteroneinfluss: -55mV bis -60mV
Jung (1959a) 1959 Ratte
2,5mmol/L KCL: -45,8mV;
5,0mmol/L KCL: -49,1mV;
10,0mmol/L KCL: -39,9mV;
20,0mmol/L KCL: -31,8mV;
40,0mmol/L KCL: -19,3mV;
80,0mmol/L KCL: -14,2mV Casteels und
Kuriyama 1965 Ratte
Nicht trächtig -34 bis -46mV;
Trächtigkeit Tag 16: -60,5mV;
Trächtigkeit Tag 20: -54,5mV Kleinhaus und
Kao 1969 Kaninchen
durchschnittlich -50mV,
kein Effekt der Trächtigkeit feststellbar,
kein Effekt von Kaliumfreier Lösung auf das RMP Persianinov et
al. 1974 Zellkultur humaner
Myometriumzellen Fortgeschrittene Trächtigkeit: -23mV
Kuriyama und
Suzuki 1976 Ratte
Nicht trächtig: -56mV;
Trächtigkeit Tag 11 bis 15: -78mV;
kurz vor der Geburt: -54mV;
Temperatureffekt: bei 36°C: -54mV; bei 26°C: - 38mV
Lodge und
Sproat 1981 Ratte
Unterteilung in Schrittmacher (S) und Nicht-Schrittmacherregionen (NS).
Trächtigkeitsmitte: -60mV (NS), -50mV (S);
Nahe Geburtstermin: -56mV (NS), -49mV (S) Sims et al. 1982 Ratte Trächtigkeit: -51,7mV;
Geburt: -45,5mV Mollard et al. 1986 Zellkultur Ratte
Myometriumzellen Trächtigkeit Tag 18-19: Str. longitudinale: -54,5mV Miyoshi et al. 1996 Ratte Trächtigkeit Tag 22; Erhöhte intrazelluläre
Kaliumkonzentration: -39,8mV Okabe et al. 1999 Ratte
Trächtigkeit Tag 17-19:
Str. circulare: -58,4mV;
Str. longitudinale: -48,5mV Duquette et al. 2005
ICC-like cells, Zellkultur Ratte, Mensch
ICC-like-cells: -58mV;
glatte Muskelzellen: -65mV Gravina et al. 2010 Maus Nicht trächtig: -63mV
Literaturübersicht 5.4.2 Slow waves
Aguilar und Mitchell fassen den Kenntnisstand über die slow waves des Uterus so zusammen, dass sie ein Ergebnis der Verteilung von Calcium-, Natrium- , Kalium- und Chloridionen im intra- und extrazellulärem Raum und der Permeabilität der trennenden Membran sind (Aguilar und Mitchell, 2010). Besonders Calciumionen zeigen eine stark unterschiedliche Verteilung: im Ruhezustand sind 10000 mal mehr Calciumionen extrazellulär als intrazellulär zu finden (Aguilar und Mitchell, 2010).
Laut Berridge kommt es in den glatten Muskelzellen des Uterus durch das Öffnen von spannungsabhängigen Calciumkanälen zu einem Calcium- Einwärtsstrom mit nachfolgender Kontraktion (Berridge, 2008). Ursächlich für die benötigte Spannungsänderung soll ein in der Zellmembran sitzender Oszillator sein, der Schrittmacherpotentiale generiert (Berridge, 2008). Im Gastrointestinaltrakt werden Schrittmacherpotentiale durch spezialisierte Schrittmacherzellen, die Interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC) generiert (Kap.5.6) (Thuneberg, 1999). In Schrittmacherzellen wie den ICC soll es durch einen zytosolischen Oszillator zu einer Depolarisation der Zellmembran kommen, die dann durch Gap junctions auf benachbarte glatte Muskelzellen übertragen wird (Berridge, 2008).
In Versuchen von Shafik mit nicht trächtigen humanen Uteri wurden die slow waves als regelmäßig beschrieben, die Frequenz der Wellen variierte von drei bis fünf Wellen pro Minute, die Amplitude der Wellen variierte von 0,4mV bis 0,9mV (Shafik, 1997). In weiteren Versuchen zu slow waves in der humanen Vagina kamen Shafik et al. zu ähnlichen Ergebnissen (Shafik et al., 2004). Auch in Versuchen mit Eileitern von Mäusen zeigten sich regelmäßige slow waves, deren Wellen etwas frequenter als die im Uterus waren (ca. neun pro Minute) und jeweils eine Kontraktion nach sich zogen (Dixon et al., 2011).
Aus Untersuchungen in unterschiedlichen Geweben ist ersichtlich, dass die slow waves recht unterschiedlich ausfallen können. Die Frequenz der slow waves im Eileiter des Pavians wurde beispielsweise mit 46,4/min bestimmt, während die Frequenz im Eileiter des Meerschweinchens nur 7-13/min annahm (Talo und Hodgson, 1978). Des weiteren wurde ein Einfluss der Temperatur auf die slow waves festgestellt: Bei Erniedrigung der Umgebungstemperatur kam es zu einer Abnahme ihrer Frequenz (Ohba et al., 1975). Bei Untersuchungen im Labmagen des Rindes
Literaturübersicht
zeigten sich slow waves mit unterschiedlicher Amplitudenhöhe (Zurr und Leonhard- Marek, 2012), die slow waves mit einer Höhe von über 5mV hatten eine Frequenz von 5,6±1,4/min und korrelierten mit den Kontraktionen der Labmagenmuskulatur (Zurr und Leonhard-Marek, 2012). Frequenz und Amplitude der slow waves scheinen außerdem vom RMP abhängig zu sein: Hirst et al. stellten bei Depolarisation des RMP eine Abnahme in der Amplitudenhöhe und eine Zunahme in der Frequenz der slow waves fest (Hirst et al., 2008).
5.5 Schrittmacherzellen im Uterus?
Der Ursprung der Schrittmacheraktivität im Uterus ist noch nicht eindeutig geklärt (Takaki et al., 2010). In der glatten Muskulatur der Gebärmutter befinden sich neben glatten Muskelzellen verschiedene andere Zellen, die dafür in Frage kommen könnten. Von Gabella werden Axone, Gliazellen, Perizyten, Endothelzellen, Fibroblasten, Fibrobasten-ähnliche Zellen, sowie unspezialisierte Zellen genannt (Gabella, 2012). Andere Autoren (Ciontea et al., 2005; Duquette et al., 2005;
Hutchings et al., 2009) etablierten im Myometrium eine weitere Untergruppe von Zellen, die Ähnlichkeiten mit den ICC des Darmes aufwiesen. Sie sprachen deshalb beim Myometrium von ICC-like-cells (Duquette et al., 2005), myometrial Cajal-like interstitial cells (m-CLIC) (Ciontea et al., 2005) oder Telozyten (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010)
5.6 Schrittmacherzellen im Darm (ICC)
5.6.1 Geschichte der ICC
Namensgeber dieser Zellen war der Spanier Santiago Ramón Cajal, der 1889 eine Beschreibung eines Netzwerks von Zellen mittels Silberimprägnierung in Darmgewebe von Meerschweinchen und Ratte veröffentlichte (Thuneberg, 1999).
1915 wurde die Frage nach einem Zusammenhang zwischen diesem Netzwerk von Zellen und der spontanen Aktivität des Darmes gestellt, da strukturelle Ähnlichkeiten zu Schrittmacherzellen im Sinusknoten des Herzens auffielen (Huizinga et al., 2013;
Keith, 1915). Mittels Methylenblau Supravitalfärbungen und Elektronenmikroskopie konnte der Schrittmachercharakter weiter erhärtet werden (Thuneberg, 1982). 1992 wurde schließlich die Expression von CD117 in ICC nachgewiesen, welches eine zentrale funktionelle Rolle in diesen Zellen spielt. (Maeda et al., 1992)
Literaturübersicht 5.6.2 Morphologie der ICC
Im „Guide to the Identification of Interstitial Cells of Cajal” (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999) sind verschiedene Kriterien erstellt worden, um ICC von Neuronen, Schwann-Zellen, Makrophagen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten zu unterscheiden (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999). Als Prototyp wurden die ICC der Maus definiert: Die Zellen weisen eine elongierte Form mit zwei bis fünf Fortsätzen auf, der Zellkern ist ovoid (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999).
Die ICC variieren je nach untersuchter Spezies und Lokalisation im Gastrointestinaltrakt in Form und Aufbau (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999). Außer der Gestalt sind Zellkontakte bei der Identifikation der ICC von Bedeutung, die Kontakte finden durch gap junctions oder intermediate junctions statt (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999). Von herausragender Rolle wurden dabei Kontakte von ICC mit Nerven und glatten Muskelzellen beschrieben (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999).
Eine weitere Richtlinie, die zur strukturellen Identifikation von ICC aufgestellt wurde, findet man beim „gold standard“ von Huizinga et al. (Huizinga et al., 1997). Dort werden acht Kriterien genannt, in denen neben verschiedenen elektronenmikroskopischen Eigenschaften ebenfalls die Kontakte zu anderen Zellen (ICC, Nervenzellen, glatten Muskelzellen) hervorgehoben werden (Huizinga et al., 1997).
5.6.3 Lokalisation der ICC im Darm
ICC lassen sich in Abhängigkeit von ihrer Lokalisation nach Garcia-Lopez et al. in folgende Untergruppen einteilen: ICC des myenterischen Plexus (ICC-MY bzw. ICC- MP), ICC der Zirkulärmuskulatur (ICC-CM), ICC der Longitudinalmuskulatur (ICC- LM), Intramuskuläre ICC (ICC-IM), ICC des tiefen muskulären Plexus (ICC-DMP), ICC der Submukosa (ICC-SM), ICC des submukösen Plexus (ICC-SMP) (Garcia- Lopez et al., 2009).
ICC-IM leiten die Signale von enterischen Motoneuronen weiter, sie besitzen aber auch intrinsische Schrittmacherfunktionen, so können sie auf neurale Impulse oder Dehnungsreize (Won et al., 2005) hin die Frequenz der slow waves modulieren (Sanders et al., 2006). ICC-IM können unter Umständen auch als primäre
Literaturübersicht 5.6.4 Funktion der ICC
Die Funktionen der ICC lassen sich nach Garcia-Lopez et al. im Allgemeinen in drei Bereiche einteilen (Garcia-Lopez et al., 2009):
1.) Neurotransmission: Inhibitorische Motorneurone, die als Neurotransmitter NOS (NO-Synthase (Kap.5.11)); oder VIP (vasoactive intestinal polypeptide) enthalten, haben engen Kontakt mit ICC-IM sowie deren Fortsätzen (Beckett et al., 2002; Horiguchi et al., 2003).
2.) Schrittmacherfunktion: Slow waves werden in ICC generiert (Thuneberg, 1999). Je nach Spezies und Lokalisation im Gastrointestinaltrakt kann dies in unterschiedlichen Untergruppen der ICC passieren (Garcia-Lopez et al., 2009).
Untersuchungen mit CD117-knock-out-Mäusen zeigen eine Unterentwicklung des ICC-MY Netzwerks im Dünndarm, sowie ein Fehlen von Schrittmacheraktivitäten (Huizinga et al., 1995; Ward et al., 1994).
3.) Dehnungssensoren: ICC-IM sind dehungssensitiv, Dehnung kann zu Membrandepolarisation und zu einem Anstieg der Frequenz der slow waves führen (Won et al., 2005).
5.6.5 Immunhistochemischer Nachweis von ICC
Neben klassischen Färbemethoden können immunhistochemische Methoden zur Detektion von ICC angewendet werden. Gängige Methode ist dabei die Detektion des für ICC charakteristischen Rezeptors CD117 (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999; Horie et al., 1993; Ward et al., 1994), da CD117 weder in glatten Muskelzellen noch in enterischen Nervenzellen erscheint (Huizinga et al., 1997).
Als weitere Antikörper zur Detektion von ICC werden Tachykinin NK-1 Rezeptor (NK1r), Somatostatin Subtyp 2A-Rezeptor, Opioid-Rezeptoren, Zyklisches GMP, Cholera Toxin Subunit b und CD34 genannt (Faussone-Pellegrini und Thuneberg, 1999).
5.6.6 ICC im Rind
Monnard konnte in 2005 ICC im Plexus myentericus und in der Darmwand des Rindes mittels Immunhistochemie mit CD117 nachweisen (Monnard, 2005). Eine weitere morphologische Untersuchung zur Verteilung von ICC-MP und ICC-LM im
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Darm des Rindes ist 2006 von Marquez et al. publiziert worden. Die Dichte der ICC- LM betrug 9,52±3,86 per 10000µm2, die Verteilung wurde als unregelmäßig beschrieben. Die Fortsätze der Zellen variierten in dieser Studie, die Fortsätze der ICC-LM waren länger als die der ICC-MP. Die intramuskulären ICC ließen sich neben CD117 auch positiv auf Vimentin anfärben (Marquez et al., 2006).
5.7 Telozyten
Der Begriff Telozyten (englisch: telocytes) wurde 2010 durch Popescu und Faussone-Pellegrini eingeführt. Die damit angesprochenen Zellen zeichnen sich mikroskopisch durch Prolongationen des Zellkörpers aus, die von den Autoren als Telopoden bezeichnet wurden (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010). Mit dieser neuen Nomenklatur sollte ein Begriff geschaffen werden, der die Vielfalt der bisherigen Bezeichnungen vereinheitlichen sollte, außerdem sollte den Unterschieden zu den ICC, von denen diese Zellen ursprünglich abgeleitet wurden, Rechnung getragen werden. (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010).
5.7.1 Morphologie der Telozyten
Morphologisch haben Telozyten einen kleinen Zellkörper mit einem Kern, der ungefähr 25% des Zellvolumens ausmacht, die Ausmaße des Zellkörpers werden mit Größen von 6,31µm bis 16,42µm angegeben (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010). Im perinukleären Zytoplasma befinden sich zahlreiche Mitochondrien, die 5- 10% des Zellvolumens ausfüllen, außerdem findet man dort einen schmalen Golgi- Apparat sowie rauhes und glattes endoplasmatisches Retikulum und Elemente des Zytoskeletts (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010; Zheng et al., 2012a). Der Zellkörper kann von unterschiedlicher Gestalt sein: birnenförmig, spindelförmig, dreieckig, oder sternförmig. Diese Zellformen werden maßgeblich geprägt von den Telopoden, langen und dünnen Fortsätzen, die bei einer Breite von 20-200nm bis zu 1000µm lang sein können (Popescu et al., 2012; Smythies und Edelstein, 2014) Zur Unterscheidung von Dendriten der Nervenzellen stellten Popescu und Faussone- Pellegrini sieben Kriterien für die Zellfortsätze auf, nach denen die Anzahl zwischen einem und fünf Telopoden schwanken kann, meistens werden zwei bis drei gefunden (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010). Die Breite der Telopoden wird im Mittel mit 0,1±0,05µm angegeben (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010). Neben
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wobei an Kontaktstellen eine Kommunikation über gap junctions erfolgt. (Popescu und Faussone-Pellegrini, 2010).
Für die elektronenmikroskopische Identifizierung von Telozyten wurde von Popescu et al. der zehn Kriterien umfassende „platinumstandard“ eingeführt (Popescu et al., 2005a), der den für ICC eingeführten „goldstandard“ (Huizinga et al., 1997) um die Beschreibung der Telopoden erweiterte (Popescu et al., 2005a).
5.7.2 Geschichte der Telozyten
Betrachtet man die wissenschaftliche Chronologie der Telozyten, findet man fast alle relevanten Veröffentlichungen, die dieses Thema betreffen, in der letzten Dekade (Tab.2). Nachdem im Laufe des letzten Jahrhunderts intensive Forschung an Schrittmacherzellen im Darm stattgefunden hat (Kap.5.6.1), wurde der Frage nachgegangen, ob es ähnliche Zellen auch in anderen Organen außerhalb des Darmsystems gibt (Popescu et al., 2005b). Zur histologischen Differenzierung wurde dabei ebenfalls das Vorhandensein von CD117 in diesen Zellen genutzt (Allix et al., 2008; Ciontea et al., 2005; Zhao et al., 2014)
Seitdem gibt es eine Vielzahl an Publikationen, die sich mit der Beschreibung von Zellen, die anfangs als ICC oder ICC-ähnliche Zellen, später als Telozyten angesprochen werden, beschäftigen (s.u.). Die meisten dieser Untersuchungen fanden in Geweben von Mensch oder kleinen Labornagern statt (Tab.2). In einer Studie am Harntrakt wurde aber auch das Vorhandensein von CD117 positiven
„Cajal-like-cells“ in Schwein, Wildschwein, Kuh, Hund, Katze, Kaninchen, Ratte und Maus beschrieben (Metzger et al., 2005). Ein Streifzug durch die neuere Literatur liefert Untersuchungen dieser Zellen in verschiedenen Organsystemen:
Samenleiter (Burton et al., 2000), Prostata (Shafik et al., 2005), Penis (Shafik, 2007), Niere/Harntrakt (McHale et al., 2006; Zheng et al., 2012b), Gallenblase (Lavoie et al., 2007), Leber (Xiao et al., 2013), Bauchspeicheldrüse (Popescu et al., 2005b), Speiseröhre (Chen et al., 2013), Herz/Herzklappen (Gherghiceanu et al., 2010;
Yang et al., 2014), Haut (Rusu et al., 2012), Gehirn (Popescu et al., 2012), Auge (Luesma et al., 2013), Skelettmuskel (Popescu et al., 2011), Lunge und Trachea (Zheng et al., 2011).
Literaturübersicht 5.7.3 Telozyten in weiblichen Reproduktionsorganen
In den weiblichen Reproduktionsorganen wurden Telocyten in Endometrium und Myometrium sowie in Vagina, Eileiter, Plazenta und Milchdrüse untersucht (Tab.2).
Die dazu verwendeten Proben stammten entweder vom Menschen oder von Maus oder Ratte. In den Studien wurden Zellen mittels Zellkultur einzeln oder im Gewebeverband in situ charakterisiert, ferner gab es Untersuchungen zu Ihrem Verhalten im Trächtigkeitsverlauf (Salama, 2013) und bei pathologischen Zuständen der Gebärmutter (Horn et al., 2012). Eine weitere Studie über CD117 positive Zellen am Ovar beschreibt das Vorhandensein von CD117 „fibroblast-like-cells“, die, ohne dass sie von den Autoren als solche klassifiziert wurden, ein Hinweis auf Telozyten im Reproduktionstrakt des weiblichen Rindes sein könnten (Spanel-Borowski et al., 2007).
Eine detailliertere Übersicht zu verschiedenen Studien von Telozyten in den weiblichen Reproduktionsorganen und den dort verwendeten Methoden ist in Tab.2 dargestellt.
5.7.4 Nachweis von Telozyten
Telozyten lassen sich durch verschiedene histologische Techniken in situ oder als vereinzelte Zellen nachweisen. Diese Techniken lassen sich in klassische histologische Färbemethoden und immunhistologische Färbungen einteilen. Neben dem Nachweis durch histologische Anfärbung kommen auch elektronenmikroskopische Methoden zur Detektion zum Einsatz, die eine genauere Beschreibung der Zellorganellen zulassen (Popescu et al., 2007; Popescu et al., 2005b; Suciu et al., 2010).
5.7.4.1 Klassische histologische Färbemethoden
Für lebende Zellen aus Zellkulturen, oder frische Gewebeproben werden routinemäßig sogenannte Vital-Färbungen oder Supra-Vital-Färbungen angewandt.
Bei einer Vital-Färbung wird ein Farbstoff in einen lebenden Organismus verbracht, wobei der Farbstoff keine toxischen Effekte auf diesen haben darf (Foot, 1954). Der Farbstoff wird im Organismus aufgenommen und färbt bestimmte Zellen in einer auffälligen Farbe (Foot, 1954). Bei Gewebeproben, die dem Gesamtorganismus entnommen wurden spricht man von Supra-Vital-Färbung (Foot, 1954).
