Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung des Membranpotentials von glatten Muskelzellen der Labmagenmuskulatur und dessen Beeinflussung durch
Ketonkörper, Kalzium und Kalium
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Lisa Zurr aus Düsseldorf
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. S. Leonhard- Marek, Physiologisches Institut
1. Gutachter: PD Dr. S. Leonhard- Marek
2. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Rehage
Tag der mündlichen Prüfung: 8. Mai 2012
Diese Arbeit wurde mit finanziellen Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft durchgeführt.
Cornelia und Ralph
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
a. p. ante partum
Abb. Abbildung
Ag/AgCl Silber/Silberchlorid
AST Aspartat-Aminotransferase
ATP Adenosin 5‘-Triphosphat
BHB beta-Hydroxybutyrat
°C Grad Celsius
Ca Kalzium
Ca2+ ionisiertes Kalzium
ca. circa
CaCl2 Kalziumchlorid
cm Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
CPT 1 Carnitin-Palmityltransferase 1
DMSO Dimethylsulfoxid
ENS Enterisches Nervensystem
g Gramm
H2O Wasser
HCl Salzsäure
Hz Hertz
ICC Interstitielle Zellen nach Cajal
K+ ionisiertes Kalium
KCl Kaliumchlorid
Abkürzungsverzeichnis
KH – Lsg Krebs–Henseleit Lösung
LMV Labmagenverlagerung
M Molar
MgCl2 Magnesiumchlorid
MJ Megajoule
ml Milliliter
mN Millinewton
mmol/l Millimol pro Liter μmol/l Micromol pro Liter
mV Millivolt
MW Mittelwert
n Anzahl der Versuchsdurchgänge
N Anzahl der Versuchstiere
n.s. nicht signifikant
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
Ω Ohm
O2 Sauerstoff
OP Operation
PMCA Plasma-membrane Ca2+-ATPase
PTH Parathormon
SD Standardfehler
SEM Standardabweichung
Abkürzungsverzeichnis
SERCA Sarcoplasmatic reticulum Ca2+-ATPase
z.B. zum Beispiel
Inhaltsverzeichnis
Inhalt
1 Einleitung ... 13
2 Literaturübersicht ... 15
2.1 Anatomische und physiologische Grundlagen ... 15
2.1.1 Die Anatomie des Labmagens... 15
2.1.2 Morphologie der glatten Muskelzelle ... 16
2.1.3 Kontraktionsmechanismus ... 16
2.1.4 Slow waves ... 18
2.2 Interstitielle Zellen nach Cajal ... 19
2.3 Die linksseitige Labmagenverlagerung (Dislocatio abomasi sinistra) ... 22
2.3.1 Klinische Symptomatik ... 22
2.3.2 Auslösende und prädisponierende Faktoren der LMV ... 23
2.4 β – Hydroxybutyrat (BHB) und Ketose ... 25
2.5 Kalzium und Hypokalzämie ... 28
2.6 Kalium–Homöostase ... 30
2.7 Hypothese ... 33
3 Material und Methoden ... 34
3.1 Versuchstiere ... 34
3.1.1 Bullen und Hammel ... 34
3.1.2 Ziegen ... 34
3.1.3 Kühe mit Dislocatio abomasi sinistra ... 35
3.2 Probenentnahme ... 36
3.2.1 Präparation der Muskulatur des Labmagens ... 36
3.3 Pufferlösungen ... 37
3.3.1 Krebs-Henseleit-Lösung hypokalzämisch ... 37
3.3.2 Krebs-Henseleit-Lösung normokalzämisch ... 38
3.3.3 Krebs-Henseleit-Lösung mit 2 mmol/l KCl ... 38
3.3.4 Stammlösungen ... 38
3.4 Messung des Membranpotentials mittels Mikroelektroden ... 39
3.4.1 Herstellung der Mikroelektroden ... 39
3.4.2 Versuchsaufbau ... 39
3.5 Versuchsschemata der Mikroelektrodenmessungen ... 41
Inhaltsverzeichnis
3.6 Auswertung der Mikroelektrodenaufzeichnungen ... 43
3.7 In vitro – Motilitätsmessungen der glatten Labmagenmuskulatur ... 44
3.7.1 Probenahme und Präparation ... 44
3.7.2 Versuchsvorrichtung ... 44
3.7.3 Versuchsschemata ... 45
3.7.4 Motilitätsparameter ... 47
3.8 Statistische Auswertung ... 47
4 Ergebnisse ... 49
4.1 Mikroelektrodenmessungen ... 49
4.1.1 Hammel ... 49
4.1.1.1 Verlauf des Membranpotentials über die Zeit unter hypokalzämischen Bedingungen ... 49
4.1.1.2 Wirkung von Barium auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 50
4.1.1.3 Vergleichende Betrachtung des Zeitverlaufes zu den Bariumeffekten ... 51
4.1.1.4 Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 52
4.1.1.5 Vergleichende Betrachtung des Zeitverlaufes zu den BHB-Effekten ... 54
4.1.2 Bullen ... 56
4.1.2.1 Schwankungen des Membranpotentials über die Zeit unter hypokalzämischen Bedingungen ... 56
4.1.2.2 Wirkung von Bariumchlorid auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 57
4.1.2.3 Vergleichende Betrachtung des Zeitverlaufes zu den Bariumeffekten ... 59
4.1.2.4 Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 60
4.1.2.5 Vergleichende Betrachtung des Zeitverlaufes zu den BHB-Effekten ... 61
4.1.2.6 Verlauf des Membranpotentials über die Zeit unter normokalzämischen Bedingungen ... 62
4.1.2.7 Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter normokalzämischen Bedingungenund ... 63
4.1.2.8 Vergleichende Betrachtung des Zeitverlaufes zu den BHB-Effekten unter normokalzämischen Bedingungen ... 64
4.1.3 Kühe mit Dislocatio abomasi sinistra ... 65
Inhaltsverzeichnis
4.1.3.1 Verlauf des Membranpotantials über die Zeit unter hypokalzämischen
Bedingungen ... 65
4.1.3.2 Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 66
4.1.3.3 Vergleichende Betrachtung von Zeitverlauf zu den BHB-Effekten ... 67
4.1.4 Ziegen mit unterschiedlicher Kalziumkonzentration im Futter ... 68
4.1.4.1 Kontrollgruppe: Verlauf des Membranpotentials über die Zeit unter normokalzämischen Bedingungen ... 68
4.1.4.2 Kontrollziegen: Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter normokalzämischen Bedingungen ... 69
4.1.4.3 Kalzium-restriktiv gefütterte Ziegen: Verlauf des Membranpotentials über die Zeit unter hypokalzämischen Bedingungen ... 70
4.1.4.4 Kalzium-restriktiv gefütterte Ziegen: Wirkung von BHB auf das Membranpotential unter hypokalzämischen Bedingungen ... 71
4.2 In vitro Motilitätsversuche ... 73
4.2.1 Wirkung von BHB auf die Motilität unter hypokalzämischen Bedingungen ... 73
4.2.2 Wirkung einer Verdopplung des Kalziumgehaltes auf normokalzämisches Niveau ... 76
4.2.3 Wirkung verschiedener Kaliumgehalte auf die in vitro Motilität ... 77
4.2.4 Besteht ein Zusammenhang zwischen dem Gewicht der Muskelstreifen und der aktiven Kontraktionskraft? ... 79
4.2.5 Besteht ein Zusammenhang zwischen der Vordehnung der Muskelstreifen und der Kontraktionskraft? ... 79
5 Diskussion ... 81
5.1 Zusammenhang zwischen Slow waves und Kontraktionen ... 81
5.2 Effekte von Barium und Kalium ... 85
5.3 Wirkung von BHB unter unterschiedlichen Kalziumgehalten im Puffer ... 88
5.4 Effekte verschiedener Kalziumkonzentrationen ... 91
6 Schlussfolgerungen ... 94
7 Zusammenfassung ... 96
8 Summary ... 100
9 Literaturverzeichnis ... 103
10 Anhang... 120
10.1 Auflistung der Minima und Maxima der Mikroelektrodenversuche sortiert nach ausgewerteten Parametern ... 120
Inhaltsverzeichnis
10.1.1 Hammel ... 120
10.1.2 Bullen ... 122
10.1.3 Kühe mit Dislocatio abomasi ... 124
10.1.4 Ziegen-Kontrollgruppe ... 125
10.1.5 Ziegen, Ca-restriktiv gefüttert ... 126
11 Danksagung ... 128
Einleitung
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1 Einleitung
Die Labmagenverlagerung des Rindes ist eine weit verbreitete Erkrankung des Gastrointestinaltraktes in Milchviehbeständen. Die linksseitige Verlagerung wird dabei deutlich häufiger beobachtet als die rechtsseitige. Die Erkrankung tritt zum größten Teil bei weiblichen, hochleistenden Milchkühen auf (CONSTABLE et al.
1992; STENGÅRDE et al. 2010). Die Pathogenese ist durch eine Hypomotilität bis Atonie der Labmagenmuskulatur gekennzeichnet. Bei gleichzeitiger Gasakkumulation in der Fundusregion führen diese Faktoren zur Verlagerung des Labmagens (CONSTABLE et al. 1992; GEISHAUSER et al. 1998). Das Alter, die Rasse und auch die Jahreszeit scheinen ebenfalls einen Einfluss auf das Auftreten der Erkrankung zu haben. Mit zunehmendem Alter steigt das Risiko gerade für Holstein-Friesian und Guernsey Rinder vor allem im Winter und Frühjahr zu erkranken, wobei eine individuelle genetische Disposition ebenfalls eine Rolle spielen dürfte (JUBB et al. 1991; STOBER et al. 1974). Prädisponierend ist auch die Reproduktionsphase. So treten die meisten Erkrankungen im peripartalen Zeitraum auf (CONSTABLE et al. 1992; DIRKSEN 1967). Einen weiteren Einfluss haben Haltung und Management der Tiere. Suboptimale Haltungsbedingungen scheinen das Risiko zu erhöhen, wobei die Erkrankung trotzdem auch in optimal versorgten Herden auftritt.
In der Literatur werden verschiedene Stoffwechselprodukte in Zusammenhang mit der linksseitigen Labmagenverlagerung diskutiert. So kann prae wie post partum der Anstieg der freien Fettsäuren im Blutserum als Indikator für ein erhöhtes Risiko gesehen werden. Sensitiver und spezifischer ist allerdings ein Anstieg des Ketonkörpers β-Hydroxybutyrat (BHB) in der ersten Woche post partum (LEBLANC et al. 2005; GEISHAUSER et al. 1997a und b). Auch Hypokaliämien, Hypokalzämien und Insulinresistenzen werden in diesem Zusammenhang beobachtet (MASSEY et al. 1993; STENGÅRDE et al. 2010).
Einleitung
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Bis heute konnte jedoch kein eindeutig auslösender Faktor determiniert werden, welcher pathognomonisch für die Verlagerung des Labmagens wäre.
In in vitro Versuchen konnte bereits gezeigt werden, dass die Kontraktilität der Labmagenmuskulatur durch verschiedene Parameter zu beeinflussen ist: erhöhte Kaliumgehalte im Puffer steigerten die Kontraktilität, während ein erhöhter Insulinspiegel zu einer Abnahme der Kontraktilität führte (TÜRCK 2009). In vivo wurde bei erniedrigten Kalziumplasmagehalten eine Verminderung der abomasalen Aktivität festgestellt (DANIEL 1983).
Glatte Muskelzellen weisen in vielen Bereichen des Gastrointestinaltraktes ein schwankendes Membranpotential auf, welches letztlich durch Überschreiten eines Schwellenpotentials und dadurch bedingte Öffnung von Kalzium-Kanälen zur Kontraktion führt. Diese sogenannten „Slow waves“ haben ihren Ursprung in den Interstitiellen Zellen nach Cajal. Dies sind Schrittmacherzellen, die Schrittmacherpotentiale generieren und diese an die glatten Muskelzellen weitergeben (KITO u. SUZUKI 2003a,c; SUZUKI 2000). Das enterische Nervensystem kann über Transmitter und deren Wirkung auf Ionenkanäle diese Schwankungen modellieren (ROLLE et al. 2007).
Ziel dieser Arbeit war es, die Schwankungen des Membranpotentials der glatten Muskelzellen des Labmagens zu charakterisieren sowie die möglichen Effekte von BHB und verschiedenen Kalziumkonzentrationen auf dieses Membranpotential zu untersuchen. Hierzu dienten zum einen die Mikroelektrodentechnik zur Messung des schwankenden Membranpotentials und zum anderen in vitro Motilitätsmessungen zur Überprüfung der Kontraktionsaktivität der Labmagenmuskulatur.
Um zu klären, ob Hypokalzämie und Ketose als kausale prädisponierende Faktoren der Labmagenverlagerung in Betracht kommen, sollte die Frage beantwortet werden, ob eine unter in vitro Bedingungen erzeugte Ketose oder Hypokalzämie die Aktivität der Slow waves beeinträchtigt und ob sich dies auch auf die Motilität der Labmagenmuskulatur auswirkt.
Literaturübersicht
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2 Literaturübersicht
2.1 Anatomische und physiologische Grundlagen
2.1.1 Die Anatomie des Labmagens
Der Labmagen liegt als birnenförmiger Sack rechts vom Pansen der ventralen Bauchwand an. Man gliedert ihn in Fundus, Corpus und Pars pylorica. Der blindsackähnliche Fundus liegt in der Medianen während sich der Corpus größtenteils links und die Pars pylorica eher rechts der Medianen befindet. Die Pars pylorica wendet sich im Bereich des rechten Rippenbogens nach dorsal und geht schließlich über den Pylorus in den Dünndarm über (Abb. 1) (VOLLMERHAUS u:
ROOS 1999; DIRKSEN 2006).
Die Labmagenwand baut sich über fünf Schichten auf: den äußeren serösen Überzug des Organs bildet die Tunica serosa, unter der die Tela subserosa liegt. Es folgt die Tunica muscularis bestehend aus zwei Muskelschichten. Die äußere Schicht bilden die longitudinal verlaufenden Muskelfasern, die innere Schicht besteht aus den zirkulär verlaufenden Fasern. Dazwischen liegt der Plexus myentericus. Diese grenzen an die Tela submucosa und die abschließende Tunica mucosa, die die Schleimhautauskleidung des Labmagens darstellt (LIEBICH 2003).
Abbildung 1: Darstellung der Lage des Labmagens in situ. Rechte Seitenansicht. Modifiziert nach Vet. Med. Fakultät der Universität München, Klinik für Rinder
Literaturübersicht
16 2.1.2 Morphologie der glatten Muskelzelle
Die longitudinale und die zirkuläre Muskelschicht des Labmagens bestehen aus glatter Muskulatur. Die glatte Muskelzelle ist spindelförmig und lässt keine geordnete Myofibrillenstruktur erkennen. Der Zellkern liegt mittig. Im schmalen Zytoplasma finden sich zahlreiche Mitochondrien und das sarkoplasmatische Retikulum als Kalziumspeicher. Mikropinozytotische Bläschen, sogenannte Caveolae, unterbrechen an den Zellenden das Plasmalemm und sind an der extrazellulären Kalziumaufnahme beteiligt, indem sie verschiedene Ca2+-Kanäle und –Austauscher beherbergen. (HOROWITZ et al.1996; LIEBICH 2003). Aktin- und Myosinfilamente bilden die Myofilamente, wobei das zytosolische Aktin in der inaktiven glatten Muskelzelle zum grössten Teil in gelöster Form vorliegt, aber ein ständiger Wechsel in Aktin-Monomere und Aktin-Filamente erfolgt (GUNST u. ZHANG 2008). Erst durch Polymerisation bildet sich das Aktin strukturell aus. Über Haftplatten sind die Aktinfilamente untereinander sowie am Plasmalemm verankert. Letztlich bilden die Aktinfilamente ein dreidimensionales Netz, welches die Myosinfilamente umschließt.
Intermediäre Mikrofilamente bilden das Zytoskelett der Zelle und sind nicht kontraktil.
Während der Kontraktion wird die spindelförmige Zelle zunehmend verkürzt und nimmt an Umfang zu, so dass ihre Gestalt eher rund erscheint (LIEBICH 2003).
2.1.3 Kontraktionsmechanismus
Die Kontraktion der glatten Muskelzelle ist essentiell von einem Kalziumeinstrom in die Zelle abhängig. Dieser kann über verschiedene Mechanismen ausgelöst werden:
Im Sarcolemm finden sich zum einen Ca²+- selektive Kanäle wie der L- und T-Typ Kanal, die beide potentialabhängig sind (THORNELOE u. NELSON 2005). Die Funktion des T-Typ Kanals ist noch nicht hinreichend geklärt, aber er wird bei einer geringeren Depolarisation geöffnet und schließt schneller als der L-Typ Kanal, der bei einer stärkeren Depolarisation der Zellmembran öffnet und einen Ca2+-Influx nach intrazellulär ermöglicht (THORNELOE u. NELSON 2005). Der Kalziumeinstrom kann aber auch über potentialabhängige und nicht selektive Kationenkanäle erfolgen, die entweder über Rezeptoren (z.B. Acetylcholin-Rezeptoren), durch Dehnung oder tonische Aktivität geöffnet werden (HOROWITZ et al. 1996; THORNELOE u.
NELSON 2005). Durch diesen extrazellulären Ca2+-Einstrom wird der Komplex aus
Literaturübersicht
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Ryanodin-Rezeptor und Ca2+-Kanal am sarkoplasmatischen Retikulum ebenso aktiviert, wie der ebenfalls dort lokalisierte Inositol 1,4,5-tris-Phosphat regulierte Kanal (THORNELOE u. NELSON 2005). Dies führt zu einer weiteren Kalziumfreisetzung. Zum einen bindet das nun frei vorhandene Ca2+ an Calmodulin, was zur Aktivierung der Myosinleichtketten-Kinase führt, die nun ihrerseits die Myosinleichtkette phosphoryliert und damit die Myosin-ATPase aktiviert (HOROWITZ et al. 1996). Gleichzeitig wird das Hemmprotein Caldesmon an der Myosinbindungsstelle des Aktins von einer weiteren Proteinkinase phosphoryliert, was letztlich den Querbrückenzyklus zwischen Aktin und Myosin ermöglicht. Die Trennung der Filamente erfolgt durch Abkopplung der an das Myosin angehängten Phosphatgruppen durch die Myosinphosphatase (HOROWITZ et al. 1996). Zum anderen wird angenommen, dass durch das intrazellulär vorhandene Ca2+ ein negativer Feedback-Mechanismus in Gang gesetzt wird. Dieser limitiert die Kontraktion über eine Ca2+-abhängige Aktivierung von hochleitenden K+-Kanälen, welche das Membranpotential wieder hyperpolarisieren. Für den Rücktransport des Ca2+ nach extrazellulär steht die „Plasma membrane Ca2+-ATPase“ (PMCA), (FLOYD u. WRAY 2007) als Ca2+-stimulierte, Mg2+ abhängige „P-Typ“ ATPase sowie ein Na+/Ca2+- Austauscher zur Verfügung (THORNELOE u. NELSON 2005). Auch die Rückführung des Ca2+ in das sarkoplasmatische Retikulum erfolgt über eine Ca2+-ATPase; in diesem Fall über die „Sarcoplasmatic reticulum Ca2+-ATPase“
(SERCA). Zusätzlich dienen Ca2+-bindende Moleküle als Puffer um das Ca2+ in der Zelle abzufangen (HOROWITZ et al. 1996; THORNELOE u. NELSON 2005).
GUNST und ZHANG (2008) bringen einen weiteren wesentlichen Aspekt im Kontraktionsmechanismus ins Gespräch. Die Aktinpolymerisation ist demnach unabhängig vom Querbrückenzyklus und dient zusätzlich als kortikales Aktin der Stabilisierung des Zytoskeletts der Zelle. Zusammenfassend kann so ein mechanischer oder kontraktiler Stimulus über Integrin- oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zum einen das Aktin-Zytoskelett modellieren und zum anderen das Actomyosin-System in Gang setzen. Diese beiden Prozesse können unabhängig voneinander aktiviert werden, aber die Entwicklung der Kontraktionskraft erfordert die Aktivierung beider Systeme (GUNST u. ZHANG 2008).
Literaturübersicht
18 2.1.4 Slow waves
Eine Besonderheit der glatten Muskelzelle im Intestinaltrakt sind die sogenannten Slow waves. Es handelt sich dabei um zyklische Depolarisationen des Membranpotentials, die zur Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle führen und somit die Kontraktion auslösen können (SUZUKI et al. 2006). Man kann diese Depolarisationen nach ihrer Entstehung in zwei Komponenten unterteilen: Der erste Teil bildet die Basis als sogenanntes Driving Potential, das von den Interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC; siehe Kapitel 2.2) ausgeht, die im Plexus myentericus beheimatet sind. Die intramuskulär gelegenen ICC fügen die zweite Komponente hinzu, die sich als Spitze auf der Basis darstellt. Dies bedeutet, dass vor allem die im Plexus myentericus liegenden ICC für die Frequenz der Slow waves verantwortlich sind (DOMAE et al. 2008; SUZUKI et al. 2006).
In der muskulären Schicht des Corpus des Meerschweinchenmagens konnte eine Schrittmacheraktivität gemessen werden, die sich in den anderen Magenregionen leicht zeitversetzt ebenso nachweisen ließ. Diese Aktivität geht also dominant von den corporalen ICC aus (HASHITANI et al. 2005). Am Magen des Meerschweinchens wurde ebenfalls gezeigt, wie unterschiedlich die Aktivität der Slow waves an verschiedenen Lokalisationen ausfallen kann: so konnten DOMAE et al. (2008) in der Fundusregion keine deutlichen elektrischen Oszillationen nachweisen, während im Corpus bereits Slow waves aufgezeichnet wurden. Im Bereich des Antrums und Pylorus wurde deren Frequenz wieder kleiner. Dafür stieg die Amplitudenhöhe der Potentialschwankungen deutlich an. Einen Zusammenhang zwischen der Depolarisation des Membranpotentials und der kleiner werdenden Amplitude bzw. steigenden Frequenz der Slow waves konnten HIRST et al. (2008) darstellen. Auch über die Zeit gibt es Schwankungen: im basalen Membranpotential der glatten Muskelzellen des Meerschweinchenmagens, in der Frequenz und auch in der Amplitude der Slow waves (HIRST et al. 2008). So kam es in einem Zeitabschnitt von einer Stunde zu zwei Depolarisationen des basalen Membranpotentials.
Während der Depolarisationen stieg gleichzeitig die Frequenz der elektrischen Oszillationen an, während die Amplituden kleiner wurden (HIRST et al. 2008). In weiteren in vitro Versuchen wurde auch ein Temperatureinfluss ermittelt: bei
Literaturübersicht
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steigenden Temperaturen stieg die Frequenz der Schrittmacherpotentiale der ICC, während ihre Dauer abnahm. Dies übertrug sich entsprechend auf die Slow waves (KITO u. SUZUKI 2007). Am Labmagen des Schafes konnte in der Fundusregion einschließlich der großen Kurvatur keine elektrische Aktivität festgestellt werden. Im Antrum jedoch wurden myoelektrische Entladungen mit einer Frequenz von sieben pro Minute gemessen. Diese Aktivität wurde durch Fütterung der Tiere erhöht (RUCKEBUSCH 1970).
Bei Mikroelektroden-Messungen am Dünndarm der Maus zeigten Slow waves und Schrittmacherpotentiale der ICC die gleiche Frequenz. Die Amplitude der Schrittmacherpotentiale der ICC war allerdings größer als die der Slow waves in den glatten Muskelzellen (KITO u. SUZUKI 2003c).
2.2 Interstitielle Zellen nach Cajal
Die Interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC) sind als autark fungierende Schrittmacherzellen verantwortlich für die Slow waves in den glatten Muskelzellen.
Im Magen findet man vornehmlich zwei Populationen der ICC: zum einen bilden sie ein Netzwerk direkt in den Muskelschichten und zum anderen findet man sie im Plexus myentericus, also zwischen den beiden Muskelschichten gelegen (TAKAKI 2003).
Ihr triangel- bis sternförmiger Zellleib weist lange Fortsätze auf, mit denen sie engen Kontakt nicht nur zu anderen ICC, sondern auch zu glatten Muskelzellen und enterischen Neuronen halten (KITO u. SUZUKI 2003a). Vor allem die intramuskulär gelegenen ICC haben eine sehr enge Verknüpfung zu den Neuronen des enterischen Nervensystems (KITO 2011). Wie die Verbindungen zu den einzelnen Zellen aussehen, ist noch nicht abschließend geklärt (GARCIA-LOPEZ et al. 2009).
Gap junctions konnten an dieser Stelle ausgeschlossen werden und man geht eher von sogenannten Peg and Socket junctions aus. Dieses sind zytoplasmatische Ausläufer einer Zelle, die in Einstülpungen der Zellmembran benachbarter Zellen
Literaturübersicht
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ragen (GARCIA-LOPEZ et al. 2009). Insgesamt entsteht so ein dreidimensionales Netzwerk aus ICC und glatten Muskelzellen, in dem alle Zellen elektrisch miteinander gekoppelt sind (SUZUKI 2000). Mittlerweile hat man den mesenchymalen Ursprung der ICC nachgewiesen (KITO u. SUZUKI 2003a; ROLLE et al. 2007). Im Gegensatz zu den glatten Muskelzellen haben sie allerdings keine kontraktilen Eigenschaften.
Ihre Anzahl an Mitochondrien ist sehr hoch. Als typisches Nachweismerkmal gilt der c-Kit- Antikörpernachweis: c-Kit ist ein transmembranärer Protein Kinase-Rezeptor, welcher essentiell für die Entwicklung und Funktion der ICC ist (GARCIA-LOPEZ et al. 2009; KITO u. SUZUKI 2003a; TAKAKI 2003).
Die Funktionen der ICC können in 4 Aufgabenbereiche unterteilt werden:
1. Die ICC generieren als Schrittmacherzellen sogenannte Schrittmacherpotentiale (ROLLE et al. 2007), die als Slow waves in den glatten Muskelzellen detektierbar sind. Diese Schrittmacherpotentiale haben ihren Ursprung in der Kalziumfreisetzung aus internen Inositoltriphosphat-abhängigen Speichern (GARCIA-LOPEZ et al.
2009). SUZUKI et al. (2006) brachten eine Theorie über die Potentialentstehung in den Mitochondrien auf: so produzieren Mitochondrien während der ATP-Synthese freie Protonen, die über eine Protonenpumpe ins Zytosol verbracht werden, wodurch im Mitochondrium eine negative Ladung herrscht. Als Ausgleich werden Kalziumionen ins Mitochondrium gesogen. Die Erhöhung des mitochondrialen Kalziumgehaltes fördert die Aktivität der Mitochondrien und aktiviert ATP-sensitive Kalium-Kanäle. Diese liegen in der Mitochondrienmembran und leiten Kalium ins Mitochondrium. Kalium strömt ein, woraufhin ein Netto-Ausstrom von Kalzium erfolgt.
Die Konsequenz ist ein periodischer Wandel in der Kalziumkonzentration um das Mitochondrium herum, der allein durch dessen metabolische Aktivität erzeugt wird.
Das erhöhte freie Kalzium im Zytosol bewirkt eine Aktivierung der Protein Kinase C, wodurch über die Phospholipase C Inositoltriphosphat entsteht. Dieses bindet an den Rezeptor am Endoplasmatischen Retikulum und weiteres Kalzium wird freigesetzt.
Nun können verschiedene Kalzium-sensitive Kanäle die Membran depolarisieren.
Schlussendlich ist noch nicht geklärt, welche Kanäle für die Depolarisation verantwortlich sind. Es konnte aber gezeigt werden, dass eine Hemmung der
Literaturübersicht
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Mitochondrien zur Frequenzabnahme von Slow waves führte, und die Blockade interner Kalziumspeicher die Amplitude der Slow waves verkleinerte (SUZUKI et al.
2006). Wenn man Slow waves gleichzeitig in den Plexus myentericus nahe gelegenen Muskelzellen und denen der Submukosa nahe gelegenen Zellen aufzeichnet, so entstehen sie immer zuerst Plexus nah (BAUER et al. 1985), was als Indiz für den Ursprung im Plexus myentericus gewertet werden kann.
2. ICC sind die Mediatoren des enterischen Nervensystems (ENS) (ROLLE et al.
2007). Hemmende und erregende Motoneurone sind sehr nah mit den ICC assoziiert. Da die glatten Muskelzellen im Gegensatz zu den ICC nicht direkt innerviert werden, scheint in den ICC die Schnittstelle in der Weiterleitung zwischen dem ENS und den glatten Muskelzellen zu liegen (KITO 2011).
Immunhistochemische Studien konnten die Bindung verschiedener Neurotransmitter an den ICC darstellen, so dass angenommen wird, dass es spezielle Kontaktstellen zwischen dem ENS und den ICC geben muss (GARCIA-LOPEZ et al. 2009).
3. ICC dienen als „non-neuronal-stretch-sensors“ mit Einfluss auf die Slow wave- Frequenz und Erregbarkeit der glatten Muskelzellen (ROLLE et al. 2007; WON et al.
2005). Hier scheinen vor allem die Bereiche der Peg and socket junctions eine Rolle zu spielen.
4. ICC formen sehr enge Verbindungen zu intramuskulären Endigungen vagaler Afferenzen, so dass hier auch ein Einfluss auf afferente Signale zu vermuten ist (ROLLE et al. 2007).
Die Aktivität der glatten Muskelzellen im Gastrointestinaltrakt bleibt auch bei ausgeschaltetem ENS über die ICC als primäre Schrittmacher erhalten (BECKETT et al. 2003; TAKAKI 2003).
Literaturübersicht
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2.3 Die linksseitige Labmagenverlagerung (Dislocatio abomasi sinistra)
Die linksseitige Labmagenverlagerung (LMV) des Rindes tritt weit häufiger auf als die rechtsseitige (CONSTABLE et al. 1992; STENGÅRDE et al. 2002; ZADNIK 2003).
Als grundsätzliche Ursache für die Verlagerung des Labmagens zwischen linke Bauchwand und Pansen wird eine Hypo- bis Atonie der glatten Muskulatur der Labmagenwand postuliert. Bei gleichzeitiger Dilatation und Gasansammlung in der Fundusregion kann das Organ bei geringer Pansenfüllung an der linken Bauchwand aufsteigen (CONSTABLE et al. 1992; GEISHAUSER et al. 1998).
2.3.1 Klinische Symptomatik
Die meisten Tiere erkranken in einem Zeitraum von drei Wochen vor bis vier Wochen nach dem Kalben (DELGADO-LECAROZ et al. 2000; DIRKSEN 1967; STENÅGRDE et al 2002). Unspezifische Symptome sind Milch-, Gewichts- und Appetitrückgang (VAN WINDEN et al. 2003), kleine Kotmengen, die später eine pastös-schmierige Konsistenz und schwärzliche Färbung annehmen und bei 90 % der Tiere ein geringer bis starker Ketonkörpergehalt (Acetoacetat, BHB, Aceton) im Harn (DIRKSEN 1967; FORD 1950). Spezifische Symptome sind die Aufbiegung der linken abdominalen Rippen bzw. eine Asymmetrie des Abdomens, wobei entweder die linke Hungergrube deutlich eingesunken ist, weil der Pansen abgedrängt und wenig gefüllt ist, oder aber sich die Labmagenkuppe sichtbar in die linke Hungergrube einwölbt. Die Auskultation von Labmagengeräuschen führt zur Diagnosesicherung: Pansengeräusche sind nicht wie beim gesunden Rind in der Hungergrube und im Bereich der rippengestützten Bauchwand wahrnehmbar. Hier ertönen bei an linksseitiger LMV erkrankten Tieren recht unregelmäßig metallisch helle und hochklingende Töne des Labmagens (DIRKSEN 1967). Ansonsten zeigen die Tiere, soweit keine anderen Begleiterkrankungen vorliegen, keine weiteren klinischen Anzeichen. Bei einigen Patienten kann allerdings eine vagotone Bradykardie festgestellt werden (DIRKSEN 1967).
Literaturübersicht
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2.3.2 Auslösende und prädisponierende Faktoren der LMV
Multifaktorielle Einflüsse scheinen in Verbindung mit der Erkrankung zu stehen. Bei MUYLLE et al. (1990) traten Hyperglykämien und Leberverfettung bei erkrankten Tieren deutlich häufiger auf als bei gesunden. VAN WINDEN et al. (2003) konnten dagegen in ihrer Feldstudie feststellen, dass schon zehn Tage vor der Diagnose der linksseitigen LMV die Konzentrationen von Kalzium, Glucose und Insulin im Blut deutlich abgesunken waren. Gleichzeitig war ein Anstieg der freien Fettsäuren, von BHB und der Aktivität der Aspartat-Aminotransferase (AST) zu verzeichnen. Ähnliche Ergebnisse beobachteten auch ITOH et al. (1998): Auch hier stieg die Aktivität der AST, die Konzentration der freien Fettsäuren und die der Ketonkörper im Blut an. Der Parameter Cholesterol fiel bei den erkrankten Tieren ab. In dieser Studie wurden weitere blutchemische Parameter zwischen an linksseitiger LMV erkrankten Tieren und rein ketotischen Tieren verglichen. Da die Ergebnisse zwischen beiden Gruppen deutlich unterschiedlich waren, ging man auch von unterschiedlichen biochemischen Mechanismen in der jeweiligen Krankheitsentstehung aus. So waren ITOH et al.
(1998) der Meinung, dass die Ketose und die LMV in keinem direkten Zusammenhang in ihrer Pathogenese stehen.
GEISHAUSER et al. (1997a) sah in dem Anstieg der AST und des BHB in der ersten und zweiten Woche post partum einen guten Test um eine LMV vorherzusagen. Ein Jahr später zeigten GEISHAUSER et al. (1998) in in vitro Versuchen, dass die Labmagenmuskulatur von an LMV erkrankten Rindern eine verminderte Ansprechbarkeit auf Acetylcholin aufwies. Er schloss daraus eine Malfunktion auf der Stufe des intrinsischen Nervensystems kombiniert mit einer verschlechterten cholinergen Muskelantwort. DELGADO-LECAROZ et al. (2000) wiesen für Kühe mit linksseitiger LMV in einer Feldstudie niedrigere Kalzium-, Phosphor-, Magnesium-, Kalium- und Cloridkonzentrationen im Blut nach als bei Kontrolltieren. In dieser Studie lagen 70% aller erkrankten Tiere unter den Richtwerten für Blutkalziumgehalte und wiesen eine subklinische bis klinische Hypokalzämie auf, die sich nur bei 23%
der Kontrolltiere zeigte. Auch MASSEY et al. (1993) berechneten ein 4,8mal höheres Risiko für Tiere mit Hypokalzämie während der Trächtigkeit an linksseitiger LMV zu erkranken. Bei LEBLANC et al. (2005) zeigte sich dagegen kein Zusammenhang
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zwischen der Serum-Kalziumkonzentration und der linksseitigen LMV. Dafür hielten sie den Anstieg von BHB vor allem post partum für einen geeigneten Test um das Risiko für die Erkrankung einzuschätzen. So errechneten sie ein 8mal höheres Erkrankungsrisiko für Tiere, deren BHB-Gehalt im Blut höher als 1200 μmol/l lag.
Insgesamt wird die Ketose durchaus als Risikofaktor für die LMV eingestuft (SEN et al. 2006). Zusätzlich haben Milchkühe, die an LMV leiden, eine abnormale Phosphor- Homöostase: Serum-Phosphat war in einer Studie von GRÜNBERG et al. (2005) bei erkrankten Tieren signifikant niedriger als bei gesunden Tieren. Dies zeigte sich auch bei Tieren mit einer rechtsseitigen Labmagenverlagerung oder einem abomasalen Volvulus.
Zusätzlich bringt jedes Tier individuelle Risikofaktoren mit ein: Je älter die Tiere werden, umso mehr steigt die Wahrscheinlichkeit an einer LMV zu erkranken. Das höchste Risiko tragen die Tiere zwischen viertem und siebtem Lebensjahr (CONSTABLE et al. 1992). Zusätzlich erkranken multipare Kühe deutlich häufiger als primipare (STENGÅRDE et al. 2002). Hinzu kommt eine genetische Disposition:
dieser wurde in früheren Jahren noch eine untergeordnete Rolle zugeteilt (COPPOCK 1973). Mittlerweile haben JUBB et al. (1991) in einer Studie über Erkrankungen in Beziehung zu Verwandschaften genetische Dispositionen eingeräumt. In diesem Bezug sind sicherlich auch rassebedingte Risiken zu nennen:
CONSTABLE et al. (1992) konnten für Milchrinder grundsätzlich ein erhöhtes Risiko im Vergleich zu Fleischrindern konstatieren. Weiterhin wiesen sie Guernsey Rindern das höchste Risiko zu, gefolgt von Holstein-Friesian und letztlich Brown Suisse.
STENGÅRDE et al. (2002) sahen Schwedisch-Friesian Kühe prädisponierter als Schwedisch Rot-Weiße.
Auch das Management der Tiere hat großen Einfluss auf die Erkrankungsrate: In Herden mit hoher Milchleistung ist auch der Anteil der erkrankten Tiere deutlich erhöht (JUBB et al. 1991). Optimale Haltungsbedingungen einschließlich Fütterung mit hohem Rohfasergehalt können das Risiko zwar senken, aber es gibt immer wieder suboptimal gepflegte Herden, die durch geringe Erkrankungszahlen auffallen und umgekehrt. Das Verhalten des Einzeltieres hinsichtlich Aufstehen, Hinlegen oder
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Umherlaufen kann, wie der Einfluss des Menschen durch Transport oder Wälzen der Tiere zum einen zu einer Rückverlagerung des Labmagens in physiologische Position führen, zum anderen aber auch erst die Erkrankung herbeiführen. Auch ein Wechsel der Verlagerung von links nach rechts ist möglich (DIRKSEN 2006).
2.4 β – Hydroxybutyrat (BHB) und Ketose
Der Übergang vom tragenden, nicht-laktierenden Status zum nicht-tragenden, laktierenden Status ist für die Kuh in Bezug auf ihren Energiestoffwechsel eine schwierige Adaptation (GOFF et al. 1997). Aufgrund des plötzlich ansteigenden Energiebedarfs für die Milchproduktion kommt die laktierende Milchkuh in dieser Zeit in eine negative Energiebilanz. Sie kann nicht mehr so viel Energie aus dem Futter gewinnen, wie benötigt wird (GOFF et al.1997; HAYIRLI 2006; HERDT 2000). In gewissem Maße ist sie aber in der Lage, ihren Stoffwechsel entsprechend anzupassen und Energie aus der Bildung und dem Abbau von Ketonkörpern zu gewinnen.
In der Leber können unveresterte Fettsäuren zu Ketonkörpern metabolisiert werden oder zu Triglyzeriden rückverestert werden. Die Verteilung in die eine oder andere Richtung ist abhängig von der aktuellen Energiebilanz (HERDT 2000). So lange genügend Glucose vorhanden ist, gelangt diese in den Krebs-Zyklus (Citratzyklus) in den Mitochondrien der Leberzellen. Das gebildete Citrat wird aus dem Mitochondrium ausgeschleust und in Malonyl-CoA umgebaut. Dieses wiederum inhibiert die Carnitin-Palmityltransferase 1 (CPT 1), die freie Fettsäuren ins Mitochondrium transportiert und damit die Ketogenese in Gang setzt. Damit besteht eine reziproke Assoziation zwischen dem Kohlenhydrat-Status und der Ketonkörpersynthese in der Leber (HERDT 2000). Bei Glucosemangel wird dagegen kaum Malonyl-CoA gebildet, so dass freie Fettsäuren über die CPT 1 ins Mitochondrium transportiert werden. Aus den freien Fettsäuren entsteht Acetyl-CoA, der Vorläufer der Ketonkörper. Acetyl-CoA unterdrückt den Glukoseverbrauch und
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stimuliert die Gluconeogenese. Der Ketonkörper Acetoacetat verläßt das Mitochondrium ins Zytosol, wo ein Teil in BHB umgewandelt wird, um dann die Leber über den Blutkreislauf zu verlassen und als zusätzlicher Energieträger zu dienen (HERDT 2000). Diese physiologische Bildung von Ketonkörpern kann durch eine verminderte Adaptation an die negative Energiebilanz gestört sein. Das Ergebnis ist die Ketose und die Fettleber.
Die Ketose wurde von HOLTENIUS und HOLTENIUS (1996) in zwei Typen eingeteilt. Die Typ 1-Ketose tritt erst drei bis sechs Wochen nach dem Kalben bei Kühen auf, deren Milchproduktion so hoch ist, dass der Glucosebedarf das Glucoseangebot deutlich übersteigt. Um den Körper vor zu hohem Proteinabbau für die nötige Gluconeogenese zu schützen, wird die Energiegewinnung durch Ketonkörper erhöht. In diesem stark katabolen Status sind die Plasmalevel von Glucose und Insulin sehr niedrig, die Ketonkörperspiegel sind stark erhöht und das Risiko für eine Leberverfettung ist gering. Es entsteht eine Hypoglykämie und Hypoinsulinämie ähnlich des Typ-1 Diabetes beim Menschen. Dieses Krankheitsbild wird auch spontane Ketose genannt (HERDT 2000).
SAKAI et al. (1993) konnten in einer Feldstudie zeigen, dass die Plasma-Insulin- Konzentration bei ketotischen Tieren deutlich niedriger war als bei Kontrolltieren.
Auch der Anstieg der Insulinwerte nach einer Glucose-Infusion war signifikant geringer als bei gesunden Kühen. 1996 konnten sie diese Ergebnisse noch einmal untermauern: Bei gesunden Kühen stieg die Insulinkonzentration im Blut nach Glucose-Infusion um das 7fache, bei ketotischen Tieren nur um das 3 bis 6 fache (SAKAI et al. 1996). Auch ITOH et al. (1998) wiesen für ketotische Tiere einen signifikant erniedrigten Blutglucosespiegel nach. Zusätzlich stellten sie eine deutliche Erhöhung der AST, der freien Fettsäuren, des Cholesterols und der Ketonkörper fest.
Die hyperglykämische und hyperinsulinämische Form ist die Typ 2-Ketose. Sie tritt in der Frühlaktation kurz nach dem Kalben auf. Wichtigster ätiologischer Faktor ist die Überfütterung der Milchkuh während der Trockenstehperiode, die zu erhöhten Plasmaglucose- und Insulinwerten führt und meist von einer Insulinresistenz begleitet wird. Es kommt zu einer vermehrten Lipolyse des Fettgewebes. Dadurch
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akkumulieren große Mengen freier Fettsäuren in der Leber, ohne dass die Gluconeogenese und die Ketogenese maximal stimuliert sind. Die vermehrt produzierten Triglyzeride, für deren Bluttransport nicht genügend Lipoproteine zur Verfügung stehen, reichern sich in den Leberzellen an. Als Konsequenz kommt es zur Leberverfettung. Dieses Krankheitsbild ist mit dem Typ-2 Diabetes des Menschen zu vergleichen (HOLTENIUS u. HOLTENIUS 1996).
Insgesamt wird also bei der Ketose die Oxidation von unveresterten Fettsäuren zu Ketonkörpern gesteigert, während die Veresterung zu Triglyzeriden vermindert wird (HOLTENIUS u. HOLTENIUS 1996).
Bei an linksseitiger LMV erkrankten Tieren ist der BHB-Anteil im Blut signifikant höher als bei gesunden Tieren, was bei diesen Tieren auf Energieimbalancen hindeutet (ZADNIK 2003). SEN et al. (2006) haben die Ketose als Risikofaktor für die LMV gewertet, da in ihren Untersuchungen alle an LMV erkrankten Tiere eine subklinische bis klinische Ketose aufwiesen. Untersuchungen von VAN WINDEN et al. (2003) deuten darauf hin, dass die Ketose zeitlich vor der LMV auftritt und damit eventuell an der Pathogenese der LMV beteiligt ist.
(Labor-) Referenzwerte BHB-Konzentration
[mmol/l]
BHB-Konzentration bei gesunden Kühen
[mmol/l]
BHB-Konzentration bei ketotischen Kühen
[mmol/l]
Autoren 0,868
(Median; n=108)
GEISHAUSER et al.
1997a
0,8 - 1 4,0 - 8,0 HOEBEN et al.
1997 0,316 ± 0,088
(Mean±SD; n=9)
1,867 ± 1,44
(Mean±SD; n=16) ITOH et al. 1998
< 1,4 LEBLANC et al.
2005 0,31
(n=10) SEN et al. 2006
≤0,9 STENGÅRDE et al.
2010 0,99
(n=8)
VAN WINDEN et al. 2003
Tabelle 1: Darstellung der (Labor-)Referenzwerte und der gemessenen BHB-Konzentrationen im Blutplasma von gesunden und ketotischen Kühen verschiedener Autoren
Literaturübersicht
28 2.5 Kalzium und Hypokalzämie
Ähnlich wie der Energiehaushalt erfährt auch der Kalziumhaushalt mit Eintritt in die Laktation eine große Umstellung. So wird für die Milchproduktion deutlich mehr Kalzium in die Milch abgegeben, als die Kuh aus der Nahrung aufnehmen kann. Um diese Lücke zu schließen, begibt sich die Kuh in eine laktationsbedingte Osteoporose (GOFF 2008). Die Kalziumresorption aus dem Knochen wird über das Parathormon (PTH) angeregt, sobald zu wenig Kalzium im Blut vorhanden ist. Auch die renale tubuläre Rückresorption wird durch PTH stimuliert. Die Umwandlung von Vitamin D in das 1,25 Dihydroxyvitamin D in der Niere steigert die Kalziumresorption im Darm und ist ebenfalls PTH abhängig (GOFF 2008). Die physiologischen Gesamtkalziumwerte im Blut liegen beim Rind zwischen 2,1 – 2,8 mmol/l (Tab. 2).
Hypokalzämie vermindert die Sekretion von Insulin und damit die Aufnahme von Glucose ins Gewebe. Es folgt eine erhöhte Fettmobilisation und ein erhöhtes Risiko für eine Ketose. Die eingeschränkte Futteraufnahme, die mit dem klinischen Bild der Hypokalzämie verbunden ist, führt zu einer verminderten Pansenfüllung und zu reduzierter Labmagenmotilität. Alle diese Effekte der Hypokalzämie prädisponieren die Entwicklung einer Labmagenverlagerung (GOFF u. HORST 1997).
In verschiedenen Studien konnte bisher eine Korrelation zwischen der Hypokalzämie und der Labmagenverlagerung hergestellt werden. DELGADO-LECAROZ et al.
(2000) wiesen bei an linksseitiger LMV erkrankten Milchkühen signifikant niedrigere Kalziumkonzentrationen im Blut nach im Vergleich zu gesunden Tieren der gleichen Herde. 70 % der erkrankten Tiere waren hypokalzämisch, während es bei den Kontrolltieren nur 23 % waren. SEN et al. (2006) erhielten in ihrer Studie ähnliche Ergebnisse für das ionisierte Kalzium im Blut. Auch ZADNIK (2003) konnte über Blutanalysen eine Korrelation zwischen Hypokalzämie und LMV herstellen.
MASSEY (1993) errechnete für Kühe, die zur Geburt hypokalzämisch waren, sogar ein 4,8mal höheres Risiko an LMV zu erkranken als für normokalzämische Tiere.
Literaturübersicht
29
Allerdings gibt es auch Studien mit gegenteiliger Aussage: LEBLANC et al. (2005) konnten keine Unterschiede im Serumgesamtkalziumgehalt von an LMV erkrankten und gesunden Kühen erkennen. Sie deuteten die Ergebnisse so, dass nicht die Hypokalzämie der Risikofaktor für die LMV ist. Die Hypokalzämie ist ihrer Meinung nach ein Symptom einer nicht ausreichenden Futteraufnahme im Puerperium, was mit anderen direkt LMV-auslösenden Faktoren, wie erhöhte freie Fettsäuren oder einer subklinischen Ketose, zusammenfällt. Den Zusammenhang zwischen Hypokalzämie und negativer Energiebilanz arbeiteten auch REINHARDT et al.
(2010) heraus: Kühe mit Serumkalziumkonzentrationen über 2 mmol/l hatten signifikant niedrigere Gehalte an unveresterten Fettsäuren im Serum. Dies deutete auf eine bessere Energiebilanz im Vergleich zu Tieren mit subklinischer Hypokalzämie hin. Auch GEISHAUSER (1997) konnte keine Assoziation zwischen LMV und Hypokalzämie feststellen.
Allerdings konnte DANIEL (1983) die Anzahl der Kontraktionen von Pansen und Labmagen signifikant reduzieren, indem er die physiologische Konzentration des freien Kalziums im Blut von Kühen akut um die Hälfte absenkte. Die Reduktion der Labmagenmotilität wiederum kann die Entstehung einer LMV stark begünstigen (GOFF 2007). Auch HANSEN et al. (2003) konnten in einer Studie über die Effekte einer induzierten subklinischen Hypokalzämie auf die Futteraufnahme und Wiederkau- und Kauaktivität bei Kühen den negativen Einfluss von erniedrigten freien Kalziumgehalten im Blut auf die genannten Parameter feststellen. Bei Konzentrationen des freien Kalziums im Blut zwischen 0,8 mmol/l und 0,6 mmol/l fiel die Futteraufnahme linear mit dem Kalziumgehalt und auch die Wiederkauaktivität und die Kauaktivität verminderten sich deutlich. Dabei zeigten die Tiere keine weiteren klinischen Anzeichen einer Hypokalzämie.
Literaturübersicht
30 (Labor-)
Referenzwerte Cagesamt [mmol/l]
(Labor-) Referenzwerte Caionisiert [mmol/l]
Cagesamt bei gesunden Kühen
[mmol/l]
Caionisiert bei gesunden Kühen
[mmol/l] Autor
2,5 ± 0,22
(Mean±SD; n=7) DANIEL 1983
≥ 2,08
2,2 DELGADO-
LECAROZ et al.
2000 (n=96)
> 1,97 > 0,99 GEISHAUSER u.
OEKENTORP 1997
2,1-2,5 GOFF 2008
2,19-2,83 1,06-1,26 HANSEN et al.
2003 1,33 ± 0,053
(Mean±SD; n=10) SEN et al. 2006
1,0-1,3 SCHÄNZLE 2002
Tabelle 2: Zusammenfassende Darstellung für die Referenzwerte und gemessenen Kalziumkonzentrationen (Cagesamt= Gesamtkalziumkonzentration im Blutplasma; Caionisiert= ionisiertes Kalzium im Blutplasma) verschiedener Autoren
2.6 Kalium–Homöostase
Der intrazelluläre Kaliumgehalt liegt bei Säugetieren zwischen 120 und 140 mmol/l, der extrazelluläre bei 3,5 – 5 mmol/l. Die homöostatische Kontrolle der extrazellulären Kaliumkonzentration ist essentiell für die physiologischen Funktionen von Nerven und Muskelzellen, weil Kalium wesentlichen Einfluss auf das Membranpotential hat (YOUN u. MCDONOUGH 2009). Kalium wird über die Nahrung aufgenommen und im gesamten Gastrointestinaltrakt absorbiert (WARD 1966). Die Ausscheidung erfolgt zum größten Teil über die Nieren (ca. 75 %), bei laktierenden Kühen auch über die Milch (ca.12 %) und letztlich über die Fäzes (WARD 1966; YOUN u. MCDONOUGH 2009). Die Regulation dieser Ausscheidung wird strikt reguliert: bei kaliumreicher Fütterung müsste der Kaliumgehalt im Blut durch die Kaliumaufnahme sonst stark erhöht sein. Allerdings schwankt die Blutkaliumkonzentration nur sehr gering, da das mit der Nahrung aufgenommene Kalium Insulin-vermittelt sehr schnell in die Leber- und Muskelzellen transportiert wird (YOUN u. MCDONOUGH 2009). Gleichzeitig erhöht die Niere die
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31
Ausscheidung. Später entlässt die Muskelzelle das Kalium wieder in den Extrazellulärraum und es wird weiter über die Niere ausgeschieden (YOUN u.
MCDONOUGH 2009). Im Hungerzustand kann die Niere die Kaliumausscheidung nahezu vollständig einstellen, indem sie die Reabsorption steigert und die Exkretion vermindert (WEINER u. WINGO 1997). Bei wechselndem Kaliumangebot über die Nahrung übernimmt die Muskulatur eine Art Pufferwirkung (YOUN u. MCDONOUGH 2009). Diese sehr fein regulierte Abstimmung wird wahrscheinlich über zwei Kontrollmechanismen reguliert. Zum einen scheint ein „Feedback“–Mechanismus zu bestehen: dieser erhöht die Kaliumausscheidung über die Niere, sobald erhöhte Konzentrationen im Extrazellulärraum wahrgenommen werden. Wesentlich bei dieser Regulation ist das hormonell wirksame Mineralcorticoid Aldosteron. Es führt bei erhöhten Kaliumaufnahmen in der Niere zu einer erhöhten Kaliumsekretion in den Zellen im kortikalen Sammelrohr (GIEBISCH et al. 2003). Zum anderen scheint eine
„Feedforward“-Kontrolle Einfluss zu nehmen: So könnte schon im Gastrointestinaltrakt ein Sensor die Kaliumaufnahme registrieren und entsprechend die Niere zur Kaliumexkretion anregen und zwar über das Niveau der Kaliumaufnahme hinaus (YOUN u. MCDONOUGH 2009).
Soweit das Tier an hohe Kaliumdosen adaptiert ist, werden diese über die genannten Regulationsmechansimen kontrolliert. Allerdings kann eine sehr hohe orale Gabe wie eine intravenöse Applikation von Kalium toxische Wirkung entfalten (WARD 1966).
Je nach individueller Adaptation kann für das eine Tier eine orale Gabe von 238g Kalium schon tödlich sein, wobei ein anderes Tier eine orale Gabe von 400g ohne klinische Symptomatik übersteht (WARD 1966). Von Irritationen über vermehrtes Urinieren bis hin zum Herzversagen reicht die Toxizität abhängig von der Höhe der Kaliumzufuhr und der Regulationsfähigkeit des Organismus (WARD 1966). Auch das klinische Bild der Weidetetanie kann auf einer erhöhten Kaliumaufnahme basieren:
Wenn die Rinder im Frühjahr aus der Winter- und Stallhaltung, mit überwiegender Heu- oder Silagefütterung, auf kaliumreiche Wiesen kommen, wird mit der erhöhten Kaliumaufnahme weniger Magnesium im Pansen absorbiert (WARD 1966).
Übererregte Neuronen führen in der Folge zu tetanischen Krämpfen.
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32
Eine zu niedrige Kaliumkonzentration in der Diät tritt bei der Wiederkäuerfütterung so gut wie nie auf (WARD 1966). Hypokaliämien können aber trotzdem durch Veränderungen der externen oder internen Kaliumbalance entstehen (SWEENEY 1999). Tiere, die aufgrund anderer Erkrankungen eine deutlich verminderte Futteraufnahme zeigen, Passagestörungen im Gastrointestinaltrakt aufweisen, an Diarrhoe leiden oder durch die einsetzende Laktation vermehrt Kalium in die Milch abgeben, können das klinische Bild der Hypokaliämie entwickeln (SATTLER et al.
1998; WARD 1966). Klinische Anzeichen sind eine schlaffe Muskulatur, wodurch die Tiere nicht mehr in der Lage sind den Kopf anzuheben, allgemeine Schwäche, Pansenhypomotilität bis Atonie, veränderte Beschaffenheit der Fäzes, Appetitlosigkeit, Tachykardien bzw. kardiale Arrhythmien, metabolische Alkalose und Hyperglykämie (SATTLER et al. 1998; STOBER 2006; SWEENEY 1999). In einem Fütterungsversuch mit laktierenden Kühen konnten PRADHAN und HEMKEN (1968) bei kaliumarmer Fütterung niedrige Blutplasma- und Milchkaliumkonzentrationen sowie einen erhöhten Hämatokrit nachweisen. In der Milch gab es eine inverse Beziehung zwischen Kalium und Natrium: je weniger Kalium in der Milch war, umso mehr Natrium wurde nachgewiesen. Die Autoren interpretierten dies als weitere Regulation des Tieres um höhere Kaliumgehalte im Gewebe zu bewahren (PRADHAN u. HEMKEN 1968).
Das Membranpotential von Zellen ist ein Kalium-Gleichgewichtspotential. Durch den Ausstrom des Kaliums aus der Zelle bei gleichzeitig geringer Anionenpermeabilität der Zellmembran, verliert das Zellinnere in der Summe Kationen, was zu einem negativen Membranpotential im Zellinnern führt (SCHRÖDER u. DIENER 2010).
In in vitro Versuchen konnte TÜRCK (2009) durch eine Erhöhung der Kaliumkonzentration im Puffer die Kontraktilität der glatten Labmagenmuskulatur steigern. KATO et al. (2007) machten ähnliche Beobachtungen am Rektum von Kaninchen: Die Stimulation durch erhöhte Kaliumkonzentrationen im Puffer führte zu einem Anstieg der Kontraktionsamplitude und der Frequenz. Die Autoren schlossen daraus, dass glatte Muskelzellen bei hohen extrazellulären Kaliumkonzentrationen
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33
erregbarer werden, da die Zellen dann intrazellulär weniger negativ geladen sind und somit die Schwelle für die spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle schneller erreicht wird.
2.7 Hypothese
Die vorliegende Dissertation sollte Ergebnisse zur weiteren Aufklärung der Mechanismen und Pathogenese der linksseitigen LMV liefern.
Als Hypothese galt die Annahme, dass eine Verminderung der Kalziumkonzentration bzw. eine Erhöhung der BHB-Konzentration in vitro einen direkten Effekt auf die Aktivität der Slow waves und die Kontraktionen der glatten Muskulatur im Labmagen haben. Übertragen auf in vivo Verhältnisse könnten die Hypokalzämie und die Ketose gegebenenfalls als kausale Faktoren für die linksseitige LMV benannt werden.
Um diese Hypothese zu überprüfen war das Ziel dieser Arbeit die Slow waves in der glatten Muskulatur verschiedener Wiederkäuer zu charakterisieren und den Einfluss von BHB und verschiedenen Kalziumkonzentrationen auf die Aktivität der Slow waves zu testen. Auch der Einfluss von Kalium wurde überprüft. In vitro wurden damit Ketose, Hypokalzämie und Hypokaliämie, drei der vielen mit linksseitiger LMV in Zusammenhang gebrachten Faktoren, auf ihre Kausalität zur Erkrankung untersucht. Die möglichen Auswirkungen auf der Ebene des Membranpotentials sollten im Weiteren auch auf der Ebene der Kontraktionen der glatten Muskulatur erforscht werden.
Daraus ergaben sich folgende Fragestellungen:
-Wie stellen sich Slow waves in der Labmagenmuskulatur der Wiederkäuer grundsätzlich dar?
-Welchen Einfluss haben BHB, Kalzium und Kalium auf die Aktivität der Slow waves?
-Lassen sich die Ergebnisse auch auf Kontraktionsebene reproduzieren?
Material und Methoden
34
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
3.1.1 Bullen und Hammel
Das Versuchsmaterial der Labmagenmuskulatur von Hammeln und Bullen wurde im Schlachthof Hannover gewonnen. Die Betäubung der Hammel erfolgte elektrisch, die der Bullen per Bolzenschuss. Beide Tierarten wurden direkt im Anschluss durch Blutentzug getötet. Es wurden nur Tierkörper beprobt, die keine Veränderungen am Schlachtkörper und den Innereien aufwiesen.
3.1.2 Ziegen
Im Rahmen eines Fütterungsversuches an Ziegen im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover stand weiteres Versuchsmaterial zur Verfügung.
Die Ziegen waren in zwei Gruppen unterteilt: Als Kontrollgruppe dienten fünf weibliche Ziegen, die mit 7,09 g Kalzium/Tier/Tag versorgt wurden. Die zweite Gruppe wurde Kalzium-restriktiv gefüttert. Diesen fünf weiblichen Tieren wurde 1,43 g Kalzium/Tier/Tag über das Futter verabreicht. Die Fütterung des Versuchsfutters begann vier bis sechs Wochen vor der Schlachtung. Die Ziegen wurden im hiesigen Institut geschlachtet. Ihre Betäubung erfolgte durch Bolzenschuss.
Tabelle 3: Durchschnittliche tägliche Aufnahme auf einer „pro Tier“-Basis ausgehend von den Mittelwerten der gepoolten Gruppenproben. Rohfett, Rohfaser, Rohprotein, Stärke und Zucker ausgedrückt in Prozentanteilen an der Trockensubstanz der Gesamtration.
Kalzium restriktiv (MW±SEM)
Kontrolle (MW±SEM) Trockensubstanz [g] 651 ± 13 644 ± 11 Verdaul. Energie [MJ] 6,16 ± 0,09 6,13 ± 0,07 Kalzium [g] 1,43 ± 0,03 7,09 ± 0,03 Phosphor [g] 3,04 ± 0,01 3,08 ± 0,01 Magnesium [g] 1,32 ± 0,02 1,27 ± 0,01 Natrium [g] 0,61 ± 0,01 0,66 ± 0,01
Rohfett 5,0% 4,9%
Rohfaser 21,8% 21,6%
Rohprotein 15,0% 14,5%
Stärke und Zucker 23,0% 22,5%
Material und Methoden
35 3.1.3 Kühe mit Dislocatio abomasi sinistra
In Zusammenarbeit mit der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden von fünf an linksseitiger Labmagenverlagerung (LMV) erkrankten schwarz - bunten Milchkühen Proben der Labmagenwand im Corpusbereich des Labmagens entnommen.
Die Tiere wurden nach der Hannoverschen Methode von Dirksen operiert, d.h.
stehend per Laparotomie von rechts mit rechtsseitiger Omentopexie. Zur Schmerzausschaltung diente eine distale Paravertebralanästhesie, sowie eine Infiltrationsanästhesie der Schnittlinie. Als Lokalanästhetikum wurde 2 %iges Procain mit 0,25 % Epinephrin als Sperrkörper eingesetzt. Die Paravertebralanästhesie bestand aus je 15 ml Anästhetikum, das, ausgehend zwei fingerbreit ventral vom Querfortsatz des zweiten Lumbalwirbels, subkutan parallel und leicht ventral entlang des lateralen Randes der Querfortsätze in kraniale und kaudale Richtung verabreicht wurde. Zusätzlich wurden 5-10 ml als Depot im lateralen Drittel unter die Querfortsätze des ersten bis dritten Lumbalwirbels verbracht. Zur Infiltrationsanästhesie der Schnittlinie wurde ausgehend von der Mitte der geplanten Schnittlinie 15 ml Anästhetikum subkutan gleichmäßig in dorsale und ventrale Richtung der Schnittlinie verteilt. Zusätzlich wurde auf gleichem Wege ein intramuskuläres Depot von 5-10 ml gesetzt. Auch die Omentopexiestelle wurde subkutan wie auch intramuskulär mittels 10 ml 2 %igem Procain mit Sperrkörper anästhesiert.
Die Schnittführung erfolgte auf der rechten Seite des stehenden Tieres in der Flanke von kaudodorsal nach kranioventral. Nach der eingehenden Bauchhöhlenexploration wurde die Labmagenkuppe an höchster kraniodorsaler Stelle mit einer Kanüle punktiert, die über einen Schlauch das angesammelte Gas aus dem Labmagen entließ. Zur Repositionierung des Labmagens wurde nun das große Netz aus der Wundöffnung gezogen, so dass man letztlich den Pylorus erfassen konnte. Zur Gewinnung des Versuchsmaterials wurden der Pylorus und der angrenzende Corpusbereich des Labmagens möglichst weit vorgelagert und per Fasszange fixiert.
Mit Hilfe eines Skalpells wurde ein 3 mal 2 cm großes Stück der kompletten
Material und Methoden
36
Labmagenwand herausgeschnitten und sofort in gekühlte Krebs-Henseleit-Lösung (KH-Lösung) verbracht. Die Labmagenwand wurde umgehend vernäht. Im großen Netz nahe des Pylorus wurde nun eine Perlonscheibe per Kunststofffaden verankert und später mit einem subkutan versenkten Perlonknopf verknotet. Schlussendlich wurde die Bauchwand wieder verschlossen.
Bei drei der fünf Tiere lag zum Zeitpunkt der OP keine Verlagerung des Labmagens mehr vor, da diese Tiere kurz zuvor auf dem Klauenwagen behandelt worden waren und es durch das seitliche Ablegen der Tiere höchstwahrscheinlich zu einer Rückpositionierung des Labmagens gekommen war. Nach der Behandlung auf dem Klauenwagen dauerte es etwa eine Stunde bis zum OP-Beginn. Bei zwei Tieren lagen Gesamtkalziumwerte im Blut vom Tag der Operation vor: 1,95 mmol/l und 2,16 mmol/l bei einem Referenzbereich von 2,1-2,8 mmol/l (Tab. 2).
3.2 Probenentnahme
Die Probenentnahme erfolgte bei den Hammeln ca. 20 Minuten und bei den Bullen ca. 30 Minuten nach der Schlachtung. Die im Institut geschlachteten Ziegen konnten schon 10 Minuten nach Todeseintritt beprobt werden. Am Beginn der Magenpumpe im Bereich des Corpus des Labmagens wurde ein 5 mal 5 cm großes Stück Labmagenwand herausgeschnitten und sofort in gekühlter (ca. 6 °C) KH-Lösung gespült und transportiert. Bei den Kühen mit linksseitiger Labmagenverlagerung wurde ebenfalls der Corpusbereich genutzt, allerdings in direkter Nachbarschaft zur Pars pylorica, da eine weitere Vorlagerung des Labmagens nicht möglich war.
3.2.1 Präparation der Muskulatur des Labmagens
Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme präpariert. Dazu wurde die Labmagenwand mit der mukosalen Seite nach oben mittels Präpariernadeln in eine mit begaster KH-Lösung befüllte und mit Sylgard beschichtete Petrischale
Material und Methoden
37
aufgespannt. Mit Hilfe einer Pinzette und einer feinen Präparierschere wurden Mukosa und Submukosa entfernt, so dass nun die zirkuläre Muskelschicht komplett frei lag ohne von der Längsmuskulatur getrennt zu sein. Auch der serosale Überzug wurde nicht entfernt. Aus der Mitte des Präparates wurde nun ein 1 mal 1 cm großes Stück Muskulatur herausgeschnitten und mit der zirkulären Muskelschicht nach oben in einer kleinen Kammer, die ebenfalls mit Sylgard beschichtet war, mit Präpariernadeln zur Mikroelektrodenmessung festgesteckt. Das verbleibende Material wurde über Nacht bei 6°C in KH-Lösung gelagert und ggf. am folgenden Tag noch einmal im Versuch verwendet.
3.3 Pufferlösungen
3.3.1 Krebs-Henseleit-Lösung hypokalzämisch
mmol/l g/l
NaCl 113,6 6,6388
KCl 5,4 0,4026
CaCl2 x 2 H2O 1,2 0,1764
MgCl2 x 6 H2O 1,2 0,244
HCl (1n) 0,2 0,2 ml
NaH2PO4 x H2O 0,6 0,0828
Na2HPO4 x 2 H2O 2,4 0,4272
NaHCO3 21,2 1,7642
Glucose 10 1,802
Mannit 3,6
Tabelle 4: Zusammensetzung der hypokalzämischen KH-Lösung; Lösungsmittel: Aqua dest.
Der pH-Wert dieser hypokalzämischen KH-Lösung betrug:
-begast bei Raumtemperatur: 7,35 -begast, gekühlt (6°C): 7,3
Der Gehalt an ionisiertem Ca2+ betrug: 0,91 mmol/l
Material und Methoden
38 3.3.2 Krebs-Henseleit-Lösung normokalzämisch
Hier nur die veränderten Zugabemengen, sonst wie Tabelle 4:
NaCl: 112,4 mmol/l 6,5687 g/l CaCl2 2,4 mmol/l 0,3528 g/l
Der pH-Wert dieser normokalzämischen KH-Lösung betrug:
-begast bei Raumtempertaur: 7,35 -begast, gekühlt (6°C): 7,3
Der Gehalt an ionisiertem Ca2+ betrug: 1,71 mmol/l
3.3.3 Krebs-Henseleit-Lösung mit 2 mmol/l KCl
Hier nur die veränderten Zugabemengen, sonst wie Tabelle 4:
KCl 2 mmol 0,1491 g/l
NaCl wurde nicht ausgeglichen, da KCl im Versuch wieder supplementiert wurde.
3.3.4 Stammlösungen
Nifedipin-Stammlösung: 10 mmol/l Nifedipin gelöst in DMSO
Barium-Stammlösung: 1 mol/l Bariumchlorid-Dihydrat gelöst in Aqua dest.
BHB-Stammlösung: 1 mol/l DL-β-Hydroxybutyrat gelöst in Aqua dest.
Kalzium-Stammlösung: 287,8 mmol/l Kalziumchlorid-Dihydrat gelöst in Aqua dest.
Natriumchlorid-Stammlösung: 1 mmol/l Natriumchlorid gelöst in Aqua dest.
Kaliumchlorid-Stammlösung: 250 mmol/l Kaliumchlorid gelöst in Aqua dest.
Material und Methoden
39 Herkunft der Chemikalien:
Alle Inhaltsstoffe der KH-Lösungen stammen von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland, exklusive des Mannitols (Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland). Das Bariumchlorid kommt von der Riedel de Haen AG, Seelze-Hannover. Das Nifedipine wie das BHB entstammen der Produktion von Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland.
3.4 Messung des Membranpotentials mittels Mikroelektroden
3.4.1 Herstellung der Mikroelektroden
Die Mikroelektroden wurden aus Glaskapillaren (GB 150F-8P mit Filament) der Firma Science Products GmbH, Hofheim mit Hilfe des Needle Pipette Pullers, Model 750, Kopf TM, Bachofer Laboratoriumsgeräte, eigens hergestellt. Die Befüllung mit 0,5 M KCl-Lösung erfolgte in einem Exsikator, in dem mittels Wasserstrahlpumpe ein Unterdruck erzeugt wurde, der die KCl-Lösung in die Glaselektroden sog. Nur Mikroelektroden, die einen Widerstand zwischen 50 und 80 Ω aufwiesen, wurden zur Messung verwendet.
3.4.2 Versuchsaufbau
Die Kammer mit dem Präparat der Labmagenwand wurde mittels Schrauben auf einem höhenverstellbaren Stativ befestigt (Kammer Eigenbau des Physiologischen Instituts). Hier erfolgte ein ständiger Pufferwechsel (ca. 2 ml pro Minute) über die mit 95% CO₂ und 5% O₂ begasten Puffervorratsgefäße. Der Abfluss wurde über einen Papierdocht mit Hilfe der Schwerkraft gewährleistet (Abb. 2). Das Volumen der Kammer betrug ca. 2 ml.
