Vergleich unterschiedlicher Aufreinigungsmethoden equiner Monozyten

5.1.1 Adhärenz equiner Monozyten als Aufreinigungsmethode

Eine häufig verwendete Methode der Monozytenaufreinigung ist die selektive Anreicherung monozytoider Zellen über Plastikadhärenz. HAMMOND et al. (1999) wendeten sie an, um equine Monozyten aus Vollblut zu gewinnen. Als Ausbeute werden 2 x 10⁶ bis 8 x 10⁶ Zellen pro 100 ml Blut angegeben (2-8%). Zur Reinheit der Zellen sind keine Daten gezeigt.

Prozentuale Angaben zur Zellausbeute beziehen sich im Folgenden jeweils auf die absolute Zahl Monozyten, die gewonnen werden kann, wenn mononukleäre Zellen (MNC) über Lymphozytenseparationsmedium® separiert werden. Innerhalb dieser Dissertation wurden mit dieser Methode aus 10 ml Vollblut ca. 10 x 10⁶ MNC mit einem relativen Anteil von 10%

(also 1 x 10⁶) monozytoider Zellen gewonnen. Eine 100%ige Ausbeute an Monozyten entspräche demnach einer Monozytenzahl von 1 x 10⁶ aus 10 ml Vollblut. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass nur die Hälfte der eingesetzten Monozyten nach 2h Inkubationsdauer an der Plastikzelkulturflasche adhärent war. Die andere Hälfte der monozytoiden Zellen wurde durch den ersten Separationsschritt mit den fluiden (nicht-adhärenten) Zellen zusammen entfernt. Den größten Anteil der adhärenten Zellen machte dennoch die lymphoide Fraktion aus. Mit steigender Serumkonzentration konnte zwar die Adhärenz der kontaminierenden Lymphozyten selektiv reduziert werden, die beste erzielte Monozytenreinheit lag jedoch bei nur 30% der MNC (4.1.1.1). Diese Ergebnisse zeigen, dass

equine Lymphozyten ebenso wie Monozyten in den ersten Stunden der Inkubation stark an Plastikzellkulturflaschen adhärieren, die Adhäsion dieser Zellen jedoch von der zugesetzten Menge Serum abhängt. Über mehrere Adhäsionspassagen konnte MAUEL (2002) zwar die Reinheit equiner Monozyten erhöhen, gab als Ausbeute jedoch lediglich 1 – 5 x 10⁶ Zellen aus 500 ml Vollblut an. Unter den oben genannten Bedingungen würde dies einer Ausbeute von 2-10 % der Monozyten und somit einer erheblichen Selektion entsprechen. Dies deckt sich mit den in dieser Arbeit erhobenen Befunden zu den Zellverlusten durch Adhärenzaufreinigung. Für die Anreicherung equiner Monozyten ist demnach eine Separation über das Adhärenzverhalten nicht ausreichend effektiv, sodass nach alternativen Methoden gesucht werden musste.

5.1.2 Affinitätschromatographische Separation equiner Monozyten

Nachdem ROHWER (2004) zeigen konnte, dass ca. 10% equiner Monozyten in der Membranimmunfluoreszenz IgE positiv sind, sollte untersucht werden, ob sich mit Hilfe eines anti-equinen-IgE mAk Monozyten im MACS anreichern lassen. Mit 65- 70% monozytoidem Anteil der MNC erwies sich diese positive Selektion als eine äußerst effektive Form der Anreicherung von Monozyten. Mit nur 1,6 % Ausbeute an Monozyten lag sie jedoch weit unter der erhofften Monozytenanzahl. Zudem findet bei dieser Methode eine Selektion von Monozyten-Subtypen statt, deren Funktion und Eigenschaften noch weitgehend unbekannt sind. In der humanmedizinischen Forschung konnte gezeigt werden, dass Fcε-Rezeptor-I tragende dendritische Zellen in engem Zusammenhang mit Atopien und IgE Serumspiegeln stehen (ALLAM et al. 2003; FOSTER et al. 2003; HOLLOWAY et al. 2001; KATOH et al.

2000). Welche Rolle dieser Subtyp beim Pferd spielt, ist noch nicht bekannt und Gegenstand der aktuellen Forschung.

Der LPS-Rezeptor CD 14 wird von murinen und humanen Monozyten stark exprimiert, weshalb er häufig für die affinitätschromatographische Aufreinigung dieser Zellpopulation verwendet wird. Ein spezifischer anti-CD 14-Antikörper stand für das Pferd leider nicht zur Verfügung. Kreuzreaktivitäten mit anti-human-CD 14 mAk sind für den Klon „big 10“ jedoch beschrieben (STEINBACH et al. 2005). Für die beiden in dieser Arbeit verwendeten anti-humanen-CD-14-mAk (3.2.4.1.1) konnten im direkten Vergleich humaner MNC mit equinen MNC keine Kreuzreaktivitäten festgestellt werden. Wie man in Abb. 9 erkennen kann, ist bei humanen Monozyten ein deutlich von der Konjugatkontrolle abgesetzter Peak zu erkennen, während die equinen monozytoiden Zellen lediglich im Bereich der Konjugatkontrolle liegen.

Eine positive MACS Separation ist demnach mit den hier verwendeten Antikörpern nicht

MACS wurde verzichtet, da generell eine Bindung von Antikörpern zu einer nicht gewollten Selektion von Monozytensubpopulationen führt. Daneben konnten ELKORD et al. (2005) zeigen, dass DCs, welche aus über CD14 im MACS angereicherten Monozyten generiert wurden, eine erheblich geringere Menge der Zytokine IL12, TNFα und IL10 sezernieren und so als antigenpräsentierende Zelle weniger, wenn überhaupt geeignet sind. Aus diesen Gründen wurde auf eine positive Anreicherung equiner Monozyten mittels magnetic-cell-sorting (MACS) basierend auf ihrer Bindung von anti-CD14-AK verzichtet.

Eine Depletion von CD4+ und CD8+ Lymphozyten aus einer equinen MNC-Präparation, die auch Monozyten enthält, erwies sich zwar als eine Möglichkeit der relativen Anreicherung von Monozyten, jedoch ohne hinreichende Reinheit der Monozyten. Bei murinen DC konnten verschiedene DC-Subtypen als CD8 und CD4 positiv bzw. negativ identifiziert werden (SCHNORRER et al. 2006). Ob es im equinen System ähnliche Subtypen gibt, ist nicht bekannt. Unter den CD4 und CD8 positiven Zellen waren im Rahmen dieser Untersuchungen einige zu finden, die im morphologischen Bereich der Monozyten lagen (4.1.1.2.3). Demnach findet schon in diesem Schritt der Aufreinigung eine ungewollte Selektion von Monozyten statt. Eventuell würde ein Cocktail aus anti-CD3 und anti-CD21 mAk zu einer erfolgreichen Selektion führen. Für equine Zellen stehen diese Ak allerdings noch nicht zur Verfügung.

5.1.3 Dichtegradientenzentrifugation

Alle bisher beschriebenen Methoden wurden bei mononukleären Zellen (MNC) angewendet, welche zuvor über einen Dichtegradienten von den polymorphkernigen Zellen (PMN) getrennt wurden. Eine elegantere Methode wäre, die Monozyten schon in diesem ersten Schritt von den Lymphozyten zu trennen, was sich aufgrund der sehr ähnlichen Dichte beider Zellpopulationen als schwierig gestaltet. DE ALMEIDA et al. (2000) konnten aber über einen leicht hypertonen, 50%igen Percollgradienten humane Monozyten in beeindruckender Reinheit und Ausbeute gewinnen. Der zugrunde liegende Mechanismus soll dabei sein, dass Lymphozyten empfindlicher auf hypertonen Stress reagieren als Monozyten und aufgrund der osmotischen Verhältnisse Wasser aus den Zellen austritt. Dies würde die Dichte der Lymphozyten geringgradig erhöhen und so den Dichteunterschied zwischen Lymphozyten und Monozyten steigern. Eine Auftrennung könnte so ermöglicht werden.

Die Methode erwies sich als auf das Pferd übertragbar und lieferte Monozytenreinheiten zwischen 50 und 90% mit einer Ausbeute von 1,4 x 10⁶ Monozyten aus 20ml Vollblut, was 70% der Ausgangspopulation entspricht (unter der Annahme, dass über Lymphozytenseparationsmedium aus 20 ml Vollblut 20 x 10⁶ MNC gewonnen werden

können mit einem Monozytenanteil von ca. 10% und somit 2 x 10⁶ Monozyten aus 20 ml Vollblut einer 100%igen Ausbeute entsprechen würde). Wurde die Dichte des Gradienten geringgradig erhöht oder erniedrigt, zeigten sich jedoch in der erzielten Reinheit keine wesentlichen Unterschiede (4.1.1.3). Eine Reduktion der Dichte führte lediglich zu einer geringeren Ausbeute. Eine Erhöhung der Osmolalität des Gradienten führte bei dem 1,0638 g/ml dichten Gradienten zu einer Erhöhung der Ausbeute an MNC ohne auf die Reinheit der Monozyten einen Einfluss auszuüben. Weshalb die höhere Osmolalität bei gleicher Reinheit zu mehr Monozytenausbeute führt ist jedoch nicht mit dem oben beschriebenen Mechanismus zu erklären. Man würde erwarten bei gleicher Dichte und geringerer Hypertonie mehr MNC zu gewinnen, die allerdings dann einen geringeren Monozytenanteil aufweisen. Diese Beobachtung zeigte, dass neben dem Gradienten noch andere Einflüsse auf den Separationserfolg einwirken, die es näher zu bestimmen galt. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, dass neben dem verwendeten Antikoagulanz, der Verarbeitungszeitpunkt des Blutes nach Blutentnahme einen erheblichen Einfluss auf die Reinheit der Monozyten ausübte. Welche Faktoren für die z.T. erheblichen intraindividuellen Schwankungen im Separationserfolg verantwortlich waren, konnte nicht abschließend geklärt werden. Mögliche Ursachen könnten jedoch in unterschiedlichen Gerinnungsstadien des Tieres oder der jahreszeitlich bedingten unterschiedlichen Temperatur bei der Verarbeitung bzw. Gewinnung des Blutes liegen. Nach DE ALMEIDA et al. (2000) sollte die Verarbeitung des Blutes möglichst bei Temperaturen von 25 – 35°C erfolgen, da Kälte eine Aggregation der Thrombozyten an die Monozyten fördert und den Separationserfolg negativ beeinflusst.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Anreicherung equiner Monozyten über einen 50%igen, leicht hypertonen (340 ± 10 mOsm/kg) Percollgradienten die besten Ergebnisse erbrachte, was hohe Reinheit und Ausbeute bei nicht erkennbarer Vorselektion der Monozyten betraf.