Quantifizierung der Zahl vitaler Zellpopulationen mit Hilfe des

Während der Kultivierung von Zellen, kommt es zu Variationen in der resultierenden Zahl.

Sie wird bedingt durch Zelltod oder Proliferation als Antwort auf verschiedene Stimuli oder Noxen. Um die Zellzahl nach der Kultur zu ermitteln, die absolute Zahl vitaler Zellen zu bestimmen oder die absolute Zahl blastisch transformierter Zellen zu erhalten, wird der zu messenden Probe eine bestimmte Anzahl Partikel zugesetzt, welche sich durch zumindest einen Parameter im FACScan eindeutig charakterisieren lassen. Anhand dieser Partikel kann eine Quantifizierung der gewünschten Zellen vorgenommen werden (PECHOLD et al. 1994).

In diesem Fall wurden bovine mononukleäre Zellen (Referenzzellen, (3.3.4.1)) zugesetzt, deren genaue Zellzahl bekannt war. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl der zu untersuchenden Zellen ermittelt werden.

Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (3.2.4.1.1) und anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (3.2.4.1.2). Eine längere Lagerung wurde durch Fixation mittels Paraformaldehyd (3.2.3) ermöglicht. Die toten und fixierten Referenzzellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (3.3.3.1) in der FL-1 und in der FL-3.

3.3.4.1 Herstellung von Referenzzellen

Bei den hier verwendetetn Referenzzellen handelte es sich um bovine mononukleäre Zellen (MNC), welche über Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) separiert wurden. Für die Färbung wurden jeweils 2 x10⁷ Zellen in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 x g und 4°C für 5 min abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und das erhaltene Zellpellet in 100µl PBS (3.2.5.3.4) resuspendiert. Nach Zugabe des gleichen Volumens des unverdünnten mAks Bo1 (3.2.4.1.1) erfolgte eine Inkubation bei 4°C für 15 min. Zum anschließenden Waschen der Zellen wurden 5 ml MIF-Puffer (3.2.5.3.8) zugegeben und die

Zellen für 7 min bei 80 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet nun mit 100µl eines 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers (3.2.4.1.2) unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 min inkubiert. Im Anschluss erfolgte ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 ml PBS. Nach Überführung der Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (3.2.2), wurde das Röhrchen auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert. Im Anschluss erfolgte die erneute Resupension der Zellen nun in 30 ml einer 4%igen Paraformaldehyd-Lösung (3.2.3). In dieser Paraformaldehyd-Lösung wurden die Zellen zur Fixation und Konservierung für 24h unter Lichtausschluss bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen für 15 min abzentrifugiert, dekantiert und mit PBS gewaschen. Das auf diese Weise gewonnene Zellpellet wurde schließlich in einer Propidiumiodidhaltigen Trägerflüssigkeit (3.2.5.5) aufgenommen und auf 4 x 10⁵ Zellen/ ml eingestellt.

Die Herstellung der Referenzzellen erfolgte stets in größeren Mengen. Die Lagerung erfolgte unter Lichtabschluss bei 4°C.

3.3.4.2 Vorbereitung der Proben für die Messung im Durchflusszytometer

Proliferationsansätze oder Membranimmunfluoreszenz-Ansätze erfolgten in 96-Loch Rundbodenmikrotiterplatten (3.2.2), die nach der jeweiligen Inkubationszeit auf Eis gelagert und gerüttelt wurden, um adhärente Zellen zu lösen. Um eine gute Durchmischung und zusätzliche Ablösung zu erzielen, wurden die Zellen mittels wiederholten Auf- und Abpipettierens geerntet und in 5 ml Röhrchen für die Durchflusszytometrie (3.2.2) überführt.

Die Platten wurden nach der Ernte auf verbliebene Zellen auflichtmikroskopisch untersucht.

Unmittelbar vor der Messung im Durchflusszytometer wurde den Proben 100µl einer PI-haltigen (4µg/ml) Trägerflüssigkeit (3.2.5.5.2) und je nach Versuchsaufbau zusätzlich 50µl Referenzzellen (3.3.4.1) zugegeben.

3.3.4.3 Ermittlung der Zahl vitaler Zellen

Je nach Anzahl der Populationen wurden 10.000 bis 20.000 Zellen durchflusszytometrisch gemessen. Da die Morphologie der Referenzzellen durch die Fixation erhalten blieb, die Zellen mit FITC markiert und zudem tot waren, konnten sie als rotfluoreszierende (FL-3) und grünfluoreszierende (FL-1) MNC leicht charakterisiert und von den Kulturzellen unterschieden werden. Durch setzten verschiedener Fenster (Gates) wurden Einzelpopulationen erfasst und gezielt in weiteren Diagrammen angezeigt. Über die Analyse mit Hilfe eines Quadranten, konnten die jeweils erzielten Messereignisse mit definierten

gemessenen Referenzzellen mit der Zahl der gewünschten Zellpopulation ins Verhältnis, konnte unter Kenntnis der eingesetzten Zahl Referenzzellen die absolute Zahl der gewünschten Kulturzellpopulation bestimmt werden. Es gilt folgende Formel zur Berechnung der absoluten Zahl vitaler Zellen:

3.3.5 Prinzip der durchflusszytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen

Mononukleäre Zellen können durch Zusatz verschiedener Substanzen oder Zellen in vitro zur Proliferation angeregt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der proliferationsfördernde Effekt von rekombinanten equinem Interleukin 4 (req.IL4) (3.2.6.1) und 2-Mercaptoethanol (ME) (3.2.3), sowie die Stimulationskapazität verschiedener Zellpopulationen untersucht werden. Genutzt wurde dabei die morphologische Veränderung, welche aktivierte und sich teilende Lymphozyten (Blasten) erfahren. Die Zellen nehmen vor der Teilung an Größe zu (steigender FSC) und verändern durch ein verschobenes Kern/Plasma-Verhältnis auch ihre Komplexität (steigender SSC). Die blastische Transformation der Zellen zeigt sich im Durchflusszytometer in einer Verschiebung nach rechts, welchen nicht aktivierte Zellen nicht zeigen. Durch setzten eines Quadranten wurde sowohl das Verhältnis transformierter Zellen (Blasten) zu nicht transformierten Zyten ermittelt, als auch die Zahl der jeweils gemessenen Ereignisse bestimmt. Mit Hilfe der Referenzzellmethode (3.3.4) wurde dann die absolute Zahl generierter Lymphoblasten berechnet.

Anzahl Kulturzellen =

gemessene Ereignisse Referenzzellen

gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzzellen

Forward Scatter (FSC) Side Scatter (SSC)

MNC mit eq.IL 4 MNC der Mediumkontrolle

Abb. 4 Durchflusszytometrische Analyse der Blastogenese

Separierte mononukleäre Zellen (3.3.1.3) eines Pferdes wurden mit LAG vorstimuliert (3.3.6.1) und anschließend 9 Tage in vitro ohne Stimulus (linke Abbildung) oder mit rekombinantem equinen Interleukin 4 (req.IL4) (rechte Abbildung) inkubiert (3.3.6.1). Dargestellt sind korrelierte Punktediagramme (FSC vs. SSC). Blastisch transformierte Zellen lassen sich über die Zunahme der Zellgröße (höherer FSC-Wert) und der Komplexität (höherer SSC-Wert) von kleinen zytoiden Zellen unterscheiden.

3.3.6 Zellkultivierung in vitro

Zellkulturen wurden im Rahmen dieser Arbeit entweder zur Messung der Proliferation von Lymphozyten verwendet, oder dienten der Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes.

3.3.6.1 Kultivierung von Lymphozyten in vitro (Proliferationstest)

Um die biologische Aktivität des rekombinanten equinen IL4 zu untersuchen, wurden mit Leukoagglutinin (LAG) (3.2.3) vorstimulierte Lymphozyten des Pferdes mit verschiedenen Verdünnungsstufen (Endverdünnung 1:1; 1:10 und 1:100) des Überstandes der req.IL4 (3.2.6.1) produzierenden Zelllinie inkubiert. Nach 3 bis 9 Tagen Kultur wurden die Zellen dann auf ihre Vitalität und den Anteil blastisch transformierter Zellen untersucht.

Die Vorstimulation der Lymphozyten erfolgte, indem 20 x 10⁶ frisch separierte MNC (3.3.1.3) in einer 75 ml Zellkulturflasche (3.2.2) mit 20 ml Zellkulturmedium (komplettes DMEM (3.2.5.2)) und 1 µg/ml LAG (Leukoagglutinin, 3.2.3) über 4 Tage inkubiert wurden

(37°C und 5% CO2). An Tag 4 wurden die Zellen geerntet, indem die Zellkulturflasche geschüttelt und das Medium mit den Zellen in ein 50 ml Röhrchen überführt wurde. Das Röhrchen wurde sodann mit Medium (s.o.) aufgefüllt und die Zellen zwei mal bei 100 x g und RT für 10 min abzentrifugiert.

Für den Proliferationsansatz wurde die Zellsuspension auf 12 x 10⁶ Zellen/ ml mit kompletten DMEM (3.2.5.2) eingestellt. Mit 100µl dieser Zellsuspension wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt, um den Ausgangszustand der MNC-Morphologie festzuhalten.

Für die Kultivierung equiner MNC zur Messung der Proliferationsinduktion wurden ausschließlich Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96-Vertiefungen gewählt. Je Stimulations-ansatz wurden 6 x 10⁴ MNC ausplattiert (je 50µl Zellsuspension). Bei jedem Ansatz wurden zunächst 50µl komplettes DMEM vorgelegt, anschließend 100 µl der zu testenden Substanz (vorbereitete Verdünnungen von req.IL4) zugegeben und schließlich jeweils 50µl der Zellsuspension zugesetzt. In den Kontrollansätzen wurde anstelle der 100 µl Stimulanzlösung die gleiche Menge Medium oder irrelevantes Zytokin zugegeben. Das Endvolumen betrug somit jeweils 200µl. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten.

Die Mikrotiterplatten wurden im Anschluss in feuchten Inkubationskammern (3.2.2), deren Boden mit gesättigter Kupfersulfatlösung (3.2.3) bedeckt wurde, bei 37°C und 5% CO2 in Luft für bis zu 9 Tage inkubiert. Die Kupersulfatlösung in der Inkubationskammer diente dazu, ein Austrocknen der Kulturansätze zu vermeiden, sowie Pilzwachstum zu unterbinden.

3.3.6.2 Generation dendritischer Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes Um dendritische Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes zu generieren, wurden Monozyten durch unterschiedliche Verfahren gewonnen und in Kultur gebracht. Abhängig von der jeweiligen Methode der Gewinnung variierte das Kulturprotokoll hinsichtlich Dauer der Inkubation und Mediumwechsel. Alle anderen Bedingungen und Zusätze blieben konstant.

Da sich in den über Lymphozytenseparationsmedium® separierten MNC (3.3.1.3) mindestens 10% Monozyten befanden, wurde zunächst versucht, diese Zellen zur Generation von dendritischen Zellen heranzuziehen. Dazu wurden MNC aus heparinisiertem Vollblut (3.3.1.1) gewonnen und durchflusszytometrisch (3.3.3) sowie mikroskopisch die Zellmorphologie vor der Kultivierung untersucht. Schließlich wurden je 20 x 10 ⁶ MNC in 20 ml Medium (EARLES MEM (3.2.5.1)) unter Zusatz von 3% autologem Serum (3.3.1.2),

huGM-CSF (1000 U/ 10ml) (3.2.6.2) und reqIL4 (3.2.6.1) (Endverdünnung 1:4) inkubiert (37°C und 5% CO2 in Luft). Zur Kontrolle diente ein Zellkulturansatz, dem kein req.IL 4 zugegeben wurde.

Zellen, welche über IgE angereichert wurden (3.3.1.5.2), wurden zu je 5 x 10⁶ Zellen in 5 ml Medium (s.o) in 6-well-Zellkulturplatten (3.2.2) ausgesät. Die Kulturen erhielten ebenfalls huGM-CSF, req.IL4 und autologes Serum (s.o). Nach 3 h wurde hier jedoch die Hälfte des Mediums entnommen und durch frisches ersetzt, um Mediatoren zu entfernen, welche durch Bindung des Antikörpers und daraus folgender Zellaktivierung von den Zellen sezerniert wurden. Auf diese Weise sollten einheitlichere Kulturbedingungen geschaffen werden. Die Ernte dieser Zellen erfolgte bereits nach 3 Tagen Kultur.

Von den über hypertonen Percoll angereicherten Monozyten (3.3.1.6), wurden ebenfalls je 5 x 10⁶ Zellen in 5ml Medium in 6-well-Zellkulturplatten (3.2.2) inkubiert. Es wurden jeweils Kulturen angesetzt, denen huGM-CSF (1000U/ 10ml) alleine und in Kombination mit req.IL4 (1:4 endverdünnt) zugegeben wurde. Alle Kulturen erhielten jedoch 3 % autologes Serum (3.3.1.2). An Tag 3 erfolgte ein Mediumwechsel, bzw. bei der Hälfte der Ansätze die Ernte und Analyse der Zellen.

An Tag 3 wurde mittels einer weitlumigen Pipette die Hälfte des Mediums vorsichtig abgesaugt und durch frisches Medium (supplementiert mit autologem Serum, huGM-CSF und req.IL4, Konzentrationen wie oben) ersetzt, um Stoffelwechselprodukte der Zellen zu entfernen und neue Nährstoffe bzw. Zytokine bereitzustellen. Bei den Zellen, die über IgE im MACS gewonnen wurden erfolgte an Tag 3 die Ernte, ebenso bei der Hälfte der Monozyten, welche über hypertones Percoll (3.2.5.3.2) angereichert wurden. Wurden dendritische Zellen für eine gemischte Leukozytenreaktion generiert, wurde bei einigen Kulturansätzen an Tag 6 LPS (1µg/ml) (3.2.3), oder zum Pulsen der DC unterschiedliche Antigene zugesetzt (3.3.12).

Nach 7 Tagen Kultur wurden schließlich alle Zellen geerntet.

Für die Ernte der Zellen wurden zunächst durch schwenken und schütteln der Zellkulturflasche bzw. der Kulturplatte die meisten der Zellen gelöst und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Durch zweimaliges Spülen mit kaltem PBS und Abschaben der Zellen mit Hilfe eines Zellschabers wurden residuale, adhärente Zellen gelöst und ebenfalls in das 50 ml Röhrchen gegeben. Durch Zentrifugation mit 100 x g für 10 min bei RT konnte ein Zellpellet gewonnen werden, welches für weitere Arbeiten zur Verfügung stand. Wurden die Zellen für weitere Inkubationsansätze benötigt, erfolgte ein weiterer Waschschritt mit Medium (s.o.), um Reste der Zytokine zu entfernen.

3.3.7 Lichtmikroskopische Untersuchung in vitro generierter dendritischer