4 Ergebnisse
4.1 Methodische Vorarbeiten
4.1.1 Aufreinigung equiner Monozyten aus Vollblut
Da für das Pferd noch keine ausreichend effektiven Methoden der Monozytenaufreinigung etabliert sind, wurden verschiedene Verfahren der Separation in Vorarbeiten erprobt. Ziel war es, ein Verfahren zur Separation equiner Monozyten zu finden, welches eine hohe Ausbeute an Monozyten mit möglichst hoher Reinheit, geringer Voraktivierung und ohne Selektion von Monozytensubpopulationen durch die Separationsmethode erlaubt.
4.1.1.1 Anreicherung equiner Monozyten über Plastikadhärenz
Monozyten sollen, im Gegensatz zu Lymphozyten, die Fähigkeit besitzen, unter geeigneten Bedingungen besonders effizient an Plastik zu adhärieren (FELZMANN et al. 2003;
OBUNIKE et al. 1997). Um zu überprüfen, ob sich equine Blutmonozyten nach vorangegangener Separation der MNC (mononukleäre Zellen) über Lymphozyten-separationsmedium® (3.3.1.3) durch selektive Adhärenz anreichern lassen, wurden MNC (je 20 x 106) von 4 Pferden (3.2.7) in Earles-Medium (3.2.5.1) mit unterschiedlichen Konzentrationen an autologem Serum (3.3.1.2) für 1 bis 3 h in Plastikzellkulturflaschen (3.2.2) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde der Kulturüberstand samt nicht-adhärenter (= fluider) Zellen abgegossen und die adhärenten Zellen durch zweimaliges Spülen mit 30°C bis 37°C warmem PBS (3.2.5.3.4) von restlichen nicht-adhärenten Zellen befreit.
Abschließend wurden die adhärenten Zellen in etwas Medium (3.2.5.1) mit einem Zellschaber (3.2.2) vorsichtig abgelöst und in ein separates Röhrchen überführt.
Die MNC Fraktionen wurden vor und nach Plastikadhärenz durchflusszytometrisch und mikroskopisch nach morphologischen Kriterien untersucht (3.3.3), um die Reinheit und Ausbeute an Monozyten zu bestimmen. Um eine Aussage über den Erfolg dieser Methode geben zu können, wurden die nicht-adhärenten Zellen (fluide Zellen) und die adhärenten Zellen auf ihre Gesamtzahl und ihren Monozytenanteil untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 dargestellt.
Abb. 6 Zellausbeute und dazugehöriger Monozytenanteil nach Adhärenzselektion.
Aus heparinisiertem Vollblut (3.3.1.1) von 4 Pferden (3.2.7) wurden mittels Dichtegradienten-zentrifugation über Lymphozytenseparationsmedium® MNC in einer Reinheit von >95% gewonnen (3.3.1.3). Jeweils 20 x106 dieser MNC pro 10 ml Earles-Medium (3.2.5.1) wurden mit 1%, 5% oder 10% autologem Serum (3.3.1.2) in 75ml Plastikzellkulturflaschen (3.2.2) für 2h bei 37°C und 5% CO2
in Luft inkubiert. Nach Adhärenzselektion (3.3.1.4) wurden die adhärenten und die fluiden (=nicht-adhärenten) Zellen gezählt (3.3.2) und der jeweilige Monozytenanteil durchflusszytometrisch (3.3.3) bestimmt. Die linke Abbildung zeigt die wiedergewonnene absolute Zellzahl (von eingesetzten 20 x106 MNC) in Abhängigkeit von der Konzentration an autologem Serum. Der dazugehörige prozentuale Anteil an Monozyten ist in dem rechten Graphen wiedergegeben, ebenso der relative Monozytenanteil an der Ausgangs-MNC-Fraktion. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte von vier Pferden mit Standardabweichung.
Durch die Überschichtung leukozytenreichen Plasmas (3.3.1.3) auf Lymphozyten-separationsmedium® ließen sich bei den vier Pferden im Mittel 216 x 106 mononukleäre Zellen aus 100 ml heparinisiertem Vollblut gewinnen. Der Anteil an Monozyten machte bei dieser Fraktion im Mittel 8,03 % (17,35 x 106) aus. Die „restlichen“ Zellen konnten im Durchflusszytometer morphologisch als Lymphozyten angesprochen werden. Granulozyten
wurden durch die hier gewählte Dichtegradientenzentrifugation fast gänzlich eliminiert (siehe Abbildung 7).
Forward Scatter (FSC) Side Scatter (SSC)
Equine MNC
Abb. 7 Zellfraktionen equiner MNC nach Dichtegradientenzentrifugation
Leukozytenreiches Plasma (3.3.1.3) wurde über Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) geschichtet und durch Dichtegradientenzentrifugation die mononukleären Zellen separiert (3.3.1.3).
Der eingefügte Quadrant gibt die prozentuale Verteilung der Zellpopulationen an. Mit 86,4% (unten links) macht die lymphoide Fraktion den größten Anteil aus, während 13,2% (unten rechts) zu den monozytoiden Zellen zählen. Aufgrund ihrer morphologischen Charakteristika wären Granulozyten in den oberen Quadranten zu erwarten (Kreis), die hier nur einen Anteil von <1% ausmachen.
Vergleicht man die Ausbeute der adhärenten Zellen, die der fluiden Zellen, sowie den jeweils dazugehörigen Monozytenanteil, so fällt auf, dass sich durch Plastikadhärenz mit Zusatz von 10% autologem Serum zwar eine relative Anreicherung der Monozyten erreichen lässt (bei 10% Serumzusatz sind im Mittel 23,87 % der MNCs Monozyten), mit den fluiden Zellen allerdings auch die Hälfte an Monozyten verloren geht. So sind im Mittel 9,1 x106 MNC nach 2h Inkubation und 10% Serum fluide, die sich zu 8,9% aus Monozyten zusammensetzen (0,81 x 106 Monozyten). Das heißt, dass trotz geringeren prozentualen Anteils an Monozyten, die Gesamtzahl dennoch fast identisch ist mit der aus der adhärenten Fraktion. Tabelle 3 verdeutlicht den Zellverlust am Beispiel der Adhärenzselektion mit 10 % autologem Serum.
Tab. 3. Monozytenverluste durch Adhärenzselektion
Zellfraktion Ausbeute [x 106] Monozytenanteil in % Monozytenanteil [x 106]
Ausgangspopulation 20,0 8,0 1,7 Adhärente Zellfraktion 3,5 23,9 0,8
Fluide Zellfraktion 9,1 8,9 0,8
Jeweils 20 x 106 equine MNC wurden separiert (3.3.1.3) und mit 10% autologem Serum (3.3.1.2) für 2h bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Anschließend wurde die adhärente Zellfraktion von den fluiden Zellen getrennt (3.3.1.4). Die Zellen wurden gezählt und der Monozytenanteil sowohl prozentual als auch absolut bestimmt (3.3.4.3). Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte von 4 Tieren.
Die beste erzielte Monozytenreinheit lag bei nur 30,5% mit einer Ausbeute von 50% aller Monozyten. Durch die fluiden Zellen gingen allerdings auch fast 50% der gesamten Monozyten verloren. Wegen geringer Ausbeute und mangelnder Reinheit wurde diese Methode der Aufreinigung nicht weiter verwendet. Zudem gehen während der Separation eine erhebliche Anzahl Zellen aus technischen Gründen verloren (Zellschaber, residuale Zellen in den Flaschen). Daneben führt eine Plastikadhärenz neben unspezifischer Aktivierung der Monozyten evtl. auch zu einer Selektion bestimmter Monozytensubpopulationen.
4.1.1.2 Affinitätschromatographische Anreicherung equiner Monozyten 4.1.1.2.1 Positive Selektion IgE-positiver Zellen
Nachdem ROHWER (2004) zeigen konnte, dass ca. 10% der Monozyten beim Pferd stark IgE binden können, sollte versucht werden, aus angereicherten MNC (3.3.1.3) über eine positive Selektion im MACS (magnetic cell sorting) (3.3.1.5.2), die Reinheit der Monozyten in der MNC-Fraktion zu erhöhen. Von drei Pferden wurde heparinisiertes Vollblut gewonnen (3.3.1.1) und die MNC-Fraktion isoliert (3.3.1.3). Anschließend wurden die Zellen mit Mäuse-IgG1-AK gegen equines IgE (3.2.4.1.1) inkubiert und schließlich mit Ratten-AK gegen Mäuse-IgG1-Microbeads (3.2.4.1.2) magnetisch umlagert.
Die Zellen, welche aufgrund des magnetischen Feldes zunächst in der Säule verblieben, wurden nach ihrer Gewinnung durch Entfernung des magnetischen Feldes durchflusszytometrisch (3.3.3) und mikroskopisch (3.3.2) untersucht. Die in Abbildung 8 gezeigten Dotplots, geben die Zellverteilung bei einem Tier vor und nach MACS-Separation wieder.
Eluat Ausgangspopulation
Forward Scatter (FSC) Side Scatter (SSC)
Abb. 8 Positive Selektion IgE positiver Zellen im MACS
MNC eines Pferdes wurden mit Mäuse-IgG1-AK gegen equines IgE (3.2.4) inkubiert und mit Ratten-AK gegen Mäuse-IgG1-MicroBeads (3.2.4) magnetisch markiert. Mit Hilfe einer Midi-Macs-Säule (3.2.2) erfolgte eine Auftrennung der Zellen in einem magnetischen Feld (3.3.1.5.2). Dargestellt sind korrelierte Punktediagramme (Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC)). Der linke Dotplot gibt die Ausgangssituation der MNC-Fraktion eines Pferdes wieder, bei der nur 9,56 % der Zellen als Monozyten angesprochen werden können. Nach der positiven Selektion über IgE (rechter Dotplot) liegen 64,48% der Zellen in der für equine Monozyten charakteristischen SSC-FSC Region.
Aus 10 x 106 MNC konnte mit dieser Methode im Mittel 0,16 x 106 MNC mit einem Anteil von 70,2 % monozytoiden Zellen gewonnen werden. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, ist die Ausbeute und Reinheit der Zellen jedoch erheblichen individuellen Schwankungen unterworfen, was auf eine unterschiedlich starke Expression des Fcε-Rezeptors bzw. seines Besatzes mit IgE schließen lässt.
Tab. 4. Ausbeute an MNC und an IgE+ Monozytenanteil nach IgE-MACS-Separation
Pferd Ausbeute aus 10 x106 MNC [x 105] Reinheit in % Monozyten
Hetja 3 70,7
Mysla 0,9 75,6
Fönn 1 64,5
Jeweils 10 x106 MNC (3.3.1.3) von 3 Pferden (3.2.7) wurden über IgE positiv in der MACS separiert (3.3.1.5.2). Die Tabelle gibt die mikroskopisch ermittelte Zellzahl (in x 105) nach der Separation, sowie den durchflusszytometrisch bestimmten relativen Monozytenanteilen der Zellpopulationen an.
Obwohl mit dieser Methode eine sehr gute relative Anreicherung von Monozyten (70,2%) erzielt werden konnte, war die Ausbeute der wiedergewonnen MNC mit 1,6% (im Mittel) der eingesetzten Zellen sehr gering. Des Weiteren zeigte sich bei Kultivierungsversuchen (vgl.
Kapitel 4.2.2.1) ein sehr hoher Aktivierungsgrad der MACS-separierten Zellen. Zudem ist die Funktion IgE+ Monozyten noch ungeklärt und Gegenstand aktueller Forschung.
4.1.1.2.2 Positive Selektion über CD14
Häufig wird für eine Anreicherung im MACS (magnetic cell sorting) CD14 als Zielstruktur auf den Monozyten verwendet (FELZMANN et al. 2003).
Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun überprüft werden, ob diese Methode auch für das Pferd anwendbar ist. Ein speziesspezifischer Anti-CD14 Antikörper steht für das Pferd noch nicht zur Verfügung. Aus diesem Grund wurde in der Membranimmunfluoreszenz (MIF) (3.3.8) zunächst geprüft, ob sich ein anti-CD14 Antikörper aus dem humanen System (3.2.4) auch für das Pferd verwenden lässt. Dazu wurden equine MNC mit anti-humanen-CD14-Antikörpern zweier verschiedener Zellklone (3.2.4.1.1) inkubiert und mittels eines an FITC gekoppelten Sekundärantikörpers (soweit erforderlich) (3.2.4) markiert. Anschließend wurden die Zellen durchflusszytometrisch auf ihre Fluoreszenzintensität (3.3.8.2) untersucht. Um die Bindungsaffinität und Spezifität für das Pferd beurteilen zu können, wurden gleichzeitig humane MNC demselben Verfahren unterzogen. Beide in dieser Arbeit verwendeten anti-CD14-AK zeigten ähnliche Bindungsmuster. In Abbildung 9 ist die Bindung einer der untersuchten anti-CD14-Antikörper im Vergleich zur Konjugatkontrolle (3.3.8) im Histogramm (3.3.8.2) dargestellt.
FL-1-Fluoreszenzintensität
Ereignisse
Mensch, Tag 0, CD 14 Pferd, Tag 0, CD 14
Abb. 9 Expression von CD14 auf humanen und equinen MNC im Vergleich
Menschliche MNC (links) und equine MNC (rechts) wurden direkt nach der Separation (3.3.1.3) in der Membranimmunfluoreszens mit monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD14 (3.2.4.1.1) auf die Expression von CD14 untersucht (3.3.8.2). Die Histogramme zeigen die Anzahl an Ereignissen gegen deren FL1-Fluoreszenzintensität. In Rot ist die Konjugatkontrolle (Sekundärantikörper mit FITC (3.2.4)), in Blau die CD14 markierten Zellen dargestellt.
Bei den menschlichen MNC konnte man in der FL1-Fluoreszenz einen deutlich von der Konjugatkontrolle abgesetzten Peak im Histogramm sehen, während sich bei den equinen MNC keine deutliche Markierung erzielen ließ.
Mit den in dieser Arbeit verwendeten Antikörpern (3.2.4.1.1) ist eine Anreicherung equiner Monozyten im MACS demnach nicht sinnvoll. Doch auch wenn diese Antikörper die gewünschte Struktur selektiv binden würden, wäre eine Anreicherung über CD14 im MACS kein optimales Verfahren um Monozyten zu gewinnen, die später zu potenten CTL-stimulierenden mDC generiert werden sollen. ELKORD et al. (2005) verglich die Zytokinsekretion von DCs, die aus über Plastikadhärenz separierten Monozyten generiert wurden (Adhärenz/MoDC) mit der Zytokinsekretion von DCs, welche aus über CD14 positiv im MACS selektionierten Monozyten generiert wurden (MACS/MoDC). Dabei zeigte sich, dass MACS/MoDCs deutlich weniger IL12, TNFα und IL10 sezernierten als die Adhärenz/MoDC.
Da durch die positive Selektion von Monozyten im MACS demnach neben einer nicht gewünschten Selektion auch eine Manipulation und/oder Aktivierung der Zellen erfolgt, wurde darauf verzichtet, weitere Antikörper für die positive MACS Separation zu testen.
4.1.1.2.3 Negative Selektion über CD 4 und CD 8 -Depletion
Um die Nachteile der positiven MACS-Selektion zu umgehen, sollte versucht werden über eine negative Selektion Monozyten anzureichern. Da in der über Lymphozyten-separationsmedium separierten MNC Population die Lymphozyten mit ca. 90% die größte
„Störquelle“ darstellen, sollte in diesem Versuch überprüft werden, ob sich CD4+ bzw. CD8+ Zellen mit Hilfe von anti-CD4 und anti-CD8 Antikörpern und MACS-Separation aus den MNC entfernen lassen. Auf diese Weise sollte sich der relative Anteil an Monozyten erhöhen.
Von zwei Pferden wurden zunächst über Dichtegradientenzentrifugation MNC (3.3.1.3) separiert und anschließend mit Mäuse-Antikörpern gegen equines CD4 und CD8 (3.2.4) inkubiert. Schließlich wurden die Zellen mit FITC gekoppelten Ziegen-Antikörpern gegen Mäuse IgG(H+L) (3.2.4) markiert und anhand der Fluoreszenz die Bindung der AK im Durchflusszytometer kontrolliert (3.3.8.2). In Abbildung 10 ist ein korreliertes Punktediagramm (Dotplot) dargestellt, welches die Fluoreszenzintensität (FL-1) gegen die Größe der Zellen (FSC) zeigt.
CD 4 und CD 8 pos. MNC Monozyten
Forward Scatter (FSC)
FL 1-Fluoreszenzintensität
Abb. 10 Kontrolle der Bindungsaffinität eines anti-CD4 und eines anti-CD8-Antikörpers in der Membranimmunfluoreszenz
Equine MNC wurden über Lymphozytenseparationsmedium® separiert (3.3.1.3) und mit einem kontrollierten Gemisch aus anti-equinen CD4 und anti-equinen CD8 Antikörpern (3.2.4) in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (3.3.8.1) untersucht. Dargestellt ist der Dotplot (3.3.3) eines Pferdes für Größe (FSC) gegen Grünfluoreszens (FL1). Die senkrechte Linie markiert die Fluoreszenzintensität der Konjugatkontrolle. Die Kreise zeigen die Bereiche, in denen morphologisch die monozytoide Zellen (oben) bzw. die lymphoiden Zellen (unten) zu finden sind. Zellen, die sich rechts der senkrechten Linie befinden, sind als positiv für CD4 und CD8 zu bewerten (61,2%).
Lymphozyten
War die Bindung beider AK zufriedenstellend (mindestens 50% aller Zellen positiv und die Monozytenfraktion weitgehend negativ, siehe Abbildung 10.) wurden die Zellen mit anti-FITC-Mikrobeads (3.2.4) inkubiert und durch eine magnetische Säule aufgetrennt (3.3.1.5).
In Abbildung 11 sind die Dotplots (FSC vs. FL1) der Zellen vor der MACS-Separation, der Zellen aus dem Durchfluss (CD4 und CD8 negativ), sowie der Zellen des Eluats (CD 4 und CD 8 positiv) exemplarisch von einem Pferd dargestellt.
Forward Scatter (FSC)
Forward Scatter (FSC) Forward Scatter (FSC)
MNC vor MACS
FL 1-Fluoreszenzintensität
FL 1-Fluoreszenzintensität FL 1-Fluoreszenzintensität
Durchlauf Eluat
Abb. 11 Monozytenaufreinigung über eine Depletion CD4 und CD8 – positiver MNC im MACS
Equine MNCs wurden mit anti-CD4 und anti-CD8 Primärantikörpern (3.2.4.1.1), anti-Maus-FITC-konjugierten Sekundärantikörpern (3.2.4.1.2), sowie anti-FITC-Tertiärantikörpern (3.2.4.1.2) inkubiert und in einer magnetischen Säule aufgetrennt (3.3.1.5.1). Der oberste Dotplot zeigt die Komposition der MNC-Ausgangspopulation. Im unteren linken Dotplot sind die Zellen dargestellt, welche die Säule trotz Magnetfeld passiert haben (Durchfluss). Die Zellen, die in der Säule festgehalten wurden (Eluat) sind im unteren, rechten Dotplot zu sehen. Alle Dotplots zeigen die Größe (FSC) gegen die Fluoreszenzintensität (FL1). Der Quadrant markiert auf der X-Achse die Lage der Konjugatkontrolle und auf der Y-Achse die morphologische Grenze zwischen lymphoiden und monozytoiden Zellen.
Gefenstert wurde auf vitale MNC (3.3.3.1).
In den oben gezeigten Dotplots (Größe (FSC) versus Grünfluoreszenz (FL1)) ist zu sehen, dass eine Anreicherung der Monozyten über Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen erreicht werden kann, allerdings die Reinheit der Monozyten nicht über 38% aller MNC steigt (Abb. „Durchlauf“, Quadrant oben links). Die Ausbeute an CD4 und CD8 depletierten MNC (Durchlauf) lag bei nur 6,8% der zur Separation eingesetzten MNC. Des Weiteren kann man erkennen, dass auch einige Zellen CD4 und CD8 exprimieren, die morphologisch in der Region der monozytoiden Zellen liegen (hohes FSC, Quadrant oben rechts). Diese Zellen befinden sich nach der Depletion im Eluat mit den Lymphozyten zusammen. Im Zuge dieses Trennverfahrens findet somit eine Selektion in CD4 und CD8 -positive und -negative Monozyten statt.
Aufgrund zu geringer Ausbeute an CD4 und CD8- depletierten MNC (6,8 % der eingesetzten MNC) und der Vorselektion der Monozyten wurde diese Methode nicht weiter verfolgt.
4.1.1.3 Anreicherung über hypertonen Percollgradienten
Eine sehr elegante Methode der Monozytenaufreinigung wurde von DE ALMEIDA et al.
(2000) für den Menschen beschrieben: Über einen hypertonen 50%igen Percollgradienten gelang es ihnen, humane Monozyten in beeindruckender Reinheit und Ausbeute zu separieren.
Um zu überprüfen, ob diese Methode auch zur Aufreinigung equiner Monozyten verwendet werden kann, wurde Vollblut von verschiedenen Pferden gewonnen und das leukozytenreiche Plasma auf einen hypertonen Percollgradienten (3.2.5.3) geschichtet. Nach der Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6) konnten im Rahmen dieser Untersuchungen erstmals auch beim Pferd MNCs gewonnen werden, die Monozytenanteile zwischen 50% bis 90%
enthielten (4.1.1.3.2). Der Separationserfolg variierte jedoch interindividuell als auch intraindividuell. Deshalb galt es die für die Schwankungen ursächlichen Faktoren zu ermitteln.
4.1.1.3.1 Einfluss des Antikoagulanz und der Percolltemperatur auf den Separationserfolg mit hypertonem Percoll
Zunächst wurden zwei verschiedene Antikoagulanzien miteinander verglichen, da Monozyten sehr zu einer Aggregation an Thrombozyten neigen. Dafür wurde demselben Tier (Warmblüter) Blut in Vaccutainern (3.2.1) entnommen, welche entweder Citrat oder EDTA als Gerinnungshemmer enthielten. Das leukozytenreiche Plasma jeder Blutprobe wurde abgenommen und auf einen Percollgradienten mit einer berechneten Dichte (3.2.5.3.2) von
Percollgradienten unterschiedlicher Temperatur (7°C und 25°C) wurde zudem gleichzeitig ermittelt, ob eine Feinmodulation der Dichte mittels Temperatur des Gradienten möglich ist.
In Tabelle 5 sind die nach Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6.) ermittelten Zellzahlen, der prozentuale Monozytenanteil sowie der absolute Monozytenanteil dargestellt.
Tab. 5. Ausbeute und Monozytenreinheit in Abhängigkeit zu Antikoagulanz und Temperatur
Antikoagulanz Percolltemperatur Ausbeute aller MNC aus 20 ml Vollblut
[x 106]
Reinheit in % Monozyten
Monozyten [x 106]
Citrat 7°C 0,6 42,8 0,27
Citrat 25°C 0,3 43,6 0,11
EDTA 7°C 0,9 72,6 0,62
EDTA 25°C 0,7 88,1 0,60
Einem Pferd wurden jeweils 40 ml Citrat- und EDTA– antikoaguliertes (3.3.1.1) Blut zeitgleich entnommen und über Dichtegradientenzentrifugation mit hypertonem Percoll (3.2.5.3.2) bei Temperaturen von 7° oder 25°C die Monozytenfraktion angereichert. Dargestellt sind die mikroskopisch ermittelten Zellzahlen, sowie der durchflusszytometrisch bestimmte prozentuale Monozytenanteil. (Zur Zellausbeute vergleiche Kapitel 4.1.1.3.2.)
Es zeigte sich, dass EDTA antikoaguliertes Blut eine weitaus bessere relative und absolute Anreicherung equiner Monozyten erlaubte, als dies bei Citrat antikoaguliertem Blut der Fall war. Durch die höhere Temperatur des Percollgradienten konnte zudem eine Feinmodulation der Dichte erzielt werden, da lediglich durch die höhere Temperatur des Gradienten die Reinheit der Monozyten um über 15% gesteigert werden konnte, ohne jedoch in der Gesamtzahl der Mononzyten (0,60 vs. 0,62 x 106) zu hohe Verluste zu erzielen.
Abbildung 12 zeigt Dotplots (Komplexität (SSC) versus Größe (FSC)) der Monozyten, welche aus EDTA-Blut bei unterschiedlichen Percolltemperaturen gewonnen wurden.
Forward Scatter (FSC)
MNC nach Percoll bei 25°C MNC nach Percoll bei 7°C
Side Scatter (SSC)
Abb. 12 Monozytenreinheit in Abhängigkeit der Dichtegradiententemperatur
Für die Separationserfolge mit EDTA-Blut sind die Dotplots aus dem Durchflusszytometer exemplarisch für beide Temperaturen (7° & 25°C) des Gradienten (3.2.5.3.2) dargestellt. Gezeigt wird die Morphologie der Zellen anhand ihrer Komplexität (SSC) und ihrer Größe (FSC). Der linke Dotplot zeigt die Zellen, welche über hypertonen Percollgradienten bei 7°C separiert wurden, während der rechte Dotplot die Zellen zeigt, die zwar über den gleichen Gradienten, allerdings bei 25°C isoliert wurden (3.3.1.6). Der Trennstrich in der Graphik markiert die morphologische Grenze der lymphoiden und monozytoiden Fraktion.
Für folgende Versuche wurde, basierend auf diesen Ergebnissen, ausschließlich EDTA antikoaguliertes Blut verwendet, und der verwendete Percollgradient im Wasserbad auf eine Temperatur von 25°C erwärmt.
4.1.1.3.2 Einfluss von Dichte und Osmolalität auf den Separationserfolg equiner Monozyten
Um zu prüfen, ob sich die von DE ALMEIDA et al. (2000) für den Menschen beschriebene Methode auch generell für das Pferd eignet, wurde das Verfahren für die Separation equiner Monozyten verwendet sowie seine Abhängigkeit von Osmolalität und Dichte auf den Separationserfolg eruiert.
Dazu wurden verschiedene Dichten eines Percollgradienten mit unterschiedlicher Osmolalität hergestellt (3.2.5.3.2) und die erzielte Monozytenreinheit und Ausbeute an vier Pferden (2 Warmblüter und 2 Islandponies) untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 dargestellt.
Einfluss von Dichte und Osmolalität
Zellzahl aller MNC in x 106
Abb. 13 Einfluss von Dichte und Osmolalität auf Zellausbeute und Monozytenanteil Von vier Pferden wurde EDTA-antikoaguliertes Blut (3.3.1.1) gewonnen und durch hypertone Dichtegradientenzentrifugation (3.3.1.6) Monozyten angereichert. Die verwendeten Percollgradienten unterschieden sich dabei in Dichte und Osmolalität (gelb: 330 mOsm/kg, orange: 345 mOsm/kg). Der linke Graph zeigt den Einfluss der beiden Parameter auf den relativen Anteil der Monozyten der wiedergewonnenen MNC, der rechte Graph gibt die dazugehörige absolute Ausbeute aller MNC wieder, die aus 20 ml Vollblut gewonnen werden konnten. Dargestellt sind die Mittelwerte der vier Pferde mit Standardabweichung. Der Pfeil markiert die bei bester Reinheit erzielte beste Ausbeute an Monozyten.
Es zeigte sich, dass die Osmolalität in dem hier geprüften Bereich keinen Einfluss auf den Reinheitsgrad der Monozyten hatte. Auch die geringen Dichteunterschiede der Gradienten zeigten keinen Unterschied bezüglich des relativen Monozytenanteils. Betrachtet man aber die Ergebnisse des Dichtegradienten mit 1,0638 g/ml Dichte in der Ausbeute (siehe Pfeil in Abb.
13), fällt auf, dass durch die Hypertonie mehr Zellen gewonnen werden konnten (2 x 106 MNC aus 20 ml Vollblut).
Separiert man leukozytenreiches Plasma von EDTA-Blut über Lymphozytenseparations-medium® (3.3.1.3) erhält man im Mittel 20 x 106 MNC, von denen lediglich ca. 10%
Monozyten sind (absolut 2 x 106). Separiert man das gleiche leukozytenreiche Plasma über den hier beschriebenen hypertonen Percollgradienten, erhält man im Durchschnitt nur Einzehntel der MNC (2 x 106), von denen jedoch 70% Monozyten sind (1,4 x 106). Somit kann durch einen einzigen Separationsschritt über hypertonen Percollgradienten fast die gleiche Anzahl an Monozyten gewonnen werden, jedoch in wesentlich höherer Reinheit (50 bis 90%).
Neben der sehr guten Ausbeute und der hohen Reinheit der Monozyten, findet bei dieser Methode keine erkennbare unspezifische Vorselektion oder Aktivierung der Monozyten statt.
Aus diesen Gründen wurde für weitere Untersuchungen Percollgradient mit 1,0638 g/ml Dichte und 345 mOsm/kg verwendet.
4.1.1.3.3 Zeit nach Blutentnahme als Einflussfaktor auf den Separationserfolg equiner Monozyten
Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob der Verarbeitungszeitpunkt des Blutes nach der Entnahme einen Einfluss auf den Separationserfolg im Hinblick auf Reinheit und Ausbeute der Monozyten ausübt. Hierfür wurde von vier Pferden (2 Isländerponies und 2 Warmblütern) EDTA-Blut entnommen und jeweils die Hälfte des Blutes 1h nach Entnahme verarbeitet, während die andere Hälfte erst nach 24h Lagerung bei Raumtemperatur verwendet wurde. Die Monozytenseparation erfolgte zu beiden Zeitpunkten mit hypertonem (ca. 345mOsm/kg) Percollgradienten mit einer Dichte von 1,0638 g/ml. Die Ansätze erfolgten in Duplikaten, um eventuelle Schwankungen während der Messung feststellen zu können.
Anschließend wurden die Zellen mit PBS-EDTA (3.2.5.3.5) dreimal gewaschen und durchflusszytometrisch der Anteil an Monozyten bestimmt. In Abbildung 14 sind die Mittelwerte der erzielten Anteile der Monozyten an den MNC für zwei unterschiedliche Zeitspannen von der Blutentnahme bis Bearbeitung dargestellt.
Monozytenreinheit in
Abb. 14 Einfluss des Verarbeitungszeitpunktes des Blutes auf den Anteil von Monozyten an den MNC
EDTA antikoaguliertes Blut (3.3.1.1) von vier Pferden wurde für 1h und 24h nach Entnahme bei RT gelagert und dann zur Isolierung der Monozytenfraktion mittels hypertonem Percollgradienten
EDTA antikoaguliertes Blut (3.3.1.1) von vier Pferden wurde für 1h und 24h nach Entnahme bei RT gelagert und dann zur Isolierung der Monozytenfraktion mittels hypertonem Percollgradienten