4 Ergebnisse
4.2 Generierung von dendritischen Zellen aus angereicherten equinen Monozyten
4.2.2 Generierung equiner dendritischer Zellen nach unterschiedlichen
Um einen Nachweis dendritischer Zellen mittels Membranimmunfluoreszenz über CD83 und CD86 führen zu können, schien es unumgänglich zu sein, den relativen Anteil der Monozyten zu erhöhen. Aus diesem Grund wurde an equinen MNC mit einem monozytoiden Anteil von mindestens 60% der Einfluss des zuvor eingesetzten req.IL4 auf die Differenzierung eq.Monozyten zu DC weiter untersucht. Um Einflüsse auf die Monozyten ermitteln zu können, die durch die Aufreinigungsmethode zustande kommen, wurden Monozyten, welche über IgE positiv im MACS selektioniert (4.1.1.2.1) und Monozyten welche über einen hypertonen Percollgradienten aufgereinigt worden waren (4.1.1.3), zur DC-Generation verwendet.
4.2.2.1 DC-Generierung aus IgE positiven Monozyten nach MACS
Monozyten des Pferdes wurden über IgE positiv im MACS selektioniert (4.1.1.2.1) und anschließend mit huGM-CSF (3.2.6.2) alleine und in Kombination mit req. IL4 (3.2.6.1) in Kultur gebracht. Die Zellkulturen wurden täglich mikroskopisch auf Zellvitalität und Morphologie untersucht. Nach 3 Tagen in Kultur zeigte sich schon ein stark aktiviertes Zellbild, so dass die Zellen geerntet und in der Membranimmunfluoreszenz auf die Expression von CD83, CD86 und MHC II untersucht wurden. Zum Vergleich wurden von demselben Tier MNCs (über Lymphozytenseparationsmedium® separiert, 3.3.1.3) unter den gleichen Bedingungen kultiviert und der Prozentsatz der in der MIF positiven Zellen miteinander verglichen. Abbildung 19 gibt die Ergebnisse der durchgeführten MIF für alle vier Kulturansätze wieder (Ausgangs-MNC-Population über Lymphozytenseparation®
separiert und z.T. zusätzlich über IgE angereicherte Monozyten mit und ohne req.IL4.).
Konjugat MHC I MHC II CD83 CD86 Isotyp.IgG1 Isotyp.IgG2a Isotyp.IgG2b
IgE positive Monozyten mit 67 % monoztyoidem Anteil
Oberflächenmarker
% FL1 positiver MNC
Konjugat MHC I MHC II CD83 CD86 Isotyp.IgG1 Isotyp.IgG2a Isotyp.IgG2b
0
Abb.19 Expression verschiedener Oberflächenmarker auf MNC ohne Monozyten-anreicherung und auf IgE positiven angereicherten Monozyten mit und ohne req.IL4
Von einem Pferd wurden zeitgleich MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) gewonnen. Ein Teil der MNC wurde anschließend einer affinitätschromatographischen Monozytenanreicherung über IgE unterzogen (3.3.1.5.2). Die IgE positiven Zellen (rechte Abb.) und die Ausgangs-MNC-Population (linke Abb.) wurden für 3 Tage in Earles-Medium (3.2.5.1) mit GM-CSF (3.2.6.2) alleine oder in Kombination mit req.IL4 kultiviert (3.2.6.1). An Tag 3 wurden die Zellen geerntet und in der MIF (3.3.8) auf die Oberflächenmarker MHC I, MHC II, CD83 und CD86 untersucht. Der linke Graph zeigt den prozentualen Anteil FL1 positiver Zellen der Ausgangs-MNC-Kultur, der rechte Graph zeigt den Anteil FL1 positiver Zellen aus der Kultur der über IgE angereicherten Monozyten.
Werden Monozyten über IgE angereichert, lassen sich nach der Kultivierung mit req.IL4 und GM-CSF Oberflächenmarker nachweisen, die für dendritische Zellen charakteristisch sind:
CD 83 und CD 86. Bemerkenswert ist hier zudem die Tatsache, dass für eine Differenzierung der Monozyten zu DC nur 3 Tage ausreichend waren und ohne zusätzlichen Stimulus (LPS, TNF etc.) eine deutliche Expression des Reifungsmarkers CD 83 zu detektieren war. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass auch in der Kultur ohne req.IL4 (grüne Säulen) ein nicht unerheblicher Anteil der Zellen eine Expression von CD 83 und CD 86 zeigte. Unter Zusatz von req.IL4 stieg der Prozentsatz der positiven Zellen jedoch weiter an. Im Gegensatz dazu war in der MNC-Kultur mit nur 12% Monozyten kein Nachweis von DC über die Oberflächenmarker in der MIF möglich.
Die hier eingesetzten Antikörper gegen CD 83 und CD 86 konnten nun als beim Pferd kreuzreaktiv angesehen, und somit für die Charakterisierung der dendritischen Zellen verwendet werden. Auch für das req.IL4 war ein Einfluss auf die Differenzierung der Monozyten zu DC nachgewiesen.
4.2.2.1.1 Durchflusszytometrische Erfassung der morphologischen Differenzierung IgE positiver Monozyten zu DC
Um die morphologische Differenzierung der IgE positiven Monozyten innerhalb der 3 Tage Kultur darzustellen, wurden die Zellen im Durchflusszytometer direkt nach der Separation über MACS (4.1.1.2.1) (d 0) und an Tag 3 der Kultur (d 3) untersucht. Abb.20 zeigt exemplarisch die Dotplots eines Pferdes für Komplexität (SSC) versus Größe (FSC) der IgE-positiven Monozyten an d 0 und an d 3.
Separierte Monozyten d0 MoDC nach 3d Kultur
Side Scatter (SSC)
Forward Scatter (FSC)
Abb. 20 Morphologische Differenzierung IgE positiver Monozyten nach 3 Tagen Kultur Monozyten eines Pferdes wurden über IgE positiv im MACS (4.1.1.2.1) selektioniert und für 3 Tage mit GM-CSF und req.IL4 in Earles-Medium kultiviert (3.3.6.2). Die Zellen wurden direkt nach der Anreicherung und nach drei Tagen Kultur (GM-CSF + req.IL4) durchflusszytometrisch auf ihre Morphologie untersucht (3.3.3). Dargestellt sind Dotplots der frisch MACS-separierten Monozyten (Tag 0) und der über 3 Tage kultivierten Zellen in der morphologischen Darstellung Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC).
Es zeigte sich, dass im Verlauf der Kultivierung die Zellen eine Zunahme an Größe und Komplexität erfahren.
Obwohl sich in den Versuchen herausstellte, dass über IgE angereicherte Monozyten in der
Gewinnung von DC zum therapeutischen Einsatz in der Tumortherapie Abstand genommen.
Grund dafür war eine zu geringe Ausbeute der Zellen (2 bis 5 x 106 MNC aus 500ml Vollblut), die Vorselektion einer Subpopulation von (IgE-pos.) Monozyten sowie eine unspezifische Aktivierung der MACS-angereicherten Zellen. Zudem ist noch nicht bekannt, welche Funktionen IgE+ Monozyten bzw. DC in vivo ausüben.
4.2.2.2 DC-Generierung aus equinen Monozyten nach Anreicherung über hypertonen Percoll-Gradienten
Wie in Kapitel 4.1.1.3 gezeigt wurde, lassen sich equine Monozyten über einen leicht hypertonen Percollgradienten in guter Reinheit und Ausbeute gewinnen. Nun sollte überprüft werden, ob diese Zellen - ebenso wie IgE-angereicherte eq. Monozyten - in der Lage sind, in dendritische Zellen zu differenzieren. Von vier Pferden wurden Monozyten angereichert und mit GM-CSF und req.IL4 in Kultur gebracht. Da sich zuvor zeigte (4.2.2.1), dass eine Expression der DC-Marker schon nach 3 Tagen Kultur erreicht werden konnte, in der Literatur aber 7 Tage als Differenzierungsdauer equiner MoDC angegeben wird (MAUEL et al. 2006), wurden diese Zellen nach 3 bzw. 7 Tagen Inkubation geerntet und durchflusszytometrisch sowie lichtmikroskopisch untersucht. Mit Hilfe einer MIF (3.3.8) wurde der prozentuale Anteil Zellen ermittelt welche CD83 und CD86 exprimieren.
4.2.2.2.1 Charakterisierung der MoDC in der Membranimmunfluoreszenz
Mit der Membranimmunfluoreszenz sollte nun überprüft werden, ob sich bei hyperton angereicherten Monozyten nach Kultivierung die für DC charakteristischen Oberflächenstrukturen CD83 und CD86 nachweisen lassen. Zudem sollte untersucht werden, ob sich, wie bei den über IgE angereicherten Zellen, schon nach 3 Tagen eine deutliche Expression dieser Marker messen lässt.
Anschließend wurde der prozentuale Anteil der FL1 positiven Zellen an Tag 3 und Tag 7 ermittelt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 21 wiedergegeben.
CD 83 CD 86 0
10 20 30 40 50
60 Tag 3
Tag 7
Oberflächenmarker
% FL1 positive MNC
Abb. 21 Zeitkinetik der Expression des costimulatorischen Moleküls CD86 und des DC Reifungsmarkers CD83 auf equinen MoDC
Über hypertones Percoll (4.1.1.3) angereicherte Monozyten von vier Pferden wurden für 3 bzw. 7 Tage mit huGM-CSF (3.2.6.2) und req.IL4 (3.2.6.1) kultiviert (3.3.6.2). Nach den jeweiligen Inkubationszeiten wurden die Zellen mittels Membranimmunfluoreszens (3.3.8) auf ihre Expression von CD83 und CD86 untersucht. Ermittelt wurde der Prozentsatz FL1 positiver Zellen. Dargestellt sind die Mittelwerte von vier Pferden mit Standardabweichung.
Nach 3 Tagen Kultur waren die Zellen zu 13% (MW) CD86 positiv. Wurden die Zellen für insgesamt 7 Tage in Kultur belassen, stieg der Prozentsatz der CD86 exprimierenden Zellen jedoch deutlich weiter an. CD83 war an Tag 3 schon bei 9% aller Zellen ebenfalls nachweisbar und wurde an Tag 7 von 17% der Zellen exprimiert. Im Gegensatz zu den über IgE angereicherten Zellen benötigten die über Percoll angereicherten Zellen 7 Tage Kultivierungszeit, um ein vergleichbares Niveau der CD83 und CD86 Expression zu erreichen.
Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die über IgE und MACS aufgereinigten Zellen bereits durch die affinitätschromatographische Aufreinigung eine erhebliche Aktivierung erfahren hatten.
Eine MIF mit den Antikörpern vor der Kultivierung zeigte, dass die Zellen direkt nach der Separation (Tag 0) CD83 und CD86 negativ waren. Mitgeführte Konjugat- und Isotypkontrollen waren ebenfalls negativ. Exemplarisch ist dies für ein Pferd in Abbildung 22 in Histogrammen dargestellt.
Tag 0, CD 83 Tag 7, CD 83
Tag 0, CD 86 Tag 7, CD 86
Ereignisse
FL-1-Fluoreszenzintensität
Abb. 22 Expressionsanstieg der Oberflächenmarker CD 83 und CD 86 von d 0 zu d 7 Über hypertonen Percoll angereicherte Monozyten (4.1.1.3), wurden direkt nach der Separation (Tag 0) und nach 7 Tagen Kultur mit huGM-CSF und reqIL4 (3.3.6.2) in der Membranimmunfluoreszenz auf die Expression von CD 86 und CD 83 untersucht. Die Histogramme zeigen die Ereignisse in der FL1-Fluoreszenzintensität an Tag 0 und Tag 7. Gefenstert wurde auf morphologisch als Monozyten (Tag 0) oder dendritische Zellen (Tag 7) identifizierbare Zellen. Schwarze Linie: Konjugatkontrolle, Blaue Linie: Isotypkontrolle, Rot: CD 83 positive Zellen (oben) und CD 86 positive Zellen (unten).
Um ausschließen zu können, dass kontaminierende Lymphozyten unspezifisch an die anti-CD83 und anti-CD86-Antikörper binden, wurde zusätzlich die Morphologie der Zellen gegen die FL1-Fluoreszenz beurteilt (Abbildung 23). Während die morphologisch als DC identifizierbaren Zellen durch Bindung der Antikörper eine Verschiebung nach rechts (zunehmende FL1-Fluoreszenz) erfahren, blieben die Lymphozyten negativ. Eine Bindung der anti-CD 83 und anti- CD 86-Antikörper findet somit selektiv nur bei den DC statt.
Side Scatter (SSC)
FL 1- Fluoreszenz
CD 86 CD 83
Dendritische Zellen
Lymphozyten
Dendritische Zellen
Lymphozyten
Abb. 23 Kontrolle der FL1-Fluoreszenz kontaminierender Lymphozyten im Vergleich zu Monozyten bzw. DCs
Aus Monozyten generierte DC (3.3.6.2) wurden in einer MIF (3.3.8) auf die Oberflächenmarker CD83 und CD86 untersucht. Um unspezifische Bindungen der Antikörper an die kontaminierenden Lymphozyten ausschließen zu können, wurde die Komplexität gegen die Fluoreszenzintensität (FL1) beurteilt. Die senkrechte Linie markiert den FL1-Wert der Konjugatkontrolle. Für beide Oberflächenmarker (CD83 links, CD86 rechts) ist deutlich zu erkennen, dass nur die monozytoiden/
dendritischen Zellen eine Verschiebung nach rechts erfahren.
4.2.2.2.2 Durchflusszytometrische, morphologische Charakterisierung der MoDC Im Durchflusszytometer zeichneten sich die dendritischen Zellen durch eine starke Zunahme ihrer Komplexität aus, was sich in einem erhöhten Seitwärtsstreulicht (SSC) im Durchflusszytometer darstellt. Exemplarisch ist dies für ein Pferd im Dotplot nach 7 Tagen Kultur dargestellt.
Forward Scatter (FSC) Side Scatter (SSC)
Separierte Monozyten d0 MoDC nach 7d Kultur
Abb. 24 Durchflusszytometrische Erfassung der DC-Morphologie
Der linke Dotplot zeigt die über hypertones Percoll frisch angereicherten Monozyten (3.3.1.6) eines Pferdes in der morphologischen Darstellung (Komplexität (SSC) gegen Größe (FSC)). Der rechte Dotplot zeigt dieselben Zellen nach 7 Tagen Kultur (3.3.6.2) in Earles Medium unter Zusatz von huGM-CSF und req.IL4 (3.2.6). Die senkrechte Linie markiert die Grenze zwischen Lymphozyten (links) und Monozyten (rechts).
Während die frisch isolierten Monozyten eine sehr homogene Population darstellen, streuen die MoDC wesentlich stärker. Die Zellen werden geringgradig größer (FCS-Zunahme) und zeichnen sich durch eine komplexere Oberflächenstruktur aus (SSC-Zunahme). Diese morphologische Veränderung konnte lichtmikroskopisch ebenfalls beobachtet werden (vgl.
4.2.2.2.3).
4.2.2.2.3 Mikroskopische Beurteilung der dendritischen Zellen
Um die Zellmorphologie, sowie die Zellverbindungen besser darstellen zu können, wurde ein Teil der Monozyten in Chamber-Slides (3.2.2) kultiviert. Dabei findet die Kultivierung der Zellen direkt auf einem speziellen Objektträger statt, was später eine Färbung und mikroskopische Untersuchung der Zellen ermöglicht ohne sie durch Manipulationen zu
beschädigen oder in ihrer Morphologie zu beeinflussen. Abbildung 25 zeigt mikroskopische Aufnahmen der Zellen in situ.
Abb. 25 Lichtmikroskopische Aufnahmen generierter dendritischer Zellen in situ
Monozyten wurden für 4 Tage in Chamber-Slides (3.2.2) in Earles Medium (3.2.5.1) mit Zusatz von huGM-CSF und req.IL 4 kultiviert (3.3.6.2). Nach 4 Tagen wurden die auf dem Objektträger adhärierenden Zellen luftgetrocknet und mit einer modifizierten Färbung nach Wright angefärbt. Foto A zeigt die Zellen in einer Übersichtsaufnahme. Foto B, C und D verdeutlichen die Zell-zu-Zellkontakte der DC, sowie die Anlagerung von Lymphozyten (Pfeile).
4.2.2.3 Einfluss eines finalen Stimulus auf die CD-Expression equiner MoDC Das Oberflächenmolekül CD 83 wird in der Literatur als Reifungsmarker dendritischer Zellen bezeichnet, obwohl über seine Funktion noch wenig Erkenntnisse vorliegen (LECHMANN et al. 2001). Bei Mensch und Maus wird es erst auf reifen DC nachgewiesen, wobei die Reifung
50µm
50µm 50µm 200µm
A B
C D
durch Kultivierung peripherer Blutmonozyten mit GM-CSF und req.IL4 zu einer Expression dieser Oberflächenstruktur bei 15-30% der MNC führte (siehe oben), sollte überprüft werden, ob durch Zugabe von LPS (1µg/ml) 24 h vor Ernte der DC eine Zunahme in der Expression dieses Reifungsmarkers zu detektieren ist.
Hierfür wurden Monozyten von vier Pferden über einen hypertonen Percollgradienten (3.2.5.3.2) angereichert und jeweils in zwei Zellkulturflaschen 10 x 106 MNC mit hohem Monozytenanteil pro Pferd mit GM-CSF und req.IL4 für 7 Tage kultiviert (3.3.6.2). An Tag 6 wurde der Hälfte der Kulturansätze LPS (3.2.3) in einer Endkonzentration von 1µg/ml zugesetzt. 24 Stunden später wurden alle Zellen mit Hilfe eines Zellschabers geerntet und in der MIF auf ihre Expression von MHC II, CD83 und CD86 untersucht. In Abbildung 26 sind die Ergebnisse der MIF dargestellt.
Konjugat MHC II CD 83 CD 86 IgG1 IgG2b
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 Tag 0
Tag 7 ohne LPS Stimulation Tag 7 mit LPS
Oberflächenmarker
% FL1 positive MNC
Abb. 26 Einfluss einer finalen 24 stündigen Stimulation mit LPS auf die CD-Expression equiner MoDC
Monozyten von vier Pferden wurden mit GM-SCF (3.2.6.2) und req.IL4 (3.2.6.1) für 7 Tage kultiviert (3.3.6.2). Die Hälfte der Kulturen erhielten an Tag 6 LPS (1µg/ml) (3.2.3). An Tag 0 (Separation der Monozyten) und Tag 7 wurden die Zellen in einer MIF auf die Expression von MHC II, CD83 und CD86 untersucht (3.3.8). Dargestellt sind die MW von vier Tieren der FL1-positiven Zellen in % der gesamten MNC-Population einschließlich der Isotypkontrollen IgG1 und IgG2b (3.2.4.1.1).
Es zeigte sich bei allen Kulturen ein Anstieg der CD83 und CD86 Expression im Vergleich zu Tag 0. Eine finale Stimulation mit LPS führte aber zu keinerlei Unterschieden im Vergleich zu der entsprechenden Kultur ohne LPS.