Einsatz dendritischer Zellen als Tumorvakzine

In der Onkologie werden immunologische Therapieansätze mitunter als die vierte Säule der Tumorbekämpfung bezeichnet (neben Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie). Besonders dendritische Zellen werden als vielversprechende Immuninduktoren gesehen, da sie den Angelpunkt jeder durch Lymphozyten vermittelten Immunität darstellen. Zahlreiche Studien wurden in der Humanmedizin durchgeführt, die beweisen sollten, dass DC in der Lage sind Tumorescapemechanismen zu durchbrechen. Dabei finden unterschiedlichste Verfahren der DC-Generierung, Antigenbeladung und DC-Applikation ihre Verwendung.

2.3.3.1 Auswahl verschiedener Generierungsmethoden 2.3.3.1.1 Gewinnung der DC bzw. Vorläuferzellen

Schon die Gewinnung dendritischer Zellen kann durch unterschiedliche Verfahren erfolgen.

Mit Hilfe von Antikörper-Kits können sie z.B. direkt aus humanen Blut gewonnen werden, wie DZIONEK et al. (2000) zeigen konnten. Da allerdings die Menge der im Blut zirkulierenden DC sehr gering ist, werden die CD34+-Vorläuferzellen und somit die Blut-DC zum Teil durch Applikation von Flt3 Liganden („fms like“ tyrosine kinase 3 ligand) expandiert (MORSE et al. 2000; ROSENZWAJG et al. 1998). Aber auch durch Kultivierung der CD34+ Vorläuferzellen mit GM-CSF und TNFα lassen sich DC generieren (CAUX et al.

1997). Direkt aus dem Gewebe können DC mit Hilfe von Cell-Sortern isoliert werden (CROWLEY et al. 1990).

Um größere Mengen an DC zu generieren, haben sich Monozyten des peripheren Blutes als gute Ausgangspopulation erwiesen. Sie besitzen die Fähigkeit, in Abhängigkeit des umgebenden Milieus, in Makrophagen oder dendritische Zellen zu differenzieren. Die Separation der monozytoiden Zellen kann über Plastikadhärenz, magnetic-cell-sorting (MACS) oder Dichtegradientenzentrifugation erfolgen. Für die Separation equiner Monozyten beschrieben HAMMOND et al. (1999) eine Methode, bei der zunächst mit Hilfe eines Dichtegradienten mononukleäre Zellen aus Vollblut aufgereinigt und schließlich über Plastikadhärenz Monozyten angereichert wurden. Eine leicht modifizierte Methode wendete MAUEL (2002) an. Durch eine zweimalige Überschichtung der MNC auf unterschiedliche Dichtegradienten und mehrere Adhäsionspassagen konnte sie die Reinheit und Ausbeute equiner Monozyten erhöhen, erzielte jedoch lediglich 1-5 x10⁶ Monozyten aus 500ml Vollblut. Laut ELKORD et al. (2005) hat schon der Schritt der Monozytenaufreinigung einen erheblichen Einfluss auf die Zytokinproduktion der später generierten DC. Monozyten, welche über CD14 positiv im MACS selektioniert wurden, zeigten als mDC z.B. eine geringere Produktion der Zytokine IL12 und TNFα als mDC, welche aus über Plastikadhärenz gewonnenen Monozyten generiert wurden.

Generell führt eine Aufreinigung der Monozyten, bei der die Monozyten über ihre Oberflächenmoleküle positiv selektioniert werden, zu unspezifischen Aktivierungen, die nicht genau voraussagen lassen, welche Funktionalität die generierten DC später aufweisen. Um also möglichst wenig Einfluss auf die Zellen auszuüben ist es daher von Vorteil, die Zellen so wenig wie möglich zu manipulieren. Eine elegante Methode der Anreicherung wird von DE ALMEIDA et al. (2000) beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, dass über Dichtezentrifugation mit hypertonem Percoll® eine gute Reinheit und gute Ausbeute von

dass Lymphozyten, die sonst eine fast identische Dichte wie Monozyten aufweisen, empfindlicher auf die Hyperosmolalität reagieren. Durch Wasserverlust sollen die Lymphozyten eine höhere Dichte annehmen und sich so besser von den Monozyten trennen lassen.

2.3.3.1.2 Differenzierung monozytoider Zellen zu DC in vitro

Die Generation dendritischer Zellen aus monozytoiden Vorläuferzellen stellt für DC (MoDC) zur therapeutischen Anwendung meist das Verfahren der Wahl dar, da sie sich in großen Mengen kultivieren lassen und zur Gewinnung der monozytären Vorläuferzellen nur eine Blutentnahme erforderlich ist. Die eingesetzten Zytokine zur Differenzierung der Monozyten variieren allerdings. Anstelle von IL4 finden auch IL15, TNFα oder INFα ihren Einsatz um MoDC zu erhalten. Die generierten DC unterscheiden sich dabei sowohl in ihrer Homogenität, als auch in ihrer Zytokinsekretion. So sollen IL4-DC eine homologe Population darstellen, ohne Langerhanszellen, wohingegen TNF-DC heterogene Populationen mit CD1a+

Langerhanszellen und CD14+ interstitiellen DC ergeben (CHOMARAT et al. 2003). Nach MOHAMADZADEH et al. (2001) und PULENDRAN et al. (2004) sollen IL15-DC zudem besser als IL4-DC in der Lage sein cytotoxische T-Zellen zu stimulieren. Die Kapazität zur Stimulation CD4+ T-Zellen hingegen ist bei beiden Subtypen gleich. Für INF-α-DC konnte schon nach drei Tagen Kultur ebenfalls eine starke Stimulationskapazität cytotoxischer T- Lymphozyten beobachtet werden (SANTINI et al. 2000; SANTINI et al. 2003; SANTINI et al. 2005).

Doch nicht nur die Generierung der DC führt zu unterschiedlichen DC-Subtypen, sondern auch die verwendeten Stimuli zur Ausreifung der Zellen. Wie schon in Kapitel 2.3.2.4.

beschrieben, können TNFα, CD40-Ligand, LPS und monozytenkonditoniertes Medium verwendet werden. Verschiedene Zytokincocktails wie z.B. ein Gemisch aus IL1β, IL6, TNFα und Prostaglandin E2 sollen ebenfalls zu stimulationspotenten, maturen DC führen. Welcher Stimulus allerdings der beste ist, bleibt noch Gegenstand der aktuellen Forschung, wenn auch gezeigt werden konnte, das die Kombination von IL1β und TNFα mit Typ I und II Interferonen (INFα und INFγ) in vitro zu einer starken IL12 Sekretion und tumorspezifischen CTL-Induktion führt (MAILLIARD et al. 2004).

2.3.3.1.3 Antigenpulsing der DC

Eine weitere Frage, die bei der therapeutischen Anwendung von DC als Tumorvakzine berücksichtigt werden muss, ist die, ob, und wenn ja, wie DC mit Antigen beladen werden.

Meist werden sie in vitro mit definierten Peptiden beladen, was für „proof-of-principle-Studien“ essentiell ist, da nur so überwacht werden kann, ob eine antigenspezifische T-Zell-Aktivierung stattgefunden hat. Um DC mit Antigenen zu beladen, kommen viele Methoden in

Betracht. Neben der Fusionierung von DC mit Tumorzellen, der Transfektion der DC mit Tumor-DNS oder -RNS kommen auch heterocyclische Peptide oder Tumorzelllysate zur Pulsung (Beladung der MHC-Moleküle auf DCs) zum Einsatz. Einen direkten Vergleich zwischen mit Tumorzellen fusionierten DC und mit Lysat gepulsten DC, stellten WEIGEL et al. (2006) bei Mäusen an, und konnten keinerlei Unterschiede bezüglich der tumorprotektiven Immunantwort ausmachen. BANCHEREAU u. PALUCKA (2005) sehen generell einen Nachteil bei dem Pulsen von DC mit einzelnen Peptiden aufgrund von Immunselektion und mangelnder Diversität der antigenen Strukturen. Ein Pulsen mit möglichst vielen verschiedenen Peptiden über physiologische Prozessierungswege soll die effizienteste Antigenpräsentation induzieren.

2.3.3.1.4 Dosis und Applikationsroute von DC zur Tumortherapie

Werden gepulste DC zur Tumortherapie eingesetzt, stellt sich schließlich die Frage der Dosis und des Applikationsweges. Hier gibt es folgende Ansätze: Eine intranodale Gabe unter Ultraschallkontrolle in einen vom Tumor entfernten Lymphknoten, um die DC direkt an den Ort der DC-T-Zell-Interaktion zu bringen (NESTLE et al. 1998), eine intravenöse Injektion (HOLTL et al. 1999) oder die intrakutane Injektion (FONG et al. 2001). BEDROSIAN et al.

(2003) verglich die Applikationsrouten in einer klinischen Studie mit an malignen Melanomen erkrankten Patienten und fand heraus, dass alle drei Routen zu einem starken Anstieg tumorspezifischer CD8+T-Zellen führen. Dennoch konnte hier gezeigt werden, dass, gefolgt von der intradermalen Applikation, die intranodale Route zu einer höheren Stimulationsrate führte als die intravenöse Verabreichung. LINETTE et al. (2005) untersuchte u.a. die Toxizität der verabreichten DC. Bei Patienten mit verschiedenen Tumorarten wurden 10x10⁶, 15x10⁶ und 50x10⁶ DC pro i.v. Applikation verwendet. Alle Patienten vertrugen die Therapie sehr gut. Einen direkten Einfluss auf den Therapieerfolg kann man aufgrund der sehr heterogenen Patientengruppe leider nicht einer Dosis zuordnen. In einer weiteren Studie konnten LEE et al. (2006) jedoch einen Einfluss der DC-Dosis auf die tumorprotektive Immunantwort bei Mäusen mit Melanomen nachweisen. Je mehr DC sie einsetzten, desto besser war die immunologische Respons der Tiere und desto höher deren mittlere Überlebenszeit.

2.3.3.2 Immunologische Überlegungen zum Einsatz dendritischer Zellen zur Therapie des equinen Sarkoids

Da bisher noch keine ausreichend effektiven Behandlungen für das equine Sarkoid zur Verfügung stehen, liegt es nahe, dendritische Zellen des Pferdes zu generieren und als

Tumorantigene werden von den Tumorzellen exprimiert? Welcher Escapemechanismen bedient sich der Tumor und welche Immunantwort soll induziert werden?

In Kapitel 2.1.2.1.2 wurde schon erwähnt, dass z.B. die MHC-I-Expression auf transformierten Zellen durch das Tumorsuppressorprotein E5 herunterreguliert wird. Somit wäre, neben einer direkten cytotoxischen, Antikörper vermittelte Immunreaktionen von Vorteil, um den Mechanismus der antikörperabhängigen Zytotoxizität zu nutzen. Da DC in der Lage sind sowohl B- als auch T-Zellen zu stimulieren, scheinen sie ein geeignetes Mittel zur Induktion beider Immunantworten darzustellen. Geht man zusätzlich davon aus, dass der Tumor z.B. durch IL10 oder M-CSF (siehe Kapitel 2.2.2.) die Entwicklung von Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen hemmt, liegt es nahe, in vitro generierte unreife MoDC direkt in das transformierte Gewebe zu injizieren. Dort können sie geeignetes Tumorantigen aufnehmen und schließlich auf dem Weg zum Lymphknoten unter physiologischen Bedingungen ausreifen. KIM et al. (2004) konnten zeigen, dass bei Patienten, die unreife DC nach Tumorbestrahlung intratumoral appliziert bekamen, eine starke tumorspezifische Immunantwort ausgelöst wurde. Zudem wurde in equinen Sarkoiden immunhistochemisch nur eine sehr geringe Menge DC nachgewiesen (STARK 2005).

Entscheidender Faktor bei dieser Methode war allerdings die Bestrahlung des Tumors, da ein inflammatorisches Mileau innerhalb des Tumors entstand, welches zur Reifung der DC nach Antigenaufnahme führte. Ohne zusätzliche Tumornoxe wäre die Gefahr der Toleranzinduktion nicht auszuschließen, da STEINMAN (2003) und STEINMAN et al.

(2003) zeigen konnten, dass unreife DC bzw. reife DC ohne finalen Stimulus durch ein Gefahrensignal zu einer T-Zell-Deletion oder Anergie führen können. Allerdings ist auch bei in vitro gepulsten DC diese Gefahr nicht auszuschließen, da eine Toleranzinduktion ebenfalls von der Art der Antigenaufnahme bzw. des Rezeptors abhängig zu sein scheint. So soll z.B.

eine simultane Antigenbindung des macrophage- mannose- Rezeptors (MMR), des DC-SIGN ( = CD209) und der TLRs mit Mycobakterien die DC-Reifung blockieren, indem ihre IL12-Produktion heruntergefahren und die IL10 IL12-Produktion angeregt wird. Werden nur TLRs beladen, führt dies zu einer Aktivierung der DC und Sekretion von IL12 (MAHNKE et al.

2003). Die von JONULEIT et al. (2001) gemachten Beobachtungen, bei denen unreife DC im Gegensatz zu reifen DC in vivo keine tumorantigenspezifischen CTL induzierten, kann darauf beruhen, dass die DC intranodal in Lymphknoten appliziert wurden. Eine Reifung der DC während der Migration zu den Lymphknoten konnte somit nicht stattfinden.