der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Immunologische Untersuchungen zur Gewinnung und Charakterisierung dendritischer Zellen (DC) vom Pferd im Hinblick auf eine DC-Therapie des equinen Sarkoids
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Eva Siffrin
aus Saarbrücken
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h. c. Wolfgang Leibold
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h. c. Wolfgang Leibold 2. Gutachter: PD Dr. med. vet. Wolfgang Bäumer
Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2007
Meiner Familie
1 Einleitung und Zielsetzung ... 13
2 Literaturübersicht ... 15
2.1 Das equine Sarkoid...15
2.1.1 Das equine Sarkoid und seine Erscheinungsbilder... 15
2.1.2 Ätiologie des equinen Sarkoids... 17
2.1.3 Therapie des equinen Sarkoids... 19
2.2 Die Rolle des Immunsystems in der Tumorbekämpfung ...22
2.2.1 Bekämpfungsstrategien des Immunsystems... 22
2.2.2 Escapemechanismen von Tumorzellen ... 25
2.3 Dendritische Zellen ...26
2.3.1 Subpopulationen dendritischer Zellen... 27
2.3.2 Lebenszyklus dendritischer Zellen... 28
2.3.3 Einsatz dendritischer Zellen als Tumorvakzine ... 32
3 Geräte, Material und Methoden... 37
3.1 Geräte ...37
3.2 Material...38
3.2.1 Klinikbedarf... 38
3.2.2 Laborbedarf ... 39
3.2.3 Reagenzien ... 40
3.2.4 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 41
3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 43
3.2.6 Zytokine... 47
3.2.7 Tiere... 47
3.3 Methoden...48
3.3.1 Gewinnung definierter Zellpopulationen aus equinem Blut ... 48
3.3.2 Vitalitätsbestimmung von Zellen und Zellzahlermittlung... 52
3.3.3 Durchflusszytometrie ... 52
3.3.4 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellpopulationen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) ... 55
3.3.7 Lichtmikroskopische Untersuchung in vitro generierter dendritischer Zellen... 61
3.3.8 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ... 62
3.3.9 Herstellung eines sterilen Tumorzelllysats... 64
3.3.10 Bestimmung der Proteinkonzentration im Tumorzelllysat ... 66
3.3.11 Bestrahlung definierter Zellpopulationen zur Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion ... 67
3.3.12 Funktionalitätsprüfung der DC mittels gemischter Leukozytenreaktion (MLR). 67 3.3.13 Statistische Verfahren ... 69
4 Ergebnisse ... 70
4.1 Methodische Vorarbeiten ...70
4.1.1 Aufreinigung equiner Monozyten aus Vollblut... 70
4.2 Generierung von dendritischen Zellen aus angereicherten equinen Monozyten ...85
4.2.1 Funktionalitätsprüfung von rekombinantem equinem IL4... 85
4.2.2 Generierung equiner dendritischer Zellen nach unterschiedlichen Monozytenanreicherungsmethoden... 91
4.3 Funktionalitätsprüfung der generierten MoDC ...101
4.3.1 Einfluss von Mercaptoethanol auf die Proliferationsrate unstimulierter MNC .. 101
4.3.2 Gemischte Leukozytenreaktion mit ungepulsten DC... 104
4.3.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit gepulsten DC... 107
5 Diskussion ... 110
5.1 Vergleich unterschiedlicher Aufreinigungsmethoden equiner Monozyten ...110
5.1.1 Adhärenz equiner Monozyten als Aufreinigungsmethode... 110
5.1.2 Affinitätschromatographische Separation equiner Monozyten... 111
5.1.3 Dichtegradientenzentrifugation ... 112
5.2 Untersuchung der biologischen Funktionalität des req.IL4...113
5.2.1 Proliferationsassay mit equinen MNC ... 114
5.2.2 Einfluss des req.IL4 auf die Differenzierung zu MoDC ... 114
5.3 Beurteilung der in vitro generierten dendritischen Zellen ...115
5.3.1 Charakterisierung equiner DC... 115
5.3.2 Reifeinduktion equiner DC ... 117
5.4.2 Ungepulste DC stimulieren allogene MNC... 120
5.4.3 Gepulste DC stimulieren autologe und allogene MNC... 121
5.5 Ausblicke für die Sarkoidtherapie mit dendritischen Zellen ...122
6 Zusammenfassung... 126
7 Summary ... 129
8 Literaturverzeichnis... 131
Zellzytotoxizität) AK Antikörper
allogen Von einem genetisch anderen Individuum derselben Art stammend.
APC Antigen presenting cell (antigen präsentierende Zelle) autolog Von demselben Individuum stammend.
Aqua dest. Aqua destillata (einfach destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BPV Bovines Papillomavirus
BSA Bovines Serumalbumin bspw. Beispielsweise
bzw. Beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. Zirka
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
CDC Complement Depending Cell Cytoxicity (Komplementabhängige Zellzytotoxizität)
CD4+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren
CD8+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren
CD83+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD83 an der Oberfläche exprimieren
CD86+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD86 an der Oberfläche exprimieren
CO2 Kohlenstoffdioxid
DC Dendritic cells (dendritische Zellen)
DMEM Dulbecco´s minimal essential medium (minimal essentielles Medium nach Dulbecco)
DNS Desoxyribonukleinsäure
Dotplot Korrelierte Darstellung von zwei durchlusszytometrischen Parametern für jedes Ereignis als Punktwolke(n)
DS Danger Signal (Gefahrensignal) EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELA Equine leukocyte antigen, genetische Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Pferdes
Eq., eq. equin (zum Pferd gehörig)
EqCD Equine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für equine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CD- Nomenklatur
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg).
FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz
FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm;
FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
Flt3 „FMS-like“ Tyrosinkinase3 (Mitglied der Klasse-III Tyrosin- kinase (TK)–Rezeptorfamilie, Membranrezeptor auf frühen myeloiden und lymphatischen Progenitoren, der bei Bindung von Flt3 mit Flt3-Ligand (Flt3L) zur Proliferation der Progenitoren führt, FMS= fat mobilizing substance))
Fluide Zellen Zellen, die sich unter den hier durchgeführten Bedingungen nicht an die Plastikoberfläche ausreichend fest anheften, also nicht adhärent waren, so dass sie leicht durch Medium abschwemmbar waren.
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® für die Partikelgröße.
g Gramm
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten- koloniestimulierender Faktor)
GM-CSF Granulocyte-Monocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Monozyten koloniestimulierender Factor) Gy Gray (durch Radioaktivität und andere ionisierende Strahlung
verursachte Energiedosis; beschreibt die pro Masse absorbierte Energie)
h hora (lateinisch: Stunde)
Hu., hu. Human (zum Menschen gehörig)
ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
iDC immature DC (unreife dendritische Zelle(n)) IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IgG (H+L) Immunglobulin G mit schweren (heavy, H) und leichten (L) Ketten
IL Interleukin i.m. intra muskulär i.n. intra nodal i.v. intra venös
Komplexität Durchflusszytometrischer Parameter des Seitwärtsstreulichts (SSC), bezieht sich auf die morphologische Oberflächenstruktur und die Granularität der Partikel.
l Liter
m milli (x 10 )
M Molar (Mol/l)
MACS Magnetic cell sorting (Magnetiche Zelltrennung) mAK monoklonale(r) Antikörper
MBL Mannose binding lectin (Mannose bindendes Lektin) M-CSF Macrophage-Colony Stimulating Factor (Makrophagen-
koloniestimulierender Faktor)
mDC mature DC (reife dendritische Zelle(n)) ME 2-Mercaptoethanol
MEM Minimum Essential Medium (minimal essentielles Medium) MIF Membranimmunfluoreszens
MIF-Puffer Waschpuffer für die Membranimmunfluoreszenz MIP 1α, 1β Macrophage inflammatory protein (Makrophagen
inflamatorisches Protein, Mitglied der C-C-Chemokin Unterfamilie)
MoDC Monocyte derived dendritic cells (aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen)
MHC I Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) I MHC II Major Histocompatibility Complex
(Haupthistokompatibilitätskomplex) II MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute(n)
MLR Mixed leukocyte reaction (gemischte Leukozytenreaktion) MNC Mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes,
bestehen aus Lymphozyten und Monozyten) MW arithmetischer Mittelwert
N bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen
NaCl Natriumchlorid n nano (x 10-9)
Negative Selektion
Anreicherung von Monozyten aus einer MNC-Population durch die Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen im MACS.
Nr. Nummer
P Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen.
PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PE Phycoerythrin
Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen PGE2 Prosterglandin E2
PI Propidiumiodid
PMN Polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten) Positive
Selektion
Anreicherung von Monozytenaus einer MNC Population durch spezifische Antikörper im MACS.
RANTES Regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted (reguliert nach Aktivierung, normal von T-Zellen expremiert und sezerniert)
Req., req. Rekombinat hergestelltes equines Responder-
zellen
MNC eines Pferdes, die in der MLR eingesetzt werden und zur Proliferation angeregt werden.
RT Raumtemperatur
S Standardabweichung
s. siehe
s.c. subcutan
S/R-Ratio Verhältniss von Stimulatorzellen zu Responderzellen s.S. siehe Seite
sek Sekunde(n)
SI Stimulationsindex, berechnet sich aus der ermittelten absoluten Zahl der Blasten der Probe geteilt durch die absolute Zahl der Blasten der Mediumkontrolle.
sog. so genannte(r)
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® für die Komplexität der Partikel.
Stimulator- zellen
Zellpopulation (DC oder MNC), die in der MLR die Responderzellen stimulieren sollen. Durch radioaktive Bestrahlung dieser Zellen wird ihre eigene
Proliferationsfähigkeit unterbunden.
Tab. Tabelle
TCR T Cell Receptor (T-Zellrezeptor) TNF Tumornekrosefaktor
u.a. unter anderem
U-well Mikrotiterplatten-Vertiefung mit rundem Boden.
vgl. Vergleiche vs. versus (gegen)
v/v Volumen pro Volumen
well Vertiefung einer Mikrotiterplatte
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
Das equine Sarkoid ist mit Abstand der häufigste Hauttumor des Pferdes. MARTI et al.
(1993) geben an, dass es sich bei ca. 90 % aller Hauttumoren beim Pferd um equine Sarkoide handelt. Die Häufigkeit innerhalb einer Population wird mit 0,78 % (FRETZ u. BARBER 1980) bis 1 % (GERBER 1989) angegeben.
Die Fibroblastenproliferation betrifft primär die Dermis, in seltenen Fällen kann auch die Subkutis beteiligt sein (GOODRICH et al. 1998; KNOTTENBELT u. KELLY 2000).
Sarkoide zeigen nach erfolgter chirurgischer Exzision eine hohe Rezidivtendenz und stellen nicht nur ein kosmetisches Problem dar, da sie je nach anatomischer Lokalisation und Ausdehnung auch den Gebrauchswert des Pferdes erheblich mindern. Die Hautveränderungen sind, sofern es sich nicht um ulzerierende Sarkoide handelt, nicht schmerzhaft und zeigen keinen Juckreiz. Sekundärinfektionen nach Ulzeration stellen allerdings gerade in warmen Monaten eine erhebliche Komplikation dar. Die Tumore können am ganzen Körper vorkommen, treten jedoch an einigen Prädilektionsstellen wie Schenkelinnenfläche, ventrales Abdomen und an Arealen mit dünner Haut gehäuft auf.
Obwohl zahlreiche Therapieansätze bestehen, die von Chemotherapie bis hin zu homöopathischen Mitteln reichen, ist eine zufriedenstellende Therapie bei betroffenen Tieren bislang nicht bekannt; oder der Therapieerfolg nur von kurzer Dauer.
Dendritische Zellen (DC), die den Angelpunkt vieler spezifischer Immunantworten darstellen, sind in den letzten Jahren zunehmend in den Focus der Forschung gerückt, da sie eine tumorspezifische Immunantwort induzieren können. Schon 1985 konnte an Mausmodellen ein therapeutischer Effekt dendritischer Zellen auf das Wachstum von Tumoren nachgewiesen werden (KNIGHT et al. 1985). Zahlreiche Studien im humanmedizinischen Bereich schlossen sich diesem Versuch an. Die Erfolge dieser Studien sind viel versprechend, wenn auch abhängig von der Art der Neoplasien und dem Stadium der Erkrankung. Sie hängt jedoch entscheidend von der Generierung der DC des Patienten in vitro ab.
Die Separation, Charakterisierung und Generierung dendritischer Zellen aus Monozyten stellt beim Pferd allerdings noch eine große Herausforderung dar. Viele in der Humanmedizin angewandte Verfahren und Reagenzien sind leider nicht oder unbefriedigend auf das Pferd übertragbar. HAMMOND et al. (1999) und SIEDEK et al. (1997) gelang es zwar, dendritische Zellen des Pferdes aus peripheren Blutmonozyten zu generieren, allerdings führt die Methode der Monozytenseparation, neben einer unspezifischen Aktivierung durch Plastikadhärenz der Monozyten, auch zu sehr geringer Zellausbeute.
Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene Methoden der Monozytenseparation beim Pferd hinsichtlich ihrer Ausbeute, Reinheit und Selektion bzw. Voraktivierung zu erproben und ein optimiertes Verfahren der Monozytenaufreinigung zu finden. Des Weiteren galt es, die gewonnenen Monozyten in vitro zu dendritischen Zellen zu differenzieren, die Zellen phänotypisch zu charakterisieren und auf ihre Antigen präsentierende Funktion hin zu prüfen.
Damit soll ein gezielter Einsatz equiner dendritischer Zellen zur Therapie des equinen Sarkoids vorbereitet werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Das equine Sarkoid
Bei dem equinen Sarkoid handelt es sich um einen mesenchymalen Tumor des Unterhautbindegewebes mit unterschiedlich starker Beteiligung der Epidermis. Es wächst lokal aggressiv und infiltrativ, eine Metastasierung wie bei Fibrosarkomen wird jedoch nicht beobachtet, weshalb es als semimaligner Tumor klassifiziert wird (DAHME u. WEISS 1999).
Das equine Sarkoid kann isoliert oder multipel auftreten. Bei einem Drittel der erkrankten Pferde treten die Tumore multiple auf. Equine Sarkoide stellen den bei Pferden am häufigsten diagnostizierten Tumor dar. TEIFKE u. WEISS (1991) berichten, dass es sich bei 40% aller untersuchten Tumore bei Pferden um Sarkoide handelt. Dabei können Pferde unabhängig von Alter, Farbe oder Geschlecht betroffen sein. Bei Wallachen scheint es nach MOHAMMED et al. (1992) jedoch eine gewisse Häufung dieser Tumorausbildung zu geben. Dabei wird als Ursache das Trauma nach der Kastration gesehen, was sich mit der Beobachtung von RAGLAND et al. (1966) deckt, dass Sarkoide häufig an zuvor traumatisierten Stellen entstehen.
2.1.1 Das equine Sarkoid und seine Erscheinungsbilder
Anhand des klinischen Erscheinungsbildes können verschiedene Formen des equinen Sarkoids unterschieden werden. KNOTTENBELT u. KELLY (2000) sowie HAMMAN (2004) teilen die Sarkoide in 6 Typen ein, wobei sie diesen auch eine Lokalisation und ein Wachstumsverhalten zuordneten. So beschrieben sie das okkulte Sarkoid als haarlose, rauhe, leicht hyperkeratotische Hautveränderung mit Prädilektionsstelle an Kopf, Hals und Schenkelinnenfläche mit langsamem Wachstum. Als Besonderheit wird zudem angegeben, dass dieser Sarkoidtyp nach Traumatisierung besonders dazu neigt in aggressivere Formen (verrukös oder fibroblastisch) überzugehen. Das verruköse Sarkoid zeigt sich durch graue, asbestartige Hautoberfläche mit warzenartigen Veränderungen. Die Läsionen können gestielt oder sessil sein und neigen zur Ulzeration und Krustenbildung. Ihr Wachstum wird als langsam und wenig aggressiv beschrieben, solange keine Traumatisierung stattfindet.
Noduläre Sarkoide zeichnen sich als solide, subkutane oder intrakutane Knoten unterschiedlichster Größe aus, die sich häufig an Augenlidern oder Innenschenkeln lokalisieren. Die klinische Erscheinung des fibroblastischen Sarkoids wird durch sein fleischartiges Aussehen mit häufig feuchter und blutiger Oberfläche dominiert. Dieser Typ
Besonderheit stellt das von HAMANN (2004) erwähnte malevolente Sarkoid dar, da es infiltrativ in die Lymphbahn einwächst. Die betroffenen Hautareale fühlen sich strangartig und verdickt an. Von einem gemischten Sarkoid spricht man, sobald zwei Merkmale unterschiedlicher Sarkoidtypen beobachtet werden können. Dies ist häufig der Fall wenn z.B.
durch Traumatisierung eine Form in eine andere übergeht.
Abb. 1 Klinische Bilder des equinen Sarkoids
Multiple Sarkoide an der Vorderbrust (links) und am Präputium (rechts) eines Wallachs. Nach HAMMAN (2004) können die Sarkoide in verruköe und noduläre Sarkoide eingeteilt werden. An der Vorderbrust ist deutlich zu sehen, dass eine Neigung zur Ulzeration und Blutung besteht (siehe Pfeil).
MARTENS et al. (2000) untersuchte die verschiedenen Sarkoidtypen histologisch, sowie immunhistochemisch und konnte zeigen, dass epideramle Hyperplasien und Hyperkeratosen nur bei verrukösen und gemischten Sarkoiden zu finden sind. Die DNS boviner Papillomaviren sowie das Tumorsuppressorgen p53 (siehe Kapitel 2.1.2.1.1) konnte er aber in allen Typen nachweisen. In der Literatur sind noch zahlreiche andere Klassifikationen zu finden, die an dieser Stelle nicht erwähnt werden.
Differentialdiagnostisch müssen Sarkoide, je nachdem um welchen Typ es sich handelt, von Dermatophytosen, chronischen Entzündungen, Keloiden und der Habronematidose abgegrenzt werden (DAHME u. WEISS 1999). In der Regel kann eine eindeutige Diagnose anhand einer histologischen Untersuchung gestellt werden.
2.1.2 Ätiologie des equinen Sarkoids
2.1.2.1 Virusgenese durch Infektion mit bovinen Papillomaviren
Nachdem lange Zeit die Ätiologie des equinen Sarkoids ungeklärt war, wird heute eine Virusgenese als Hauptursache vermutet. TEIFKE u. WEISS (1991) konnten mittels PCR (Polymerase Kettenreaktion) die DNS des Papillomavirus (BPV 1 und BPV 2) in allen 20 untersuchten Sarkoiden nachweisen. Allerdings wurde in den benachbarten Hautregionen der Sarkoide ebenfalls Virus-DNS detektiert, ebenso wie in Hautproben gesunder Pferde, die Kontakt zu erkrankten Tieren hatten (BOGAERT et al. 2005). Die Autoren diskutieren als Erklärung hierfür neben einer Viruslatenz auch die mögliche Kontamination der Proben.
2.1.2.1.1 Klassifikation und Struktur des bovinen Papillomavirus (BPV)
Die bovinen Papillomaviren gehören zu der Familie der Papillomaviridae (VAN REGENMORTEL et al. 2000). Sie besitzen ein Genom aus einer doppelsträngigen DNS von etwa 8000 bp, die von einem ikosaedrischen Kapsid ohne Lipidhülle umgeben ist. Da Papillomaviren in der Regel eine strenge Wirts- und Gewebespezifität besitzen, wird der Wirt in die Papillomvirus-Nomenklatur miteinbezogen (z.B. HPV für humane Papillomaviren, BPV für bovine Papillomaviren). Die bovinen Papillomaviren werden zudem weiter unterteilt in sechs Typen (BPV 1 bis 6). Die Gewebespezifität bezieht sich auf epitheliale Strukturen.
Das heißt, dass eine Infektion fast ausschließlich in teilungsaktiven Zellen der Haut oder Schleimhaut stattfindet (CAMPO 1997). Eine Ausnahme in der Wirts- und Gewebspezifität stellt allerdings das Pferd dar, bei dem sowohl ein dermaler als auch ein epidermaler Anteil der Haut betroffen ist.
Die Genprodukte der Viren werden nach ihren Synthesezeitpunkten während der produktiven Phase der Infektion eingeteilt in frühe (E, „early“) oder späte (L, „late“) Proteine. Die frühen Gene kodieren die Nicht-Strukturproteine E1, E2, E4, E5, E6 und E7. Sie spielen bei der Replikation und Transkription der viralen DNS eine Rolle. Die Proteine E5, E6 und E7 schaffen dabei die Voraussetzung für die Virusvermehrung, indem sie das Zellwachstum stimulieren. Dieser Mechanismus scheint eine essentielle Rolle bei der Entstehung von Neoplasien zu haben. E6 kann zudem an das Tumorsuppressorgen p53 (LIVINGSTONE et al.
1992) binden und somit dessen Kontrollfunktion für das Zellwachstum aufheben. Gleiches gilt für das E7 Protein welches an das Tumorsuppressorgen p105 binden kann und es in seiner Funktion hemmt. Beide Proteine (E6 und E7) werden deshalb als Onkoproteine bezeichnet.
Die späten Proteine L1 und L2 kodieren Strukturproteine der Virushülle.
2.1.2.1.2 Hinweise für eine virale Pathogenese des equinen Sarkoids
In Gewebeschnitten von equinen Sarkoiden konnte virale DNS des BPV in den dermalen Schichten des Tumors nachgewiesen werden, allerdings nicht in den epithelialen Zellen (TEIFKE 1994). NASIR u. REID (1999) wiesen zwar ebenfalls die viralen Transkriptions- faktoren E2, E5 sowie die viralen Onkoproteine E6 und E7 in entfernten Sarkoiden nach, konnten aber nie infektiöses Virus finden. Sie stellten die Hypothese auf, dass Sarkoide in dem Stadium der fibroblastischen Proliferation verharren, wie sie in der Frühphase bei bovinen Papillomen anzutreffen ist und eine produktive Virusinfektion in dem fremden Wirt Pferd nicht stattfinden kann. Dem Transformationsprotein E5, welches CHAMBERS et al.
(2003) in Sarkoiden von Pferden aus Großbritannien und der Schweiz nachweisen konnte, wird in der Pathogenese des Sarkoids zudem eine besondere Bedeutung beigemessen, da es die MHC-I Expression auf infizierten Zellen herunter reguliert (CHAMBERS et al. 2003b).
BOGAERT et al. (2005) konnten allerdings auch in der Haut gesunder Pferde virale DNS des BPV nachweisen. Danach scheint eine Infektion mit BPV nicht die einzige Voraussetzung zur Entstehung eines Sarkoids zu sein.
2.1.2.2 Immunologische Faktoren
Bei der Betrachtung innerhalb großer Pferdebestände fällt auf, dass nur einige der Tiere trotz gleicher Haltungsbedingungen Tumore ausbilden. Um dieses Phänomen zu erklären wurde das Immunsystem erkrankter Pferde, insbesondere der Major Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) sowie bestimmte Equine-Leukozyten-Antigene (ELA) genauer untersucht.
LAZARY et al. (1994) und MEREDITH et al. (1986) konnten einen Zusammenhang zwischen der Erkrankung an equinem Sarkoid und bestimmten ELA-Loci I und II zeigen.
Zunächst typisierten LAZARY et al. (1985) ELA von insgesamt 55 schweizerischen und 17 französischen Warmblutpferden, sowie von 24 Irish Huntern. Dabei konnten sie zeigen, dass der ELA-Haplotyp W3 bei Pferden mit equinen Sarkoiden gehäuft zu finden war, und zwar immer in Verbindung mit dem Haplotyp B1. Später zeigten LAZARY et al. (1994) einen Zusammenhang zwischen dem ELA-Klasse II Allotyp DW13 und dem Auftreten von Sarkoiden sowie dem Klasse I Allotyp A3. Trotz dieser Beobachtungen darf aber nicht außer Acht gelassen werden, dass der überwiegende Teil der Pferde mit diesen Haplotypen gesund ist. Sie sind aber als wichtige Hinweise auf eine mögliche Prädisposition zu sehen.
2.1.3 Therapie des equinen Sarkoids
Bisher stehen zur Therapie des equinen Sarkoids zahlreiche Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, die allerdings leider meist unzureichend effektiv sind. Man kann dabei vier verschiedene Gruppen aufgrund des Wirkungsmechanismus unterscheiden.
Zur ersten Gruppe gehören die Methoden, die durch Hitze, Kälte oder andere Faktoren physikalisch die Tumorzellen zerstören sollen. Dazu zählen die Kryochirugie, die chirurgische Extirpation, das Abbinden der Tumore, die Kauterisierung, Lasertherapie, Hyperthermie oder Radiotherapie. Gruppe zwei umfasst die Immunostimulanzien wie BCG (Bacillus Calmette Guerin), Zylexis® sowie eine Autovakzine aus entferntem Tumormaterial.
Gruppe drei stellt die Chemotherapie mit verschiedenen Zytostatika (z.B. Cysplatin, 5- Fluorouracil, Xanthatverbindungen) dar und Gruppe vier beinhaltet eine Vielzahl homöopathischer Therapiemöglichkeiten. Wegen der Vielzahl der therapeutischen Verfahren werde ich hier nur auf die gängigsten Behandlungswege jeder Gruppe näher eingehen.
Innerhalb der physikalischen Therapie stellt die chirurgische Entfernung des Sarkoids das meist verwendete Verfahren dar. Häufig stellen Nahtdehiszenzen oder Infektionen störende Komplikationen dar, die von einigen Autoren auch als Auslöser für Rezidive gehalten werden. Bei alleiniger chirurgischer Entfernung wird von einer Rezidivrate von 50%
ausgegangen (DIETZ u. HUSKAMP 1999). Aus diesem Grund wird von vielen Autoren eine Kombination mehrerer Methoden befürwortet.
Die Kryochirugie basiert auf extremer Kälte und führt zur Zerstörung von Zellstrukturen durch Dehydration und Kristallbildung. Dieser Effekt soll dazu ausgenutzt werden transformierte Zellen abzutöten. Als Kältequelle wird in der Medizin meist flüssiger Stickstoff verwendet, der mittels Spray oder Sonde auf das veränderte Gewebe aufgebracht wird. LANE (1977) rät dabei zu einer Prüfung der im Tumor erreichten Temperatur zur Überwachung des Therapieerfolges. Die Rezidivrate liegt bei dieser Behandlungsform bei ca.
30% (JOYCE 1975; JOYCE 1976).
Die Lasertherapie wird aufgrund des notwendigen Instrumentariums nur in wenigen Kliniken durchgeführt. Meist findet ein CO2- Laser bei der Therapie von Sarkoiden Einsatz. Er zeichnet sich durch gleichzeitiges schneiden und verdampfen von Gewebe aus. Dabei soll, wie bei der Kryotherapie auch, eine Zerstörung transformierter Zellen erfolgen.
Die Immuntherapie verfolgt das Ziel, den Organismus in die Lage zu versetzen den Tumor selbstständig zu eliminieren. Dabei werden entweder unspezifische Abwehrmechanismen
Bei BCG (Bacillus Calmette Guerin) handelt es sich um einen abgeschwächten Impfstamm von Mycobacterium bovis. LAVACH et al. (1985) beschreibt BCG als Potentiator des Immunsystems. Der Impfstoff soll bei lokaler Applikation zu einer unspezifischen, zellulären, sowie zu einer spezifischen, humoralen Immunantwort führen (MURPHY et al. 1979). Die zelluläre, unspezifische Immunantwort basiert dabei hauptsächlich auf der Aktivierung von Makrophagen. Durch Freisetzung zytotoxischer Sauerstoffradikale und ihrer proteolytischen Kapazität schädigen sie die Tumorzellen direkt (LAVACH et al. 1985; VANSELOW et al.
1988) oder führen über eine Aktivierung von T-Zellen zu einer Zerstörung der Tumorzellen.
LAVACH et al. (1985) konnte nach einer Impfung mit BCG Antikörper gegen tumorassoziierte Antigene nachweisen, die vermutlich nach Lyse der Tumorzellen freigesetzt wurden. Dies würde auch erklären, weshalb auch unbehandelte Sarkoide an demselben Tier teils Regressionen zeigen (WEBSTER u. WEBSTER 1985). Die beschriebenen Behandlungserfolge variieren in der Literatur zwischen 100% (LAVACH et al. 1985;
WEBSTER u. WEBSTER 1985) und 59% (VANSELOW et al. 1988) Eine Kombination von chirurgischer Entfernung und BCG wird empfohlen, um die Rezidivrate zu senken (KLEIN et al. 1986).
Eine autologe Vakzine kann aus patienteneigenem Tumormaterial gewonnen werden. Es handelt sich dabei um ein Verfahren, welches in der Humanmedizin unter dem Namen APSI (aktivierte patientenspezifische Immuntherapie) bekannt ist und welches auf das Pferd übertragen wurde. Dafür wird eine Mindestmenge von 1g Tumor benötigt, welcher dem Tier steril entnommen werden muss. Das Tumorgewebe wird mittels einer speziellen Technik zerkleinert und die löslichen Komponenten der Zellmembranen polymerisiert. Auf diese Weise sollen die Zellwandbestandteile Antigencharakter erhalten. In einer Studie, die KINNUNEN et al. (1999) durchführten, wurde mit dieser Behandlung bei elf von zwölf Pferden mit primären Sarkoiden und bei fünf von neun Pferden mit rezidivierenden Sarkoiden eine Tumorfreiheit erzielt.
Basierend auf der Hypothese, dass equine Sarkoide durch eine Infektion mit BPV verursacht werden, wurde von MATTIL-FRITZ (2002) eine therapeutische Vakzine auf Basis der Virusproteine erprobt. Sie stellte BPV 1 chimäre Virus-ähnliche Partikel (BPV 1-CVLPs) her, die aus dem C-terminal verkürzten Hauptkapsidprotein L1 und Teilen des E7-Proteins von BPV 1 bestehen. Diese wurden dann in einer nicht Placebo-kontrollierten klinischen Phase I- Studie bei zwölf Pferden mit equinen Sarkoiden getestet. Bei zwei Tieren wurde durch die Immunisierung eine Verbesserung des klinischen Zustandes erzielt, bei einem Tier konnte zwar die Regression von fünf Sarkoiden beobachtet werden, drei davon rezidivierten jedoch wieder. Fünf weitere Tiere zeigten gleichzeitig sowohl eine Tumorregression, als auch das
des klinischen Zustandes, bei zwei weiteren konnte das Wachstum vorhandener Sarkoide bzw. die Neubildung equiner Sarkoide beobachtet werden. Nach dreimaliger Applikation der Vakzine konnten bei elf der zwölf Pferde L1-spezifische Antikörper und bei fünf der Tiere Antikörper gegen das E7-Protein nachgewiesen werden. Da allerdings für eine effektive
„antitumorale Vakzine“ insbesondere die zelluläre Immunantwort eine wesentliche Rolle spielt, wurde von GUTMANN (2005) ein Verfahren erprobt, mit dessen Hilfe sie die durch die CVLPs induzierten, antigenspezifischen, zytotoxischen T-Zellreaktionen messen wollte.
Ein Nachweis über IFNγ von CD8+ T-Zellen mit Spezifität für BPV 1 L1 und E7 gelang ihr allerdings nicht.
Die Therapie des equinen Sarkoids mittels Zylexis® (ehemals Baypamun) wurde von STUDER et al. (1997) in einem Doppelblindversuch mit 10 Pferden untersucht. Lediglich bei drei Pferden, die Zylexis® (Baypamun®) erhielten konnte eine Verbesserung in Form einer Tumorregression gesehen werden, während aus der Kontrollgruppe, die mit Placebos behandelt wurden, fünf Tiere eine Regression zeigten. Dies führt zu dem Schluss, dass es sich um spontane Regressionen gehandelt hat und Zylexis® (Baypamun®) zumindest als alleinige Therapie nicht empfehlenswert ist.
Zu den Chemotherapeutika, die in der Sarkoidtherapie zum Einsatz kommen, gehören die Zytostatika Cisplatin und 5-Fluorouracil. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um sogenannte Antimetaboliten, welche natürliche Metaboliten verdrängen und damit lebenswichtige Stoffwechselprozesse blockieren. Sie finden meist als Implantate ihren Einsatz, da so eine kontinuierliche Abgabe des Wirkstoffes erreicht werden kann. Aber auch Salben (5-Fluorouracil, Efudix®) und Emulsionen mit den Wirkstoffen finden ihren Einsatz.
THEON et al. (1993) behandelte 19 Pferde mit Sarkoiden mit einer intratumoralen Applikation einer Cisplatin-Ölemulsion viermal im Abstand von zwei Wochen. Eine komplette Tumorregression konnte so bei 18 der Tiere erreicht werden. Dabei blieben 87%
der Tiere über ein Jahr tumorfrei. STEWART et al. (2006) untersuchte den therapeutischen Effekt einer intratumoralen 5-Fluorouracil Injektion. Dabei konnte bei 9 von 13 Pferden eine Regression der Sarkoide erzielt werden, die nach 3 Jahren noch immer bestand.
Auch die Homöopathie nimmt in der Tumorbekämpfung eine wichtige Stellung ein und wird meistens als Unterstützung des Immunsystems therapiebegleitend eingesetzt. Aufgrund der Vielfalt an Möglichkeiten soll an dieser Stelle aber nur ein kleiner Teil vorgestellt werden.
Unter anderem finden Substanzen wie Arsenicum album, Silicea, Thuja und Tarantula cubensis ihre Anwendung zur Therapie des equinen Sarkoids. Andere schwören auf die Behandlung der Sarkoide mit handelsüblicher Zahnpasta. Einheitliche Angaben zu
Erfolgsraten dieser Therapieformen sind in der Literatur allerdings nicht zu finden, da die Präparate zum Teil für jeden Patienten individuell kombiniert werden.
Zusammenfassend kann man sagen, dass es eine Vielzahl an therapeutischen Ansätzen für die Behandlung des equinen Sarkoids gibt. Leider werden allerdings nicht immer die gewünschten Erfolge bei der Behandlung erzielt, grade wenn die Tumore multiple an verschiedenen Körperstellen auftreten. Außerdem stellen die Kosten oder Nebenwirkungen der Therapieformen oft einen limitierenden Faktor dar. Eine Therapieform, die zuverlässige und nachhaltige Tumorregressionen liefert, bezahlbar ist und ohne gravierende Nebenwirkungen bei dem Patienten bleibt, steht demnach noch nicht zur Verfügung.
2.2 Die Rolle des Immunsystems in der Tumorbekämpfung
2.2.1 Bekämpfungsstrategien des Immunsystems
In jedem Organismus entarten täglich einige Zellen durch unterschiedlichste Einflüsse chemischer, physikalischer oder viraler Natur zu potentiellen Krebszellen. Doch das Immunsystem ist meist in der Lage diese zu erkennen und rechtzeitig zu vernichten, noch ehe es zur Ausbildung von Tumoren kommt. Dabei spielen sowohl angeborene wie auch adaptive
„erworbene“ Immunmechanismen eine wichtige Rolle. Zu den unspezifischen Komponenten zählen u.a. das Komplementsystem, neutrophile Granulozyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen. Sie ermöglichen schnelle, „sofortige“ Reaktionen des Immunsystems auf eine Vielzahl von körperfremden Strukturen wie Mikroorgansimen, insbesondere aber auf die Entstehung „unerlaubter“ körpereigener Strukturen wie entartete Zellen oder durch Noxen veränderte „Selbststrukturen“. Natürliche Killerzellen töten zum Beispiel jede Zelle, die sie aktiviert und kein eigenes MHC-I Molekül auf der Oberfläche trägt. Ein Umstand, den man bei vielen Tumorzellen findet und der nach CHAMBERS et al. (2003b) durch das Transformationsprotein E5 auch bei equinen Sarkoiden anzutreffen ist.
Erworbene oder adaptive Immunreaktionen werden hauptsächlich von Lymphozyten ausgeführt, die „antigenspezifisch“ auf eine bestimmte Struktur, ein Antigen, präziser aber auf ein Teil eines Antigens, ein Epitop, reagieren können. B-Lymphozyten tragen dazu durch die Synthese und Freisetzung antigenspezifischer (präziser: Epitop-spezifischer) Antikörper bei, während T-Lymphozyten sich selbst in unterschiedliche zelluläre Immunreaktionen einbringen. So sind sie in der Lage „unerlaubt“ veränderte körpereigene Zellen, sei es ducrh
Fehldifferenzierung, Alterung oder maligne Transformation aber auch durch intrazelluläre Infektionen von Viren, Bakterien, Parasiten bedingt zu erkennen und zu eliminieren.
2.2.1.1 T-Zellaktivierung
Naive T-Zellen, die durch die Lymphknoten wandern, binden vorübergehend an Adhäsionsmoleküle (bspw. CD50, CD54, CD58) auf professionellen, antigenpräsentierenden Zellen (insbesondere dendritische Zellen und aktivierte B-Lymphozyten). Die Bindung wird jedoch erst gefestigt, sobald sie ihren spezifischen MHC-Peptidkomplex durch ihren T- Zellrezeptor erkannt haben. Innerhalb der T-Zellpopulationen sind zwei Hauptgruppen zu differenzieren, die sich durch ihre Corezeptoren unterscheiden. CD8 positive (CD8+) T- Zellen werden in ihrer aktivierten Form als zytotoxische T-Zellen bezeichnet, während CD4 positive (CD4+) T-Zellen in ihrer aktivierten Form auch T-Helferzellen genannt werden. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Interaktion mit MHC-I und MHC-II- Molekülen.
Während CD8+ Zellen mit MHC-I interagieren, erkennen CD4+ Zellen Antigene, welche von MHC-II Molekülen präsentiert werden. Dabei ist zu beachten, dass MHC-I von allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert wird, wohingegen MHC-II „normalerweise“ nur auf antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen, Monozyten und B-Zellen zu finden ist.
Für eine klonale Expansion und Differenzierung der T-Zellen zu Effektorzellen ist neben der Erkennung des MHC-Peptidkomplexes noch ein zweites, costimulierendes Signal essentiell, ohne welches sie sonst in Anergie fallen würden. Zu diesen essentiellen, costimulatorischen Molekülen gehören die Moleküle CD80 und CD86, welche von antigenpräsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen, exprimiert werden. Die costimulatorischen Signale interagieren mit dem CD28-Molekül der T-Zellen und führen dort u.a. zur Expression von Zytokinrezeptoren (wie den Rezeptor für Interleukin-2: IL-2R) sowie zur Bildung von Zytokinen wie bspw. Interleukin-2 (IL-2), welches wiederum zur Differenzierung und Proliferation der T-Zellen benötigt wird. Die durch eine solche Sequenz von Rezeptor- Ligand-Interaktionen stimulierten T-Zellen werden nun als aktivierte T-Zellen bezeichnet, die nun keine Costimulation mehr benötigen, sondern bei Erkennung ihres MHC-Peptid- Komplexes direkt ihre Effektorfunktion ausüben können.
Aktivierte CD8+ T-Zellen können z.B. Zellen im Körper erkennen, die den entsprechenden MHC-I-Peptid-Komplex auf der Oberfläche tragen und lysieren diese. CD4+ T-Zellen können, abhängig von den Signalen und dominierenden Zytokinen während ihrer Aktivierung, zu Th-1 oder zu Th-2-Zellen differenzieren: Dominieren in der unmittelbaren
sie sich in eine Th1-Zelle weiter entwickeln, während eine Dominanz an IL-4 die Entwicklung zur Th2-Zelle fördert. Aktivierte CD4+ T-Zellen exprimieren den CD40 Ligand (CD40L = CD154) und übermitteln ein Stimulierungssignal auf CD40-positive dendritische Zellen. Diese CD40-40L-Interaktion verstärkt die Funktion der dendritischen Zelle, die sich wiederum in einer erhöhten Expression kostimulatorischer Moleküle (CD80 und CD86), MHC- und Adhäsionsmoleküle sowie der Sekretion von IL-12 äußert (SCHOENBERGER et al. 1998; TOES et al. 1998). Diese dendritischen Zellen sind optimal in der Lage, antigenspezifische CD8+ T-Zellen zu induzieren. Zusätzlich moduliert das sezernierte IL-12 die Entwicklung der CD4+ T-Zellen in Richtung einer Th-1-Immunantwort. Dieses Zwei- Stufen-Modell der T-Zellaktivierung erklärt, warum eine CD4+-T-Helferantwort für eine zytotoxische T-Zellantwort notwendig ist: CD4+ T-Zellen stimulieren erst über CD40L die DC, die dann wiederum CD8+ T-Zellen effektiv stimulieren können.
Bei der Bekämpfung transformierter Tumorzellen kommt den T-Zellen somit eine wichtige Rolle zu. Sie erkennen tumorassoziierte Antigene und vermögen im Falle der zytotoxischen T-Zelle die Tumorzellen direkt zu lysieren. Voraussetzung dafür ist allerdings ein MHC- Peptid-Komplex auf der Tumorzelle, der erkannt werden kann und nicht als „erlaubtes“ Selbst registriert wird.
2.2.1.2 Tumorantigene
Tumorzellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Antigene, die im Normalgewebe der Umgebung nicht vorkommen. Man bezeichnet sie generell als tumorassoziierte Antigene (TAA). Man kann bei diesen Antigenen aufgrund ihrer Herkunft fünf Klassen unterscheiden.
Die erste Klasse stellen tumorspezifische Antigene dar, die spezifisch in einem bestimmten Tumor hochreguliert werden und aus mutierten Proteinen (z.B. Enzymen) bestehen. Eine zweite Klasse stellen die embryonalen Antigene dar, die während der Embryonalentwicklung exprimiert werden, später wieder verschwinden, und nur nach maligner Transformation der Zelle wieder auftauchen, wie z.B. das CEA (Carzino- embryonales Antigen). Eine dritte Klasse bilden Differenzierungs-Antigene, die sich aus der Gewebeherkunft des Tumors ableiten, beispielsweise Tyrosinase in Melanomen. Oncogene und Tumorsuppressorproteine gehören zu einer weiteren Antigen-Klasse, bei der bestimmte Epitope Immunantworten induzieren können. Virusprodukte wie z.B.
Hüllproteine des Virus, repräsentieren in viral induzierten Tumoren die fünfte Klasse der möglichen tumorassoziierten Antigene.
Werden nun tumorassoziierte Antigene (TAA) von aktivierten T-Zellen erkannt, treten sowohl zelluläre als auch humorale Mechanismen der Immunkontrolle in Kraft. Beide Mechanismenbereiche sind funktionell miteinander verbunden und regulieren sich gegenseitig. Zum einen werden CD4+ und CD8+T-Zellen spezifisch durch antigenpräsentierende Zellen stimuliert und andererseits produzieren aktivierte B- Lymphozyten Antikörper gegen das Antigen. Beide Mechanismen führen zu einer Immunantwort gegen die transformierte Zelle und letztlich zu deren Lyse. Im Fall der CD8+T-Zellen werden die Tumorzellen direkt lysiert (zytotoxische T-Zellen), während über die Bindung von Antikörpern an das TAA natürliche Killerzellen und Makrophagen die Zelllyse induzieren (antibody dependent cellular cytotoxicity: ADCC).
2.2.2 Escapemechanismen von Tumorzellen
Trotz eines in der Regel gut funktionierenden Immunsystems entkommen Tumorzellen dennoch der Immunüberwachung und es kommt zur Ausbildung von Tumoren. Die dafür verantwortlichen Mechanismen werden als „tumor escapemechanismen“ bezeichnet und stellen einen wichtigen Forschungsschwerpunkt dar, da nur bei Kenntnis des jeweiligen Escapemechanismus geeignete und effektive Therapien möglich sind. KUMAR u. PENNY (1982) teilen die zugrunde liegenden Mechanismen in vier Kategorien ein. Die erste stellt die schwache oder fehlende Immunogenität des Tumors dar, die zweite wird durch Immunsuppression durch Tumorantigene verursacht, die dritte Kategorie beinhaltet die Induktion von Suppressorzellen und die vierte die Produktion immunsupressiver Faktoren durch den Tumor. Die meisten Tumore bedienen sich mehrerer dieser Mechanismen parallel zueinander.
Einer der Wege wie transformierte Zellen der Immunabwehr entgehen ist die Oberflächenexpression ihrer MHC-Moleküle zu reduzieren. So verhindern sie das 1. Signal, welches für eine T-Zelle zur Erkennung und zur Aktivierung benötigt wird. Ein Beispiel hierfür ist die reduzierte Expression von MHC-I-Molekülen auf Zellen des equinen Sarkoids (CHAMBERS et al. 2003b). Durch Selektion durch das Immunsystem können außerdem auch die Mengen an präsentierten Tumorantigenen soweit reduziert werden, dass überlebende Tumorzellen nicht mehr von T-Zellen erkannt werden. Ein weiterer Mechanismus stellt eine gewisse Resistenz der Tumorzellen gegen die T-Zell vermittelte Zelllyse dar. Sie erreichen das, indem sie z.B. die Oberflächenexpression des Fas-Rezeptors (CD95) reduzieren. Andere Tumorzellen erhöhen die Expression des Fas-Liganden (CD95L = CD178), was zu einer Apoptoseinduktion auf Fas-tragenden T-Zellen führen kann (TADA et al. 2003; WADA et al.
verhindert werden, wobei eine CD58 Interaktion als ursächlich für die Protektion angenommen wurde (DANIEL et al. 1999). Eine weitere Möglichkeit des Tumors dem Immunsystem zu entkommen, stellt die Sekretion immunsuppressiver Proteine oder Zytokine (z.B. TGF-β, IL 10) dar. MENETRIER-CAUX et al. (2001) konnten zeigen, dass einige Tumorzellen IL6 und M-CSF synthetisieren und somit die Differenzierung von CD34+
Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen hemmen. Diese Blockade der DC-Entwicklung ließ sich in vitro durch Stimulation der DC mit IL4 aber umgehen. RENKVIST et al. (2001) beschreibt zudem die Problematik, dass es sich bei den meisten TAA um Antigene aus dem eigenen genetischen Repertoire handelt, wie es z.B. bei den embryonalen Antigenen der Fall ist. Da solche Strukturen im Prinzip „erlaubt“ körpereigen sind, da sie in einer frühen Entwicklungsphase physiologische exprimiert werden, und autoreaktive T-Zellen im Thymus negativ selektioniert werden, ist somit auch eine Erkennung alleine nicht möglich. Auch das von Tumoren gebildete angionesische Zytokin „Vascular endothelial growth factor“ (VEGF), übt einen inhibitorischen Effekt auf die T-Zell-Stimulation durch DCs aus (LAXMANAN et al. 2005).
2.3 Dendritische Zellen
Die ersten dendritischen Zellen (DC) wurden 1868 von Paul Langerhans in der Epidermis der Haut entdeckt, und anfangs für Zellen des Nervensystems gehalten. Die wirkliche Funktion dieser Zellen blieb allerdings lange unbekannt. STEINMAN et al. (1975) entdeckten 1975 eine bis dahin unbekannte Zellpopulation in der Milz von Mäusen, die sie ebenfalls als dendritische Zellen bezeichneten. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, dass diese dendritischen Zellen aus Knochenmarksvorläuferzellen hervorgehen und in allen lymphoiden und vielen nicht lymphoiden Geweben von Säugern und Nagern vorhanden waren (CROWLEY et al. 1989; HART u. FABRE 1981b). Noch wurde aber keine Verbindung mit den von Paul Langerhans entdeckten Zellen hergestellt und beide Zellpopulationen wurden getrennt voneinander untersucht.
Erst später zeigte sich, dass beide Zelltypen zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen gehören, und dass Langerhanszellen aus der Haut in vitro zu maturen dendritischen Zellen mit starkem stimulatorischem Potential ausgereift werden können (SCHULER u.
STEINMAN 1985). Dass diese Zellen eine zentrale Rolle für die Induktion einer Immunantwort einnehmen, konnten BOOG et al. (1988); HEUFLER et al. (1988) und STEINMAN et al. (1988) zeigen. KNIGHT et al. (1985) entdeckte, dass dendritische Zellen eine zentrale Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren bei Mäusen spielen.
2.3.1 Subpopulationen dendritischer Zellen
Bei dendritischen Zellen handelt es sich um eine sehr heterogene Zellgruppe, die sich in ihrer Lokalisation, der Expression unterschiedlicher Oberflächenmoleküle und in ihrer Funktion unterscheiden (LIPSCOMB u. MASTEN 2002; SHORTMAN 2000; SHORTMAN u. LIU 2002).
Die erste Einteilung der DC wird über ihre Abstammung vorgenommen. So kann man zunächst zwischen myeloider und lymphoider Abstammung der DC unterscheiden. Aus pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks gehen zwei Vorläuferzelltypen hervor, die myeloiden Stammzellen (CD11c+) und die lymphoiden Stammzellen (CD11-). Aus den myeloiden Vorläuferzellen gehen u.a. Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten hervor.
KIERTSCHER u. ROTH (1996) und ROMANI et al. (1996) konnten zeigen, dass aus den CD14+Monozyten des peripheren Blutes unter Zusatz von GM-CSF und Interleukin 4 (IL4) dendritische Zellen generiert werden können (MoDC). FEAU et al. (2005) beschreiben auch den Einsatz von IL15 anstelle von IL4, wobei sie jedoch zeigen konnte, dass mit IL15 generierte DC kaum in der Lage sind IL12 zu produzieren, was ihre stimulatorische Kapazität allerdings nicht beeinflusst (PULENDRAN et al. 2004). Direkt aus den CD34+ Zellen des Knochenmarks können ebenfalls dendritische Zellen gezüchtet werden (INABA et al. 1992;
SHORTMAN u. CAUX 1997). Dabei stellte sich heraus, dass aus CD34+ Zellen zwei DC- Subpopulationen entstehen können: die epidermalen Langerhanszellen und die interstitiellen DC. Die interstitiellen DC befinden sich in fast allen Organen (z.B. in Herz, Leber, Niere, Pankreas, Darm, Haut, Urogenitaltrakt, Schilddrüse) (HART u. FABRE 1981a). Diese Zellen zeigen einige Gemeinsamkeiten mit DC, die aus Monozyten differenziert wurden (KELLER 2001). CAUX et al. (1997) postulierten, dass nur interstitielle DC direkt B-Zellen zur Antikörpersynthese stimulieren können.
Aus den lymphoiden, CD11- Vorläuferzellen gehen u.a. die B- und T-Lymphozyten hervor.
ARDAVIN et al. (1993) nimmt an, dass dendritische Zellen und T-Zellen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle entstehen können. Diese DC werden auch als plasmazytoide DC bezeichnet und finden sich vor allem in den T-Zell-Regionen lymphatischer Organe (STROBL et al. 1998). Ein wichtiger funktioneller Unterschied zwischen plasmazytoiden DC (pDC) und MoDC wird in der Expression unterschiedlicher Toll-like-Rezeptoren (TLR) gesehen. So sollen MoDC die TLR 2, 3, 4 und 5 exprimieren, während pDC die TLR 7, 8 und 9 tragen (HOCHREIN et al. 2002). Neuere Untersuchungen konnten jedoch zeigen, dass sich CD8+ und CD8- dendritische Zellen sowohl aus myeloiden, als auch aus lymphoiden Vorläuferzellen generieren lassen (DEL HOYO et al. 2002). Dies zeigt, dass es sich bei der
Einflüsse und Ursachen noch nicht abschließend bekannt sind. Einige der Differenzierungswege sind in Abb.2 dargestellt.
Abb. 2 Herkunft und Charakterisierung der DC-Populationen
Myeloide und lymphoide DC können von CD34+ Vorläuferzellen des Knochenmarks und von Blut- Vorläuferzellen abgeleitet werden. Dafür sind verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und Zytokinen wie GM-CSF, TNF-α, IL-4, IL15 oder IL-3 erforderlich. Der Übersicht halber sind nur die gängigsten Differenzierungswege dargestellt; es bestehen aber durchaus Vernetzungen zwischen lymphoiden und myeloiden Zellen.
2.3.2 Lebenszyklus dendritischer Zellen
Als antigenpräsentierende Zellen unterlaufen dendritische Zellen einen wohl definierten Lebenszyklus, in dessen Verlauf sich sowohl morphologische als auch funktionelle Änderungen vollziehen. In jedem Stadium ihrer Entwicklung üben DC eine charakteristische Funktion aus, die bei der Wahl der zu verwendenden DC zu unterschiedlichen therapeutischen Zwecken, zu berücksichtigen ist. Auch die verschiedenen Subpopulation sind bei der Auswahl zu berücksichtigen (LIU et al. 2005). So wäre es offensichtlich ein fataler Fehler, würde man immun-toleranz-induzierende DC für die Tumortherapie einsetzen. Nur genaue Kenntnis des DC-Reifungszustandes kann hier prophylaktisch wirksam sein.
2.3.2.1 Rekrutierung von DC
Frisch gebildete, sogenannte unreife (oder immature iDC) DC wandern vom Knochenmark durch den Blutstrom in nicht lymphatische Gewebe ein. Dort werden einige zu ortsansässigen DC z.B. durch Interaktion mit E-Cadherin bei Langerhanszellen (CAUX et al. 2000), während der größte Teil weiterwandert. Es befindet sich stets eine relativ konstante Zahl von DC in der Blutbahn. Dies gewährleistet, dass sie bei Anwesenheit eines Antigens schnell zum Ort der Noxe wandern können. Dafür müssen sie vom Endothel des Blutgefässes in das betreffende Gewebe gelangen, was die Interaktion mit verschiedenen Selektinen, Chemokinen und Integrinen erfordert (DEL et al. 2006). ROBERT et al. (1999) konnten zeigen, dass E- und P- Selektine bei der Migration durch das Endothel notwendig sind. Dass Metalloproteasen für den Weg durch das Endothel von Bedeutung sind, konnte ebenfalls bewiesen werden (CAUX et al. 2000). Dabei wurde auch festgestellt, dass verschiedene inflammatorische Chemokine unterschiedliche DC-Subtypen rekrutieren können (CAUX et al. 2000). Unreife DC exprimieren z.B. die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR5, welche die Rezeptoren für einige inflammatorische Chemokine wie z.B. MIP-1α („macrophage inflammatory protein“), MIP- 1β und RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted) darstellen. Nach Reifeinduktion werden diese Chemokinrezeptoren wieder herunterreguliert und CCR7 wird exprimiert (COATES et al. 2004). Dieser Rezeptor erkennt Chemokine, welche in lymphoiden Organen produziert werden und sorgt dafür, dass die DC nach Antigenaufnahme die inflammatorischen Gebiete wieder verlassen können.
2.3.2.2 Antigenaufnahme
In den meisten Geweben liegen DC in ihrer unreifen Form vor, in der sie kaum T-Zell- stimulatorische Kapazität aufweisen, dafür aber sehr effektiv Antigene aufnehmen können.
Dies kann durch Makropinozytose, rezeptorvermittelte Endozytose oder Phagozytose vonstatten gehen. Durch Makropinozytose können von DCs bis zu 3µm große Vesikel aufgenommen werden, während andere Zellen nur Moleküle bis zu 1µm Durchmesser aufnehmen können. Die rezeptorvermittelte Endozytose erfordert die Bindung eines Antigens an einen Rezeptor auf der DC. Dafür exprimieren DC z.B. Fc-Rezeptoren (BAJTAY et al.
2006; SALLUSTO et al. 1995), das Mac-1-Molekül (CD11b/CD18-Komplex), CD14 (RESCIGNO et al. 1999), den Mannoserezeptor, DEC-205 (JIANG et al. 1995; SALLUSTO et al. 1995; TAN et al. 1997) und eine Reihe von Toll-like-Rezeptoren (TLR) (MEDZHITOV 2001). Über Fc-Rezeptoren werden Antigene aufgenommen, die an Antikörper gebunden haben. Der Rezeptor erkennt dabei den Fc-Teil des Antikörpers. Mac-1 befindet sich dagegen in intrazellulären Vesikeln der DC und wird erst nach einem Chemokinsignal an die
Zelloberfläche transportiert. Dort fungiert das Molekül als Rezeptor für die Komplementkomponente C3b und initialisiert die Phagozytose komplementgebundener Bakterien. Der Mannose-Rezeptor zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Karbohydraten aus und ist daher für die Internalisierung von mannosylierten Proteinen von Bedeutung. CD14 gilt als Rezeptor für den Komplex aus Lipopolysaccharid (LPS, Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien) und lipopolysaccharidbindendem Protein (LBP). Die Toll-like- Rezeptoren 2 und 4 (TLR2 und TLR4) konnten ebenfalls als Rezeptoren für LPS identifiziert werden (POLTORAK et al. 1998; VISINTIN et al. 2001; YANG et al. 1998). Diese Rezeptoren gehören der Familie der Transmembranrezeptoren Typ I an, von denen mittlerweile eine ganze Reihe beim Menschen identifiziert werden konnten. Jeder TLR hat dabei seine spezifischen Liganden und löst bei Bindung eine spezifische Immunantwort aus (MEDZHITOV 2001, THOMA-USZYNSKI et al. 2000). Werden DC z.B. über den TLR-2 aktiviert, sezerinieren die Zellen das IL12 inhibierende Homodimer p40, was eine Th2 polarisierte Immunantwort unterstützt, während eine Aktivierung der DC über TLR-4 zur Sekretion von IL12 und IFNγ und einer damit einhergehenden Th1 Polarisation führt (MEDZHITOV 2001; RE u. STROMINGER 2001; THOMA-USZYNSKI et al. 2000).
Nekrotisches oder apoptotisches Zellmaterial wird von DC meist durch Phagozytose aufgenommen wobei die DC das Material mit pseudopodienartigen Ausläufern umschließen.
MAHNKE et al. (2003) diskutieren den Einfluss der Antigenaufnahme auf die Funktion der DC. Sie postulieren, dass die Art des Antigens und der Weg der Aufnahme in die DC entscheiden, ob eine periphere Toleranz oder Immunantwort induziert wird.
2.3.2.3 Antigenprozessierung und Antigenpräsentation
Dendritische Zellen können Antigene über MHC-I und MHC-II-Moleküle präsentieren. Über welches Molekül das Antigen präsentiert wird, entscheidet meist die Herkunft des Antigens.
Wird eine Zelle beispielsweise durch Viren transformiert, synthetisiert sie Proteine im Zytosol, die von dem Virusgenom codiert werden. Diese Proteine viralen Ursprungs werden, wie alle zellulären Proteine und somit auch Tumorantigene, im Zytosol mit Ubiquitin markiert und durch sogenannte multikatalytische Proteasenkomplexe (Proteasome) der Zelle zu Peptidfragmenten gespalten. Dieser Vorgang wird als Prozessierung bezeichnet. Durch die Prozessierung entstehen viele kleine Peptidfragmente, welche zu sogenannten TAP- Molekülen („transporters associated with antigen processing“) transportiert werden. Ihre Aufgabe besteht in dem Transport der Peptide in das Endoplasmatische Retikulum der Zelle, wo die Beladung und Bildung der MHC-I-Moleküle stattfindet. Dieser Peptid-MHC-I Komplex wird nun über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche gebracht, wo er von T- Zellen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) erkannt wird. Auch das MHC-II-
Molekül wird im endoplasmtaischen Retikulum gebildet, allerdings wird dort die Bindungsstelle für das Peptid von einer invarianten Kette blockiert und das MHC-II-Molekül stabilisiert. Fusioniert aber ein Endosom mit aufgenommenen, exogenen Proteinen mit dem MHC-II-Molekül, wird die invariante Kette abgespalten und das MHC-II-Molekül kann das antigene Peptid binden. Nach Fusion des Endosoms mit der Plasmamembran der Zelle wird der Peptid-MHC-II-Komplex auf der Zelloberfläche präsentiert.
Zu beachten ist aber, dass die Prozessierungswege der Proteinspaltung und MHC-Beladung von MHC I und II nicht absolut getrennt sind. REIMANN et al. (1994) konnte zeigen, dass auch exogene, aufgenommene Proteine über MHC-I präsentiert werden können. Dieser Mechanismus der exogenen MHC-I-Beladung wird auch als „cross presentation“ bezeichnet.
Bei dendritischen Zellen konnte zudem ein Weg der MHC-I-Beladung gezeigt werden, der die Notwendigkeit der Aufnahme exogener Proteine sogar gänzlich umgeht (DAVOUST u.
BANCHEREAU 2000). Es wird postuliert, dass sich auf der Zelloberfläche Proteasen (z.B.
die Metalloprotease CD13) befinden, welche Proteine spalten können und leere MHC- Moleküle auf der Zelloberfläche direkt mit Peptiden beladen werden.
Ob allerdings mögliche Peptidliganden für das MHC-I-Molekül in den Proteasomen der Zelle gespalten werden können, hängt von der Aminosäurefrequenz und dem c-terminalen Ende des Proteins ab. TANAKA u. KASAHARA (1998) zeigten, dass IFN-γ in Zellen einen Wechsel innerhalb der Proteasomen hervorruft. Die katalytischen Untereinheiten, auch als β1, β2 und β5 bezeichnet, werden durch homologe Untereinheiten ersetzt und bilden die sogenannten Immunproteasomen. Der Unterschied beider Proteasomtypen liegt dabei in ihrer Spaltungspräferenz, wobei Immunproteasomen bezüglich ihrer Produktion MHC-I bindender Peptide effizienter sein sollen.
Auch hier bilden dendritische Zellen eine Ausnahme, da sie konstitutiv Immunproteasomen besitzen, unabhängig von einer vorherigen Induktion durch INF-γ. Unreife DC, wie sie zum Beispiel aus Monozyten des peripheren Blutes generiert werden können, enthalten nach MACAGNO et al. (1999) Proteasomen und Immunproteasomen in gleichen Mengen, wohingegen voll ausgereifte DC (siehe 2.3.2.4) nur Immunproteasomen tragen.
2.3.2.4 Reifung dendritischer Zellen
Nach der Antigenaufnahme begeben sich die DC auf eine Wanderung über die afferenten Lymphbahnen zu den Lymphknoten. Während dieser Wanderung vollziehen sich eine Reihe von phänotypischen, morphologischen und funktionellen Veränderungen (JONULEIT et al.
antigenaufnehmende Zelle (iDC) wird durch diese Veränderungen zu einer reifen (maturen), antigenpräsentierenden Zelle (mDC) mit hoch effizientem stimulatorischem Potential. Es kommt zu einer erhöhten Expression von MHC-I und MHC-II-Molekülen, sowie der Kostimulations- und Adhäsionsmoleküle wie z.B. CD80, CD86, CD83, CD54 und CD40.
CD83, dessen Funktion noch nicht hinreichend bekannt ist, wird dabei als besonderer Reifungsmarker angesehen (LECHMANN et al. 2001). Ferner wird die Expression des Homing-Faktors CCR7 induziert und die Expression anderer Chemokinrezeptoren (z.B.
CCR6) vermindert. Der Reifungsprozess ist zudem durch die Sekretion verschiedener Zytokine und einiger morphologischer Veränderungen charakterisiert. So zeigen reife DC (mDC) sehr lange Ausläufer, wahrscheinlich um ihre Oberfläche zu vergrößern und so T- und B- Lymphozyten mehr Kontaktfläche zu bieten. In den T-Zellregionen der Lymphknoten findet schließlich die antigenspezifische Stimulation der Lymphozyten durch die maturen DC (mDC) statt (STEINMAN et al. 1988; STEINMAN 1991). Die Reifung der DC stellt funktionell einen sehr wichtigen Prozess dar, da unreife DC keine Immunantwort, sondern Toleranz induzieren (JONULEIT et al. 2000; JONULEIT et al. 2001).
In vitro kann die Reifung der iDC zu mDC u.a. durch Zugabe von TNFα (SALLUSTO u.
LANZAVECCHIA 1994), CD40-Ligand (BANCHEREAU et al. 1995; FELZMANN et al.
2001), LPS (SALLUSTO et al. 1995) und monozytenkonditioniertem Medium (REDDY et al.
1997) induziert werden. Daneben werden verschiedene Zytokincocktails beschrieben, die ebenfalls eine in vitro Reifung der DC induzieren sollen. STEINBRINK et al. (2000) geben ein Gemisch aus IL1β, IL6, TNFα und Prostaglandin E2 an.
2.3.3 Einsatz dendritischer Zellen als Tumorvakzine
In der Onkologie werden immunologische Therapieansätze mitunter als die vierte Säule der Tumorbekämpfung bezeichnet (neben Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie). Besonders dendritische Zellen werden als vielversprechende Immuninduktoren gesehen, da sie den Angelpunkt jeder durch Lymphozyten vermittelten Immunität darstellen. Zahlreiche Studien wurden in der Humanmedizin durchgeführt, die beweisen sollten, dass DC in der Lage sind Tumorescapemechanismen zu durchbrechen. Dabei finden unterschiedlichste Verfahren der DC-Generierung, Antigenbeladung und DC-Applikation ihre Verwendung.
2.3.3.1 Auswahl verschiedener Generierungsmethoden 2.3.3.1.1 Gewinnung der DC bzw. Vorläuferzellen
Schon die Gewinnung dendritischer Zellen kann durch unterschiedliche Verfahren erfolgen.
Mit Hilfe von Antikörper-Kits können sie z.B. direkt aus humanen Blut gewonnen werden, wie DZIONEK et al. (2000) zeigen konnten. Da allerdings die Menge der im Blut zirkulierenden DC sehr gering ist, werden die CD34+-Vorläuferzellen und somit die Blut-DC zum Teil durch Applikation von Flt3 Liganden („fms like“ tyrosine kinase 3 ligand) expandiert (MORSE et al. 2000; ROSENZWAJG et al. 1998). Aber auch durch Kultivierung der CD34+ Vorläuferzellen mit GM-CSF und TNFα lassen sich DC generieren (CAUX et al.
1997). Direkt aus dem Gewebe können DC mit Hilfe von Cell-Sortern isoliert werden (CROWLEY et al. 1990).
Um größere Mengen an DC zu generieren, haben sich Monozyten des peripheren Blutes als gute Ausgangspopulation erwiesen. Sie besitzen die Fähigkeit, in Abhängigkeit des umgebenden Milieus, in Makrophagen oder dendritische Zellen zu differenzieren. Die Separation der monozytoiden Zellen kann über Plastikadhärenz, magnetic-cell-sorting (MACS) oder Dichtegradientenzentrifugation erfolgen. Für die Separation equiner Monozyten beschrieben HAMMOND et al. (1999) eine Methode, bei der zunächst mit Hilfe eines Dichtegradienten mononukleäre Zellen aus Vollblut aufgereinigt und schließlich über Plastikadhärenz Monozyten angereichert wurden. Eine leicht modifizierte Methode wendete MAUEL (2002) an. Durch eine zweimalige Überschichtung der MNC auf unterschiedliche Dichtegradienten und mehrere Adhäsionspassagen konnte sie die Reinheit und Ausbeute equiner Monozyten erhöhen, erzielte jedoch lediglich 1-5 x106 Monozyten aus 500ml Vollblut. Laut ELKORD et al. (2005) hat schon der Schritt der Monozytenaufreinigung einen erheblichen Einfluss auf die Zytokinproduktion der später generierten DC. Monozyten, welche über CD14 positiv im MACS selektioniert wurden, zeigten als mDC z.B. eine geringere Produktion der Zytokine IL12 und TNFα als mDC, welche aus über Plastikadhärenz gewonnenen Monozyten generiert wurden.
Generell führt eine Aufreinigung der Monozyten, bei der die Monozyten über ihre Oberflächenmoleküle positiv selektioniert werden, zu unspezifischen Aktivierungen, die nicht genau voraussagen lassen, welche Funktionalität die generierten DC später aufweisen. Um also möglichst wenig Einfluss auf die Zellen auszuüben ist es daher von Vorteil, die Zellen so wenig wie möglich zu manipulieren. Eine elegante Methode der Anreicherung wird von DE ALMEIDA et al. (2000) beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, dass über Dichtezentrifugation mit hypertonem Percoll® eine gute Reinheit und gute Ausbeute von
dass Lymphozyten, die sonst eine fast identische Dichte wie Monozyten aufweisen, empfindlicher auf die Hyperosmolalität reagieren. Durch Wasserverlust sollen die Lymphozyten eine höhere Dichte annehmen und sich so besser von den Monozyten trennen lassen.
2.3.3.1.2 Differenzierung monozytoider Zellen zu DC in vitro
Die Generation dendritischer Zellen aus monozytoiden Vorläuferzellen stellt für DC (MoDC) zur therapeutischen Anwendung meist das Verfahren der Wahl dar, da sie sich in großen Mengen kultivieren lassen und zur Gewinnung der monozytären Vorläuferzellen nur eine Blutentnahme erforderlich ist. Die eingesetzten Zytokine zur Differenzierung der Monozyten variieren allerdings. Anstelle von IL4 finden auch IL15, TNFα oder INFα ihren Einsatz um MoDC zu erhalten. Die generierten DC unterscheiden sich dabei sowohl in ihrer Homogenität, als auch in ihrer Zytokinsekretion. So sollen IL4-DC eine homologe Population darstellen, ohne Langerhanszellen, wohingegen TNF-DC heterogene Populationen mit CD1a+
Langerhanszellen und CD14+ interstitiellen DC ergeben (CHOMARAT et al. 2003). Nach MOHAMADZADEH et al. (2001) und PULENDRAN et al. (2004) sollen IL15-DC zudem besser als IL4-DC in der Lage sein cytotoxische T-Zellen zu stimulieren. Die Kapazität zur Stimulation CD4+ T-Zellen hingegen ist bei beiden Subtypen gleich. Für INF-α-DC konnte schon nach drei Tagen Kultur ebenfalls eine starke Stimulationskapazität cytotoxischer T- Lymphozyten beobachtet werden (SANTINI et al. 2000; SANTINI et al. 2003; SANTINI et al. 2005).
Doch nicht nur die Generierung der DC führt zu unterschiedlichen DC-Subtypen, sondern auch die verwendeten Stimuli zur Ausreifung der Zellen. Wie schon in Kapitel 2.3.2.4.
beschrieben, können TNFα, CD40-Ligand, LPS und monozytenkonditoniertes Medium verwendet werden. Verschiedene Zytokincocktails wie z.B. ein Gemisch aus IL1β, IL6, TNFα und Prostaglandin E2 sollen ebenfalls zu stimulationspotenten, maturen DC führen. Welcher Stimulus allerdings der beste ist, bleibt noch Gegenstand der aktuellen Forschung, wenn auch gezeigt werden konnte, das die Kombination von IL1β und TNFα mit Typ I und II Interferonen (INFα und INFγ) in vitro zu einer starken IL12 Sekretion und tumorspezifischen CTL-Induktion führt (MAILLIARD et al. 2004).
2.3.3.1.3 Antigenpulsing der DC
Eine weitere Frage, die bei der therapeutischen Anwendung von DC als Tumorvakzine berücksichtigt werden muss, ist die, ob, und wenn ja, wie DC mit Antigen beladen werden.
Meist werden sie in vitro mit definierten Peptiden beladen, was für „proof-of-principle- Studien“ essentiell ist, da nur so überwacht werden kann, ob eine antigenspezifische T-Zell- Aktivierung stattgefunden hat. Um DC mit Antigenen zu beladen, kommen viele Methoden in
Betracht. Neben der Fusionierung von DC mit Tumorzellen, der Transfektion der DC mit Tumor-DNS oder -RNS kommen auch heterocyclische Peptide oder Tumorzelllysate zur Pulsung (Beladung der MHC-Moleküle auf DCs) zum Einsatz. Einen direkten Vergleich zwischen mit Tumorzellen fusionierten DC und mit Lysat gepulsten DC, stellten WEIGEL et al. (2006) bei Mäusen an, und konnten keinerlei Unterschiede bezüglich der tumorprotektiven Immunantwort ausmachen. BANCHEREAU u. PALUCKA (2005) sehen generell einen Nachteil bei dem Pulsen von DC mit einzelnen Peptiden aufgrund von Immunselektion und mangelnder Diversität der antigenen Strukturen. Ein Pulsen mit möglichst vielen verschiedenen Peptiden über physiologische Prozessierungswege soll die effizienteste Antigenpräsentation induzieren.
2.3.3.1.4 Dosis und Applikationsroute von DC zur Tumortherapie
Werden gepulste DC zur Tumortherapie eingesetzt, stellt sich schließlich die Frage der Dosis und des Applikationsweges. Hier gibt es folgende Ansätze: Eine intranodale Gabe unter Ultraschallkontrolle in einen vom Tumor entfernten Lymphknoten, um die DC direkt an den Ort der DC-T-Zell-Interaktion zu bringen (NESTLE et al. 1998), eine intravenöse Injektion (HOLTL et al. 1999) oder die intrakutane Injektion (FONG et al. 2001). BEDROSIAN et al.
(2003) verglich die Applikationsrouten in einer klinischen Studie mit an malignen Melanomen erkrankten Patienten und fand heraus, dass alle drei Routen zu einem starken Anstieg tumorspezifischer CD8+T-Zellen führen. Dennoch konnte hier gezeigt werden, dass, gefolgt von der intradermalen Applikation, die intranodale Route zu einer höheren Stimulationsrate führte als die intravenöse Verabreichung. LINETTE et al. (2005) untersuchte u.a. die Toxizität der verabreichten DC. Bei Patienten mit verschiedenen Tumorarten wurden 10x106, 15x106 und 50x106 DC pro i.v. Applikation verwendet. Alle Patienten vertrugen die Therapie sehr gut. Einen direkten Einfluss auf den Therapieerfolg kann man aufgrund der sehr heterogenen Patientengruppe leider nicht einer Dosis zuordnen. In einer weiteren Studie konnten LEE et al. (2006) jedoch einen Einfluss der DC-Dosis auf die tumorprotektive Immunantwort bei Mäusen mit Melanomen nachweisen. Je mehr DC sie einsetzten, desto besser war die immunologische Respons der Tiere und desto höher deren mittlere Überlebenszeit.
2.3.3.2 Immunologische Überlegungen zum Einsatz dendritischer Zellen zur Therapie des equinen Sarkoids
Da bisher noch keine ausreichend effektiven Behandlungen für das equine Sarkoid zur Verfügung stehen, liegt es nahe, dendritische Zellen des Pferdes zu generieren und als
Tumorantigene werden von den Tumorzellen exprimiert? Welcher Escapemechanismen bedient sich der Tumor und welche Immunantwort soll induziert werden?
In Kapitel 2.1.2.1.2 wurde schon erwähnt, dass z.B. die MHC-I-Expression auf transformierten Zellen durch das Tumorsuppressorprotein E5 herunterreguliert wird. Somit wäre, neben einer direkten cytotoxischen, Antikörper vermittelte Immunreaktionen von Vorteil, um den Mechanismus der antikörperabhängigen Zytotoxizität zu nutzen. Da DC in der Lage sind sowohl B- als auch T-Zellen zu stimulieren, scheinen sie ein geeignetes Mittel zur Induktion beider Immunantworten darzustellen. Geht man zusätzlich davon aus, dass der Tumor z.B. durch IL10 oder M-CSF (siehe Kapitel 2.2.2.) die Entwicklung von Vorläuferzellen zu dendritischen Zellen hemmt, liegt es nahe, in vitro generierte unreife MoDC direkt in das transformierte Gewebe zu injizieren. Dort können sie geeignetes Tumorantigen aufnehmen und schließlich auf dem Weg zum Lymphknoten unter physiologischen Bedingungen ausreifen. KIM et al. (2004) konnten zeigen, dass bei Patienten, die unreife DC nach Tumorbestrahlung intratumoral appliziert bekamen, eine starke tumorspezifische Immunantwort ausgelöst wurde. Zudem wurde in equinen Sarkoiden immunhistochemisch nur eine sehr geringe Menge DC nachgewiesen (STARK 2005).
Entscheidender Faktor bei dieser Methode war allerdings die Bestrahlung des Tumors, da ein inflammatorisches Mileau innerhalb des Tumors entstand, welches zur Reifung der DC nach Antigenaufnahme führte. Ohne zusätzliche Tumornoxe wäre die Gefahr der Toleranzinduktion nicht auszuschließen, da STEINMAN (2003) und STEINMAN et al.
(2003) zeigen konnten, dass unreife DC bzw. reife DC ohne finalen Stimulus durch ein Gefahrensignal zu einer T-Zell-Deletion oder Anergie führen können. Allerdings ist auch bei in vitro gepulsten DC diese Gefahr nicht auszuschließen, da eine Toleranzinduktion ebenfalls von der Art der Antigenaufnahme bzw. des Rezeptors abhängig zu sein scheint. So soll z.B.
eine simultane Antigenbindung des macrophage- mannose- Rezeptors (MMR), des DC-SIGN ( = CD209) und der TLRs mit Mycobakterien die DC-Reifung blockieren, indem ihre IL12- Produktion heruntergefahren und die IL10 Produktion angeregt wird. Werden nur TLRs beladen, führt dies zu einer Aktivierung der DC und Sekretion von IL12 (MAHNKE et al.
2003). Die von JONULEIT et al. (2001) gemachten Beobachtungen, bei denen unreife DC im Gegensatz zu reifen DC in vivo keine tumorantigenspezifischen CTL induzierten, kann darauf beruhen, dass die DC intranodal in Lymphknoten appliziert wurden. Eine Reifung der DC während der Migration zu den Lymphknoten konnte somit nicht stattfinden.
