Reifeinduktion equiner DC

Für CD83 ist mehrfach beschrieben worden, dass es auf humanen MoDC erst nach einer finalen Stimulation exprimiert wird, die z.B. durch Zusatz von LPS, TNFα und Cocktails verschiedener Zytokine erreicht werden kann. CD 83-Expression gilt dabei als charakteristisches Merkmal einer maturen (reifen) dendritischen Zelle mit antigenpräsentierenden Eigenschaften. THURNHER et al. (1997) konnte jedoch neben dem Einfluss eines finalen Stimulus auch den Einfluss der eingesetzten Zelldichte auf die Expression von CD83 nachweisen. Je geringer die Zelldichte war, desto höher fiel die Expression der Marker CD83 und CD86 aus.

Die Zellen, die im Rahmen dieser Arbeit generiert wurden, exprimierten unabhängig von einem finalen Stimulus bereits CD83. Durch Zusatz von LPS 24h vor der Ernte konnte die Expression nicht gesteigert werden. Dies deckte sich mit den von MAUEL et al. (2006) gemachten Beobachtungen, dass LPS keinen Einfluss auf die Reifung equiner DC ausübte. Da

monozytenkonditioniertes Medium erreicht werden kann, ist jedoch nicht auszuschließen, dass die hier generierten DC durch die zuvor durch die Monozyten freigesetzten Faktoren zur Reifung angeregt wurden. NERSTING et al. (2003) wiesen dennoch auf die Notwendigkeit des LPS-Zusatzes zur Reifungsinduktion hin, wenn auch wesentlich geringere Dosen erforderlich waren. Eventuell liegt hier jedoch ein Einfluss der Zelldichte vor (s.o.). Für equine MoDC scheint alleine eine Kultivierung der Zellen über 3 bzw. 7 Tage schon zu einer Expression des Reifungsmarkers zu führen. Ob diese Reifung jedoch auch mit einem Verlust der Antigenaufnahme und dem Erlangen stimulatorischer Kapazität der Zellen einhergeht, galt es in einer gemischten Leukozytenreaktion zu prüfen.

5.4 Funktionalität der generierten MoDC

Dendritische Zellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, naive Lymphozyten in vitro stimulieren und zur Proliferation anregen zu können. Eine Möglichkeit, diese Funktionalität der generierten Zellen zu testen, besteht in der gemischten Leukozytenreaktion (MLR). Es handelt sich dabei um eine Methode, die ursprünglich zur in-vitro Simulation von Gewebetransplantatabstoßung entwickelt wurde und auf der MHC-Erkennung auf antigenpräsentierenden Zellen (APC) durch T-Lymphozyten beruht. Für die Proliferation sind dabei hauptsächlich CD4+ Zellen bei Interaktionen mit MHC-II-differenten APC verantwortlich (JANEWAY et al. 2005). Die Bindung der T-Zellen an die fremden MHC-Moleküle kann dabei aus zwei Gründen erfolgen. Entweder das präsentierte Antigen wird von dem T-Zellrezeptor (TCR) erkannt und reicht für eine Erkennung aus (peptiddominierte Bindung) oder es werden charakteristische Bereiche des fremden MHC-Komplexes erkannt (MHC-dominierte Bindung) (JANEYWAYet al. 2005). In beiden Fällen kommt es zu einem ersten, stimulatorischen Signal durch die MHC-TCR-Interaktion, dem ein zweites, costimulatorisches Signal durch die Moleküle CD80/86 nach Interaktion mit CD28 auf der T-Zelle folgt. Dadurch wird ein Signal ausgelöst, das die Expression von Zytokinrezeptoren an der Oberfläche der T-Zellen und die Expression von Zytokinen durch die APC induziert. Erst dadurch wird eine Proliferation und Differenzierung der T-Lymphozyten möglich. In vitro lassen sich diese Interaktionen simulieren, indem man Lymphozyten eines Spenders als Responderzellen mit antigenpräsentierenden Zellen (DC) eines MHC-II-differenten anderen Spenders als Stimulatorzellen coinkubiert.

5.4.1 Methodische Überlegungen und Vorarbeiten

Das übliche Protokoll zur Durchführung einer MLR beinhaltet die Bestrahlung der Stimulatorzellen vor dem Einsatz in die Cokultur, um eine Proliferation dieser Zellen zu vermeiden und somit eine Ein-Wege-MLR durchführen zu können, bei der ausschließlich die Proliferation der Responderzellen erfasst wird. Die Proliferationsrate der Responderzellen wird üblicherweise durch den Einbau von radioaktivem ³H-Thymidin bestimmt. Darauf konnte hier verzichtet werden, da die Proliferation der MNC zuverlässiger mit Hilfe der Referenzzellmethode bestimmt wurde (PECHOLD et al. 1994). Eine Erfassung der Stimulatorzellen bei der Messung der Proliferation war auszuschließen, da diese Zellen durch die Bestrahlung lediglich 3 Tage in der Kultur überlebten. Ab Tag 4 waren Kontrollansätze, die nur bestrahlte Stimulatorzellen enthielten Propidiumjodid positiv (tot) und konnten aufgrund ihrer FL3-Fluoreszenz im Durchflusszytometer von der Auswertung eliminiert werden.

Um auch geringe Proliferationsinduktionen bei naiven Lymphozyten detektieren zu können, wird dem verwendeten Medium 2-Mercapoethanol (ME) zugesetzt. Es handelt sich dabei um ein Thioglycol mit zwei funktionellen Gruppen; einer Hydroxygruppe (-OH) und einer Mercaptogruppe (–SH). Es soll in der Kultivierung von Lymphozyten einen vitalitätserhaltenden und proliferationsfördernden Effekt ausüben, da es das Redox-Potential des Mediums stabilisiert und die Aufnahme von Cystin durch die Zellen ermöglicht. Dies geschieht, da es aufgrund seines reduzierenden Potenzials Cystein zu Cystin reduziert. Dem Cystin-Glutamat-Antiporter cXT wird in diesem Zusammenhang große Bedeutung beigemessen. Kultivierte Fibroblasten von Mäusen, die kein cXT exprimierten, starben in Kultur nach 24 h wenn ihnen kein 2-Mercaptoethanol zugesetzt wurde (SATO et al. 2005).

Auch murine Lymphozyten zeigten in Kultur eine stärkere mitogen-induzierte Proliferation wenn ihnen ME zugesetzt wurde, und zwar unabhängig von der Dosis des zur Verfügung stehenden Cystins. Humane Lymphozyten wurden dagegen durch ME-Zusatz in vitro in ihrer Proliferation gehemmt. Wurde die intrazelluläre Glutathion-Konzentration allerdings durch Zusatz von Buthionine Sulfoximine (BSO, hemmt Glutathionsynthese) gesenkt und gleichzeitig ME in die Kultur gegeben, konnte eine mitogen-induzierte Proliferation verstärkt werden. Dies führte zu der Vermutung, dass eine bestimmte Menge an Thiolen für die Proliferation in vitro kultivierter Lymphozyten essentiell ist (MESSINA u. LAWRENCE 1992).

Welchen Einfluss ME auf die in vitro Proliferation equiner Lymphozyten ausübt, ist nicht bekannt. Aus diesem Grund galt es zunächst den Effekt von ME auf equine Lymphozyten zu

Untersuchungen zeigte sich ein rassebezogener Unterschied in der ME abhängigen MNC-Proliferation. Während die von Isländerponies gewonnenen MNC (mononukleäre Zellen) schon ab 15µMol ME eine deutliche Proliferationssteigerung zeigten, benötigten die MNC von Warmblutpferden Konzentrationen von 50µMol ME. Beiden gemein war, dass alleine schon durch ME eine Proliferation der MNC induziert wurde. Da equine Lymphozyten in Kultur auch ohne ME überleben, scheint es zumindest ähnliche, wenn nicht gleiche Transporter wie den humanen cXT zu geben. Anders als bei humanen Lymphozyten wurde durch ME bei Pferden eine dosisabhängige Proliferation induziert. Dass die Zellen der Islandponies zudem deutlich stärkeres Wachstum zeigten als dies bei den Warmblutpferden der Fall war, könnte an unterschiedlichen Thiolpräferenzen der Zellen liegen, wie es für murine und humane Lymphozyten schon gezeigt werden konnte (MESSINA u. LAWRENCE 1992). ME würde demnach bei Islandponies zu einer besseren Reduktion des Cysteins führen und somit zu einer stärkeren Aufnahme der Aminosäure. Ob diese Hypothese jedoch zutrifft, müsste durch Analyse der intrazellulären Glutamat- und Cystinkonzentrationen bestätigt werden. Denkbar wäre auch, dass die Lymphozyten der Warmblutpferde über weniger cXT verfügen und somit abhängiger von einer Reduktion des Cysteins durch ME im Medium sind.

Um zu prüfen, welchen Einfluss eine Stimulation der Zellen unter Einfluss verschiedener ME-Konzentartionen ausübt, wurde ein vereinfachtes Modell einer MLR durchgeführt. Dafür dienten MNC von Isländerponies als Stimulatorzellen und MNC von Warmblutpferden als Responderzellen. Durch die Wahl der beiden unterschiedlichen Rassen sollte eine möglichst hohe MHC-Divergenz gewährleistet werden. Während die Stimulation durch die allogenen MNC mit geringen Konzentrationen ME keinen Unterschied zur Mediumkontrolle aufwiesen, konnte ab einer Konzentration von 15µMol ME ein deutlicher Unterschied zwischen der Proliferation ohne Stimulatorzellen und mit Stimulatorzellen gesehen werden. Allerdings war dieser Unterschied zur Mediumkontrolle (ohne Stimulatorzellen) nur bei der höheren Stimulator/Responder-Ratio (S/R-Ratio) sichtbar. Die geringere S/R-Ratio von 3:100 zeigte dagegen bei 50µMol ME einen deutlichen Anstieg der Proliferationsrate (4.3.1). Demnach scheint für die Detektion einer Proliferationsinduktion im Rahmen einer MLR die Verwendung von ME von Vorteil zu sein. Für die MLR mit in vitro generierten DC wurde aufgrund dieser Untersuchungen eine Konzentration von 20µMol ME gewählt.