Gewinnung definierter Zellpopulationen aus equinem Blut

Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausschließlich mononukleäre Zellen des Pferdes benötigt, wobei es für Proliferationsversuche vornehmlich auf die lymphoide Fraktion, zur Generation dendritischer Zellen jedoch auf die monozytoide Fraktion ankam.

3.3.1.1 Gewinnung gerinnungsgehemmten Blutes

Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung der Vene gewonnen. Zur Blutentnahme wurde für die Gewinnung von MNC das Vacutainer-system mit heparinhaltigen (Natrium-Heparin, 170IU/10ml) Vacutainern (3.2.1) verwendet.

Für die Gewinnung von Monozyten über hypertonen Percoll wurden EDTA (Dikalium-EDTA, 18mg/10ml) oder citrathaltige (Trinatriumcitrat, 0,109mol/ml, 3,2%) Vacutainer (3.2.1) eingesetzt.

3.3.1.2 Serumgewinnung

Für die Serumgewinnung wurde Vollblut in Vacutainerröhrchen ohne Zusatz eines Gerinnungshemmers (3.2.1) gewonnen. Nachdem sich der Blutkuchen teilweise zusammengezogen und an der Röhrchenwand festgesetzt hatte, wurde er mit einer sterilen Pasteur-Pipette von der Röhrchenwand gelöst. Anschließend wurde das Vacutainerröhrchen bis zur vollständigen Gerinnung und Retraktion des Blutkuchens bei Zimmertemperatur gelagert und daraufhin zentrifugiert (1500 x g, 20 min, RT). Das Serum wurde abgesaugt und ein weiteres Mal abzentrifugiert. Serum wurde immer frisch verwendet, ohne Einfrieren oder Hitzebehandlung.

3.3.1.3 Isolation der MNC Fraktion aus equinem Vollblut

Mononukleäre Zellen (Lymphozyten und Monozyten) lassen sich aufgrund ihrer geringeren Dichte gut von den etwas dichteren polymorphkernigen Leukozyten abtrennen. Diese Eigenschaft wird bei der Dichtegradientenzentrifugation genutzt um Zellfraktionen voneinander zu trennen.

Antikoaguliertes Blut (max. 24h alt) wurde zunächst in 50 ml Zentrifugenröhrchen (3.2.2) überführt und 25 min zur Sedimentation bei RT stehen gelassen. Schon in diesem Schritt wird die unterschiedliche Dichte von Zellpopulationen genutzt, um Erythrozyten von Leukozyten zu trennen. Die schweren Erythrozyten sedimentieren auf den Grund des Röhrchens, während die obere Schicht das noch stark leukozytenreiche Plasma darstellt. Das Plasma wurde vorsichtig abgesaugt und die Erythrozyten verworfen. In weiteren 50 ml Röhrchen wurden 15 ml Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.5.3.1) vorgelegt und das Plasma vorsichtig überschichtet. Die anschließende Zentrifugation (30 min, bei 10°C) wurde bei 1000 x g ohne Bremse durchgeführt.

Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennten sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht bildete das zellfreie Plasma.

Zwischen Plasma und Lymphozytenseparationsmedium® befand sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; Lymphozyten und Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums^® lagen verbliebene Erythrozyten und die polymorphkernigen Leukozyten (PMN). Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesogen und in ein 50ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgelegtem PBS (3.2.5.3.4) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 50ml schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 min, 10°C; 500 x g, 250 x g und 80 x g), um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen (Flotation). Zwischen den einzelnen Zentrifugationen wurden die Zellen durch Aufschütteln resuspendiert und in ca. 40ml PBS aufgenommen. Mit dieser Methode konnten zwischen 0,8 und 2 x 10⁶ MNC/ml Vollblut gewonnen werden.

3.3.1.4 Adhärenz der Monozyten als Methode zur Aufreinigung

Um die Monozytenfraktion innerhalb der MNC anteilig zu erhöhen, sollte das in der Literatur für Monozyten beschriebene Adhärenzverhalten an Plastik genutzt werden. Dafür wurden MNC über Lymphozytenseparationsmedium® (3.3.1.3) separiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen gezählt und jeweils 20 x 10⁶ MNC in 10 ml Earles Medium (3.2.5.1) in Zellkulturflaschen (3.2.2) inkubiert. Dem Medium wurden unterschiedliche Mengen an autologem Serum (3.3.1.2) zugesetzt (0, 1, 5, 10 %). Nach 1 bis 3 h Inkubationszeit (bei 37°C und 5% CO2 in Luft) wurde der Zellkulturüberstand abgeschüttet und in 50ml Zentrifugenröhrchen aufbewahrt. Um verbliebene nicht adhärente Zellen von den adhärenten Zellen zu trennen, wurde der Boden der Zellkulturflasche 2x mit warmem (37°C) PBS abgespült. Die am Boden anhaftenden Zellen wurden anschließend mit Hilfe eines Zellschabers (3.2.2) gelöst, in PBS oder Medium aufgenommen und ebenfalls in 50 ml

aufkonzentriert und nach Zellzählung auf 5 x 10⁶ Zellen/ml mit PBS oder Medium eingestellt.

Weitere Arbeiten mit diesen Zellen erfolgten direkt im Anschluss an die Separation.

3.3.1.5 Affinitätschromatographische Anreicherung equiner Monozyten

Bei der affinitätschromatographischen Anreicherung werden Zellen über monoklonale Antikörper direkt oder indirekt mit an paramagnetische Partikel gebundenen Antikörpern markiert. Die Zellsuspension mit spezifisch markierten und unmarkierten Zellen wird über eine Trennsäule gegeben, die sich in einem Magnetfeld befindet. Die Trennsäulen besitzen eine Matrix aus Stahlwolle oder eisenmagnetischen Kügelchen. Die unmarkierten Zellen durchlaufen die Säule im magnetischen Feld, die markierten Zellen bleiben an der Trennsäule hängen und können anschließend außerhalb des Magnetfeldes eluiert werden. Das MACS®

System (3.2.2) kann zur Anreicherung (positive Selektion) oder zum Entfernung (Depletion) einer Zellpopulation aus einer Gesamtpopulation eingesetzt werden.

3.3.1.5.1 Negative Selektion von Monozyten durch Depletion CD4 und CD8 positiver Zellen

Aus 100 ml heparinisiertem Blut (3.3.1.1) wurden über Dichtegradientenzentrifugation MNCs (3.3.1.3) gewonnen. Jeweils 1 x 10⁸ MNC wurden zur Markierung und Separation verwendet und als möglichst „trockenes“ Zellpellet mit je 200µl einer 1:2 verdünnten Maus-anti-equine CD4 und Maus-anti-equine CD8 mAk Lösung (3.2.4.1.1) für 20 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen einmal mit PBS (3.2.5.3.4) gewaschen und das gewonnene Zellpellet mit einem FITC gekoppelten Anti-maus Sekundärantikörper (3.2.4.1.2) für weitere 20 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein weiterer Waschschritt, dem sich die erneute Inkubation mit einem anti-FITC-MicroBeads-Ak (3.2.4.1.2) anschloss. Schließlich wurden die Zellen erneut gewaschen, in 10 ml MACS-Puffer (3.2.5.3.7) resuspendiert und für die Trennung in einer magnetischen Säule bereitgehalten.

Die Säulen zur Trennung der Fraktionen wurden mit gekühltem MACS-Puffer (3.2.5.3.7) konditioniert (mit mindestens 3 fachem Säulenvolumen gespült) und in das magnetische Feld eines midiMacs® Magneten (3.2.2) verbracht. Die Zellen wurden über einen Nylon Gaze-Filter auf die Säule aufgetragen, um Zellaggregate in der Säule zu vermeiden. Anschließend wurde MACS-Puffer zum Auswaschen nicht markierter Zellen aufgetragen (mindestens 2 faches Säulenvolumen) und der Durchlauf aufgefangen. Bei konstanter Durchflussrate, kontrolliert durch die Größe der Auslassöffnung (0,9 mm Kanüle) sowie die Tropfrate (2-3 Tropfen pro Sekunde), wurde der Durchlauf wiederholt durchflusszytometrisch kontrolliert, bis keine Zellen mehr von der Säule kamen. Schließlich wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt, die aufgesetzte Kanüle verworfen, nochmals MACS-Puffer auf

die Säule gegeben und mittels eines mitgelieferten Stempels das Residualvolumen (1x Säulenvolumen, hier 5 mL) eluiert.

Anschließend erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der angereicherten Zellen aus dem Durchlauf, bzw. der Zellen des Eluats.

3.3.1.5.2 Positive Selektion von Monozyten über IgE

Für die Isolierung einer IgE positiven Zellfraktion mittels an paramagnetische Partikel gebundener Antikörper wurden mindestens 500 mL gerinnungsgehemmtes Blut (Heparin oder EDTA, s. 3.2.1) verwendet. Zu Beginn wurden die MNC über Lymphozytenseparations-medium® (3.3.1.3) separiert und die Zellzahl bestimmt (3.3.2).

Die Markierung und Sortierung der Zellen erfolgte bei 4°C (auf Eis) und wurde mit 5 x 10⁸ kernhaltigen, vitalen Zellen begonnen. Nach einer Inkubation (20 min.) mit dem mAK anti eq IgE 134 (3.2.4.1.1) in einem 15 mL Polypropylenröhrchen (3.2.2) wurden die Zellen einmalig mit MACS-Puffer (3.2.5.3.7) gewaschen. Anschließend wurden 100 µL Ratte anti Maus IgG1-MicroBeads (3.2.4.1.2) zu dem möglichst „trockenen“ Zellpellet gegeben und für weitere 20 min auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde dann ein Phycoerythrin-gekoppelter anti Maus Sekundärantikörper (3.2.4.1.2) in einer 1:100 Verdünnung in PBS hinzugegeben. Nach 15 min Inkubation folgte ein weiterer Waschschritt (s.o.) mit anschließender Resuspension der Zellen in 10mL MACS-Puffer (3.2.5.3.7) und eine erste durchflusszytometrische Kontrolle auf den Erfolg der Membranimmunfluoreszenz (3.3.8.2). Die Trennung mittels magnetischer Säule erfolgte wie oben beschrieben (3.3.1.5.1).

3.3.1.6 Dichtegradientenzentrifugation mit hypertonem Percoll

Frisch entnommenes durch K2-EDTA koagulationsgehemmtes Blut wurde 20 min zur Sedimentation stehen gelassen. Anschließend wurde das leukozytenreiche Plasma mit einer weitlumigen Pipette abgenommen und in 50 ml Röhrchen bereitgestellt. In 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden jeweils 10 ml eines 25°C warmen, hypertonen, 50%igen Percollgradienten (3.2.5.3.2) vorgelegt und jeweils 5 ml Plasma vorsichtig überschichtet. Die Röhrchen wurden dann bei 400 x g für 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse zentrifugiert. Durch die geringe Dichte des hergestellten Gradienten, befanden sich nun hauptsächlich Monozyten in der Interphase, während Lymphozyten und Granulozyten zusammen mit verbliebenen Erythrozyten das Zellpellet am Boden bildeten. Da die entstandene Interphase eine sehr dünne Bande darstellte, wurde sie mit einer 2 ml Pasteurpippette (3.2.2) vorsichtig abgenommen und in 50 ml Röhrchen mit 10 ml vorgelegtem PBS/EDTA (3.2.5.3.5) überführt. Es war darauf zu achten, nicht zuviel vom

ml Röhrchen wurde schließlich mit PBS/EDTA aufgefüllt, und die Zellen dreimal mit PBS/EDTA gewaschen (je 10 min., RT, 400 x g, 200 x g und 80 x g). Zwischen den einzelnen Waschvorgängen, die der Entfernung von Thrombozyten dienten, wurde das Zellpellet durch Aufschütteln resuspendiert und das Röhrchen mit PBS/EDTA aufgefüllt. Bei der Etablierung dieser Methode für equine Monozyten stellte sich heraus, dass neben der obligaten Verwendung von frischem Blut (< 24h), auch der verwendete Gerinnungshemmer starken Einfluss auf den Separationserfolg ausübt. Da Monozyten zudem sehr stark zur Aggregatbildung mit Thrombozyten neigen, musste dem Waschpuffer EDTA (1,8 g /100ml) (3.2.5.3.5) zugesetzt werden und die Separation stets bei Raumtemperatur erfolgen.