Untersuchungen zur Gewebespezifität des Gliafaserprotein-mRNA-Nachweises

3.2.4.1.1 Untersuchung nativer Gewebe

Von den Geweben und Organen vom Schwein (Kapitel 3.1.1.3) wurden etwa vier Stunden postmortem jeweils ca. 1 g von jeder Probe mit einem sauberen Messer entnommen und 100 mg davon für die RNA-Extraktion abgewogen. Die verbleibende Probenmenge wurde bei 4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde die RNA-Extraktion mit dem bei 4°C gelagerten Gewebe wiederholt. Als Positivkontrolle wurde porcines Rückenmark- und Gehirngewebe mitgeführt.

3.2.4.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)

Von den verbliebenen 9 g der Proben aus der vorangegangenen Untersuchung des nativen Gewebes wurden jeweils 1 g mit einem sauberen Messer abgeschnitten und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Proben wurden bei 10.000 U/min 1 Minute zentrifugiert und anschließend für 20 Minuten bei 75°C im Wasserbad erhitzt. Nachfolgend wurde von den so behandelten Proben je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die jeweils verbliebenen 8 g der Proben wurden bei 4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde dieser Versuchsschritt mit dem bei 4°C gelagerten Probenmaterial wiederholt. Als Positivkontrolle wurde auch bei diesem Versuch porcines Rückenmark- und Gehirngewebe mitgeführt. Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.1.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)

Bei diesem Versuch wurden die frischen Proben von jeweils 10 g zunächst separat in der Moulinette zerkleinert. Die Moulinette wurde vor der Bearbeitung jeder neuen Probe gründlich mit heißem Wasser und Seifenlauge gereinigt. Beim Schwein wurden alle im Kapitel 3.1.1.3 aufgeführten Gewebe einschließlich Rückenmark- und Gehirngewebe (Kapitel 3.1.1.1) untersucht.

Die zerkleinerten Proben wurde wie folgt aufgeteilt:

• 100 mg natives Gewebe von jeder Probe wurden für die RNA-Extraktion abgewogen,

• je 1 g von jeder Probe wurden abgewogen und jeweils in ein separates 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert und im Wasserbad bei 80°C Wassertemperatur für 30 Minuten erhitzt; von den erhitzten Proben wurde je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen.

Die verbliebenen nativen Proben wurden bei 4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde dieser hier beschriebene Versuch mit dem Probenmaterial, das bei 4°C gelagert wurde, wiederholt.

Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten) In einem dritten Versuch wurde von frischen Muskel-, Herz-, Rückenmark- und Gehirn-Gewebeproben (Kapitel 3.1.1.1 b und 3.1.1.3) je ca. 10 g entnommen, jeweils separat in der gründlich gesäuberten Moulinette zerkleinert und wie folgt aufgeteilt:

• 100 mg natives Gewebe von jeder Probe wurden für die RNA-Extraktion abgewogen,

• zweimal wurde je 1 g von jeder Probe abgewogen und jeweils in ein separates 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Je ein Satz der so vorbereiteten Proben wurde dann für 30 Minuten bzw. 60 Minuten im Wasserbad mit 95°C Wassertemperatur erhitzt. Anschließend wurden wiederum je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen.

Dieser Versuch wurde ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.2 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schafgeweben 3.2.4.2.1 Untersuchung nativer Gewebe

Von Geweben und Organen des Schafes (Kapitel 3.1.1.4) wurde je eine Probe von ca. 1 g mit einem sauberen Messer entnommen und 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die verbleibende Probenmenge wurde bei 4°C gelagert. Dieser Versuch wurde nach 24 Stunden mit den bei 4°C gelagerten Geweben wiederholt. Als Positivkontrolle diente ovines Rückenmarkgewebe.

3.2.4.2.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)

Jeweils 1 g von den verbliebenen 9 g der Proben aus der vorangegangenen Untersuchung der nativen Gewebe wurden mit einem sauberen Messer abgeschnitten, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, bei 10.000 U/min 1 Minute zentrifugiert und anschließend für 20 Minuten bei 75°C im Wasserbad erhitzt. Von diesen Proben wurden dann je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die verbliebenen 8 g der Proben wurden bei 4°C gelagert.

Dieser Versuchsschritt wurde nach 24 Stunden mit dem im Kühlschank gelagerten Probenmaterial wiederholt. Bei dieser Untersuchung diente ovines Rückenmarkgewebe als Positivkontrolle. Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.2.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)

Bei diesem Versuch wurden die frisch entnommenen Proben von jeweils 10 g zunächst separat in einer Moulinette zerkleinert. Die Moulinette wurde vor jeder neuen Probe gründlich mit heißem Wasser und Seifenlauge gereinigt. In diesem Versuchsansatz wurden ovines Nieren-, Muskel-, Herz- sowie Rückenmarkgewebe (Kapitel 3.1.1.4) untersucht.

Die mit der Moulinette zerkleinerten Proben wurden wie folgt weiterverarbeitet:

• für die RNA-Extraktion wurden je 100 mg natives Gewebe abgewogen,

• je 1 g von jeder Probe wurde abgewogen und in ein separates 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert, für

30 Minuten bei 80°C Wasserbadtemperatur erhitzt. Daraufhin wurden wiederum von jeder Probe je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen.

Das verbliebene native Gewebe wurde bei 4°C gelagert. Dieser Versuch wurde mit dem bei 4°C eingelagerten Probenmaterial nach 24 Stunden wiederholt, und ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten) In einem dritten Versuch wurde von frischem Muskel-, Herz-, Rückenmarkgewebe je 10 g entnommen, in einer gründlich gesäuberten Moulinette jeweils separat zerkleinert und wie folgt aufgeteilt:

• für die RNA-Extraktion wurden 100 mg natives Gewebe von jeder Probe abgewogen,

• zweimal je 1 g von jeder Probe abgewogen, in ein separates 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und im Wasserbad mit 95°C Wassertemperatur erhitzt. Die Erhitzungsdauer betrug für den einen Satz der Proben 30 Minuten und den anderen Satz Proben 60 Minuten. Daraufhin wurden für die RNA-Extraktion wiederum je 100 mg abgewogen.

Dieser Versuch wurde ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.4.3 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystems auf den Nachweis porciner und oviner GFAP-mRNA

Anteile des peripheren Nervengewebes von Schaf und Schwein (Kapitel 3.1.1.2) wurden zunächst mit einem sauberen Messer fein zerkleinert und dann wie folgt aufgeteilt:

• 100 mg natives Gewebe wurden für die RNA-Extraktion abgewogen,

• das restliche Gewebe wurde in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert und anschließend im Wasserbad für 60 Minuten bei 80°C Wassertemperatur erhitzt. Daraufhin wurden von jeder Probe je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen.

Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt.

3.2.5 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den