Saures Gliafaserprotein (GFAP) als Marker für ZNS-Gewebe in

Das saure Gliafaserprotien (GFAP) gehört zu den Typ III Intermediärfilamentproteinen (IF), die im Zentrum eine hoch konservierte α-Helix Struktur aufweisen, die von nicht helicalen Kopf- und Schwanz-Domänen flankiert werden (BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994;

NIELSEN et al. 2002). GFAP zählt zu den wichtigsten Strukturproteinen der reifen Astrogliazellen (FUCHS u. CLEVELAND 1998). Das GFAP kommt somit hauptsächlich in Geweben des zentralen (ZNS) und peripheren Nervensystems (PNS) vor (ENG et al. 2000).

Im ZNS-Gewebe sind hohe Gehalte an GFAP enthalten. Das Rückenmarkgewebe enthält mit 55000-220000 ng/mg, gemessen im colorimetrischen ELISA, die höchsten Konzentrationen an GFAP (Schmidt et al. 1999). Das Gehirngewebe enthält mit 9000-55000 ng/mg ein Drittel und die peripheren Nerven, wie der Nervus ischiadicus, mit 13,5-51 ng/mg weniger als 1 % des GFAP-Gehaltes des Rückenmarks (Schmidt et al. 2001).

Aufgrund des hauptsächlich gewebespezifischen Auftretens des GFAP, kann es als Marker zum Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleisch und Fleischerzeugnissen genutzt werden. Zur Zeit existieren folgende Nachweisverfahren zum Nachweis von GFAP in mit Gehirngewebe dotierten Fleischerzeugnissen: (a) immunchemische Nachweisverfahren, zu denen der GFAP-Westernblot (LÜCKER et al. 2000; OVERHOFF et al. 2002) und der Immunosorbent-F-ELISA (SCHMIDT et al. 1999a, 2001) gehören und (b) immunhistochemische Nachweisverfahren mit Antikörpern gegen GFAP (LOVE et al. 2000; TERSTEEG et al.

2002; AUPERLE et al. 2002; LÜCKER et al. 2002a).

5.1.1 GFAP-mRNA als Marker für ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen

Die Regulation der Stabilität der mRNA in Säugetierzellen ist sehr komplex (ROSS 1995;

GUHANIYOGI u. BREWER 2001) und die Halbwertszeiten reichen wenigen Minuten bis zu über 24 Stunden. Stabile mRNAs kodieren meist für reichlich vorhandene und hoch-konservierte Proteine (ROSS 1995) oder stammen aus Geweben, bei denen die Translation

zeitlich verlegt ist, wie z.B. bei Oozyten (SPIRIN 1994). In einer Studie von LUKIW et al.

(1990) hatte die mRNA von GFAP, neben der mRNA des humanen Neurofilament L, postmortal eine relativ lange Halbwertszeit (HWZ). In weiteren Studien zur postmortalen Stabilität von mRNA an humanem Gehirngewebe zeigte sich, dass ein langsamer Gefrierprozess die Stabilität der mRNA negativ beeinflussen kann (JOHNSTON et al. 1997).

Tiefgekühlt wurde die mRNA in humanem Gehirngewebe dagegen kaum geschädigt (BURKE et al. 1991; LEONARD et al. 1993; EASTWOOD et al. 1995; YASOJIMA et al.

2001) und konnte noch 1 – 2 Stunden nach dem Auftauen zuverlässig nachgewiesen werden (YASOJIMA et al. 2001).

In der Literatur werden fünf Untergruppen von GFAP-mRNA unterschieden. GFAP-αmRNA repräsentiert die stärkste Untergruppe und ist hauptsächlich in Astrozyten zu finden (BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994). Daneben existieren noch GFAP-βmRNA in den Zellen des PNS, GFAP-γmRNA, die in Zellen außerhalb des Gehirns expremiert wird, sowie GFAP-δmRNA und GFAP-εmRNA, die im ZNS expremiert werden (BRENNER 1994).

Neben den Verfahren, die auf dem Nachweis des Proteins (GFAP) als Marker für ZNS-Gewebe beruhen, wurden auch molekularbiologische Verfahren entwickelt, die auf dem Nachweis gewebespezifisch expremierter GFAP-mRNA basieren (LANGE et al. 2002;

SEYBOLDT et al. 2003). Hierbei kann, bei gegebener Gewebespezifität, die in der mRNA enthaltene Sequenzinformation zum tierartspezifischen Nachweis des detektierten ZNS-Gewebe genutzt werden (SEYBOLDT et al. 2003). Untersuchungen zur ZNS-Gewebespezifität der GFAP-mRNA beim Rind ergaben, dass aus nativen zerkleinerten Herz-, Muskel- und ZNS-Gewebe über den Zeitraum von sieben Tagen ein positives GFAP-mRNA Signal detektiert werden konnte (SEYBOLDT et al. 2003). Nach Einwirkung von Hitze (70°C, 20 min.) waren die Signale von Herz- und Muskelgewebe jedoch nicht mehr nachweisbar und damit die Gewebespezifität dieser Nachweismethode gegeben (SEYBOLDT et al. 2003).

5.1.2 RT-PCR Systeme zum Nachweis von GFAP-mRNA

In dieser Dissertation wurde die mRNA des GFAP nach Extraktion der Gesamt-RNA mittels RT-PCR nachgewiesen und als Marker für bovines ZNS-Gewebe verwendet (SEYBOLDT et al. 2003). Die RT-PCR gehört zu den indirekten Nachweismethoden für mRNA (JOHNSTON et al. 1997). Direkte Methoden zur Detektion von mRNA sind beispielsweise der Northern Blot oder die in-situ-Hybridisation. Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode, um mRNA in geringen Konzentrationen über einen längeren Zeitraum zu detektieren (FITZPATRICK et al. 2001; YASOJIMA et al. 2001).

Es wurden drei verschiedene RT-PCR-Systeme angewandt. Das erste System verwendete die Oligonukleotidprimer „GFAPforw“ und „GFAPrev“, die an die Exonregionen 3 und 4, welche das Intron 3 umgeben, binden und ein 168 bp großes Fragment der GFAP-mRNA amplifizieren. Da die verwendeten Primer jeweils in einem anderen Exonbereich binden, ist das entstehende 168 bp große GFAP-mRNA Amplifikat spezifisch für die mRNA. Signale, die von der DNA des GFAP Gens stammen, weisen eine Größe von 957 bp auf (SEYBOLDT et al. 2003). Somit kann auf eine Kontrolle zur Überprüfung einer möglichen DNA-Kontamination verzichtet werden. Bei Verwendung dieser RT-PCR konnte ZNS-Gewebe vom Rind in zerkleinerten Fleisch und in einem pasteurisierten Fleischerzeugnis sicher detektiert werden (s. Kapitel 2.4.5).

In den hier vorgestellten Untersuchungen zur Detektion von porcinem ZNS-Gewebe in einem Fleischerzeugnis zeigte sich, dass bei Verwendung der PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev die Nachweisgrenze über 5 % Gehirngewebebeimengung lag (s. Kapitel 4.2.2.1).

Hinweise auf eine geringere Nachweisbarkeit porciner GFAP-Sequenzen mit diesen Primern finden sich auch bei SEYBOLDT et al. (2003). Um an Sequenzinformationen der 168 bp großen Amplifikate der GFAP-mRNA für die RFLP zu gelangen und um für die Tierart Schwein sensitivere Primer auswählen zu können, wurde anhand der Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA eine weitere RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 etabliert. Mit dieser RT-PCR wurde beim Rind ein Sequenzabschnitt der GFAP-mRNA von 399 bp Größe amplifiziert, der weiter in den Bereich der das Intron 3 umschließenden Exons 3 und 4 reichte (Kapitel 4.3, Abb. 7). Diese RT-PCR führte auch bei den Tierarten Schwein / Wildschwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild und Rotwild zu einem 399bp großen Amplifikat.

Durch die Sequenzierung dieser 399 bp großen GFAP-mRNA Amplifikate, konnte nachfolgend für die Tierart Schwein / Wildschwein eine dritte RT-PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 entwickelt werden, die einen Sequenzabschnitt der porcinen GFAP-mRNA amplifiziert, der dem Sequenzabschnitt der bovinen GFAP-mRNA von 168 bp Größe entspricht. Die Primer GFAPpork1 und GFAPpork2 entsprechen den Primern GFAPforw und GFAPrev des ersten RT-PCR Systems und sind entsprechend der porcinen mRNA-Sequenz modifiziert. Mit dieser RT-PCR wurden beim Schwein die Untersuchungen zur Gewebespezifität und Detektion von porcinem Gehirngewebe in Fleischerzeugnissen durchgeführt.

Dagegen gelang es nicht mit den hier verwendeten RT-PCR Systemen Amplifikate der GFAP-mRNA von Huhn und Pute zu erhalten. Der wahrscheinlichste Grund hierfür sind phylogenetisch bedingte Unterschiede der GFAP-mRNA zwischen der Klasse der Vögel und der Säugetiere.

5.2 Gewebespezifität und Stabilität der GFAP-mRNA von Rind, Schwein