3 Material und Methoden
4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität von GFAP-mRNA
4.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schweinegewebe
Bei der Untersuchung der porcinen Gewebe wurde die PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 verwendet (s. Kapitel 3.2.6.3).
4.1.1.1 Untersuchung nativer Gewebe
Zunächst wurden verschiedene Gewebe des Schweins (s. Tabelle 16) im nativen Zustand, d.h.
bei 4°C gekühlt, etwa vier Stunden post mortem (T 0) und 24 Stunden post mortem (T 1) auf das Vorhandensein der GFAP-mRNA überprüft. Dieser Versuch wurde zweimal durchgeführt.
Tabelle 16: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen Schweinegeweben Versuch 1 Versuch 2 Gewebe
T 0a T 1b T 0a T 1b
Lunge - - - +
Leber + - + +
Niere + - + +
Milz + - + +
Lymphknoten - + - -
Muskulatur + + + +
Herz + + + +
Rückenmark + + + +
Gehirn + + + +
a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m.
Aus diesen Ergebnissen wurde ersichtlich, dass neben den Geweben Rückenmark und Gehirn auch die anderen untersuchten Gewebe an Tag 0, sowie an Tag 1, ein positives GFAP-mRNA-Signal ergeben können (Tabelle 16). Basierend auf den Untersuchungen zur Gewebespezifität der GFAP-mRNA beim Rind (SEYBOLD et al 2003) wurde das Gewebe beim Schwein dem nachfolgend beschriebenen Erhitzungsversuch unterzogen.
4.1.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)
Bei diesen Versuchen wurde neben den erhitzten Geweben jeweils eine Kontrolle mit nativem Gewebe mitgeführt, um eine Aussage darüber treffen zu können, ob das untersuchte Gewebe im nativen Zustand ein positives GFAP-mRNA-Signal hatte, und dieses Signal durch den angewandten Erhitzungsschritt inaktiviert werden konnte.
Dieser Versuchsaufbau wurde zur besseren statistischen Absicherung dreimal wiederholt. Die bei diesen Untersuchungen erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 17: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (75°C, 20 min) Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
nativ erhitzt nativ erhitzt nativ Erhitzt Gewebe
T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b
Lunge + + - - - + - - -
Leber + + - - -
Niere + + - - + + - - + + - -
Milz + + + - + - + - + - + -
Lymphknoten + - - -
Muskulatur + + + - + + + + + + + +
Herz + + + + + + + + + + + +
Rückenmark + + + + + + + + + + + +
Gehirn + + + + + + + + + + + +
a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m.
Wie aus Tabelle 17 ersichtlich, konnten mit der Erhitzung der Gewebe auf 75°C im Wasserbad für 20 Minuten nur die Signale der GFAP-mRNA von Lunge, Leber, Niere und Lymphknoten sicher inaktiviert werden. Der Nachweis der GFAP-mRNA aus Milz-, Muskulatur-, Herz-, Rückenmark- und Gehirngewebe ließ sich durch die Erhitzung nicht beeinflussen (Tabelle 17). In Abbildung 1 ist beispielhaft der Nachweis porciner GFAP-mRNA aus Versuch 1 Tag 0 in einer Agarosegelelektrophorese mit einem 2,5 prozentigen Agarosegel dargestellt. Die Abbildung zeigt zum einen die 168 bp großen Banden der GFAP-mRNA Amplifikate, die bei allen untersuchten nativen Gewebe und in dem erhitzten Gewebe bei Milz, Muskulatur, Herz, Rückenmark und Gehirn vorhanden sind. Die etwa 950 bp großen Banden zeigen das Amplifikationsprodukt der genomischen DNA der bovinen GFAP-mRNA.
Marker
natives Gewebe erhitztes Gewebe (75°C, 20 min).
168 bp ca. 957 bp
Abb. 1: Nachweis porciner GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten (75°C, 20 min) Geweben durch RT-PCR
Beispiel einer Agarosegelelektrophorese (2,5 %iges Agarosegel) (4.1.1.2, Versuch 1 Tag 0)
Marker puC 19/Msp I (Bandengrößen von oben nach unten: 489/501 bp, 404 bp, 331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp, 110/111 bp)
4.1.1.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)
Basierend auf den vorangegangenen Versuchen sollte hier untersucht werden, inwieweit eine höhere und längere Temperatureinwirkung auf das Gewebe, die Signale der GFAP-mRNA inaktivieren kann. Im Vergleich zu dem vorangegangenen Versuch wurde bei dieser Untersuchung das Gewebe vor der weiteren Verarbeitung in einer Moulinette zerkleinert, um die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Anhäufung von peripheren Nervenfasern in dem beprobten Gewebestück zu minimieren. Es wurde eine Kontrolle mit nativem Gewebe mitgeführt. Die Darstellung der Ergebnisse dieser Untersuchungen ist in der nachfolgenden Tabelle 18 wiedergegeben.
Tabelle 18: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (80°C, 30 min) Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
nativ erhitzt nativ erhitzt nativ Erhitzt Gewebe
T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b
Lunge - - - - + + - - -
Leber - - - - + + - - - + - -
Niere + + - - + + - - + - - -
Milz + + - - + + - - + - - -
Lymphknoten - - - - + + - - -
Muskulatur + + - - + + + + + + - -
Herz + + + + + + + + + + - +
Rückenmark + + + + + + + + + + + +
Gehirn + + + + + + + + + + + +
a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die Signale der GFAP-mRNA des Milzgewebes durch die höhere Temperatureinwirkung inaktiviert werden konnten. Bei Muskelgewebe konnten die Signale der GFAP-mRNA nicht sicher inaktiviert werden. Bei Versuch 2 war sowohl an Tag 0 als auch an Tag 1 noch ein positives Signal nach der Erhitzung des Muskelgewebes zu finden. Die Detektion der GFAP-mRNA-Signale des Herzgewebes wurden durch den Erhitzungsvorgang kaum beeinflusst. Nur bei Versuch 3 war an Tag 0 das Signal der GFAP-mRNA durch die Erhitzung inaktiviert worden. Auch bei diesem Versuchsansatz hatte sich gezeigt, dass die Signale der GFAP-mRNA des Rückenmark- und Gehirngewebes gegenüber dieser Temperatureinwirkung beständig waren.
4.1.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)
Diese Versuche basierten auf den Ergebnissen aus den Versuchen 4.1.1.3, bei denen sich gezeigt hatte, dass die GFAP-mRNA-Signale von Muskulatur- und Herzgewebe nach einer Erhitzung auf 80°C in Wasserbad für 30 Minuten und der Zerkleinerung durch die Moulinette nicht inaktiviert werden konnten. Deshalb wurden diese Gewebe einer besonders hohen Erhitzung ausgesetzt, um zu untersuchen, ob die Signale der GFAP-mRNA überhaupt durch den Faktor Temperatur zu inaktivieren waren. Der Zerkleinerungsschritt mit der Moulinette wurde beibehalten. Parallel zu der Erhitzungsdauer von 30 Minuten wurde ein Versuchsansatz
mit einer Erhitzungsdauer von 60 Minuten mitgeführt, um zu prüfen, ob neben der Temperaturerhöhung die Verlängerung der Erhitzungsdauer die Signale der GFAP-mRNA inaktivieren kann.
Tabelle 19: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (95°C, 30 min;
95°C, 60 min)
a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m.
Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass die GFAP-mRNA-Signale von Muskulatur- und Herzgewebe erst an Tag 1 bei einer Temperatureinwirkung von 95°C für 60 Minuten sicher zu inaktivieren waren (Tabelle 19). An Tag 0 war bei einem der drei Versuche noch ein positives Signal der GFAP-mRNA aus Muskelgewebe aufgetreten (Tabelle 19). Bei Rückenmark- und Gehirngewebe waren die Signale der GFAP-mRNA gegenüber dieser hohen Temperatureinwirkung beständig (Tabelle 19).
4.1.1.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 h) und nachfolgend erhitzter Gewebe (80°C, 30 min)
Da sich die Signale der GFAP-mRNA von Muskulatur- und Herzgewebe erst durch massive Temperatureinwirkung inaktivieren ließen (s. Kapitel 4.1.1.4, Tabelle 19), sollte in einem weiteren Versuchsansatz, im Hinblick auf eine mögliche Inaktivierung der GFAP-mRNA-Signale, zum einen die Wirkung von Kälte und zum anderen die Kombination von Kälte- und Wärmeeinwirkung auf den Nachweis der GFAP-mRNA in Muskulatur- und Herzgewebe untersucht werden. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle 20 dargestellt.
Versuche 1 – 3 nativ 95°C für 30
Minuten
95°C für 60 Minuten Gewebe
T 0a T 1b T 0a T 1b T 0a T 1b
Muskulatur +/+/+ +/+/- +/+/- +/-/- +/-/- -/-/-
Herz +/+/+ +/+/- -/+/- -/-/- -/-/- -/-/-
Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+
Gehirn +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+
Tabelle 20: Nachweis von GFAP-mRNA aus tiefgekühlten (-20°C, 24 h) und nachfolgend erhitzten Geweben (80°C, 30 min)
Versuche 1 – 3
nativ gefroren gefroren + erhitzt Gewebe
T 0a/T 1b T 1b T 1b
Muskulatur +/+/+ +/+/+ +/+/+
Herz +/+/+ +/+/+ +/+/+
Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+
a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m.
Es zeigte sich, dass der alleinige Gefrierprozess, sowie ein Gefrierprozess mit nachfolgender Erhitzung beim Schwein unter den gegebenen Bedingungen keinen inaktivierenden Einfluss auf den Nachweis der GFAP-mRNA des Muskulatur-, Herz- und des Rückenmarkgewebes hatten.
Somit konnte das Signal der GFAP-mRNA in Muskulatur- und Herz-, Rückenmark- und Gehirngewebe nicht durch starke Erhitzung (s. Kapitel 4.1.1.4) inaktiviert werden. In Muskulatur-, Herz- und Rückenmarkgewebe konnten die GFAP-mRNA-Signale weder durch alleinige Kältewirkung, noch durch eine Kombination von Kälte- und Wärmewirkung (s.
Kapitel 4.1.1.5) inaktiviert werden. Somit könnten beim Schwein die GFAP-mRNA-Signale des Muskel- und Herzgewebes bei der Nutzung der GFAP-mRNA als Marker für ZNS-Gewebe als mögliche Störsignale in einem Fleischprodukt auftreten.
4.1.1.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 min)
In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob aus peripherem Nervengewebe ein GFAP-mRNA Nachweis möglich war und ob sich das Signal durch Erhitzung inaktivieren ließ. Als Kontrolle diente eine mitgeführte porcine Rückenmarkgewebeprobe. In der nachfolgenden Tabelle 21 sind die Ergebnisse zusammengefasst.
Tabelle 21: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativem und erhitztem peripheren porcinen Nervengewebe (PNS)
Die Untersuchungen haben gezeigt, dass die Signale der GFAP-mRNA aus Geweben des peripheren Nervensystems nachweisbar waren, und sich durch die Erhitzung nicht inaktivieren ließen, so dass mit durch PNS-Gewebe verursachten falsch positiven GFAP-mRNA-Signalen bei der Untersuchung eines Fleischerzeugnisses gerechnet werden muss.