Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen mittels RT-PCR

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS – Gewebe in Fleischerzeugnissen

mittels RT-PCR

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Alexandra Küfen

aus Köln

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. B. Nowak Univ.-Prof. Dr. S. Wenzel Dr. C. Seyboldt

1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. B. Nowak 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. H. Groschup

Tag der mündlichen Prüfung: 2. Dezember 2003

Meinen Eltern und meinem Mann

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung... 1

2 Wissenschaftliches Schrifttum... 2

2.1 Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE)... 2

2.1.1 Ätiologie der TSE... 2

2.1.2 Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier ... 4

2.1.2.1 Scrapie (Traberkrankheit, Wetzkrankheit, Gnubberkrankheit)... 4

2.1.2.2 Übertragbare Enzephalopathie der Nerze (transmissible mink encephalopathy- TME) ... 5

2.1.2.3 Chronic Wasting Disease (CWD) ... 5

2.1.2.4 Feline spongiforme Enzephalopathie (FSE) ... 6

2.1.2.5 Bovine Spongiforme Enzephalopathie... 6

2.1.3 Transmissible spongiforme Enzephalopathien des Menschen... 8

2.1.3.1 Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD)... 8

2.1.3.2 Kuru... 9

2.1.3.3 Fatale Familiäre Insomnie (FFI)... 9

2.1.3.4 Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) ... 10

2.1.3.5 Neue Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD) ... 10

2.2 Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE... 12

2.3 Mögliche Exposition des Menschen mit BSE-Erreger-haltigem Gewebe und Maßnahmen zum vorbeugenden Verbraucherschutz ... 17

2.3.1 Kontamination von Schlachtprodukten mit ZNS-Gewebe... 17

2.3.2 Verwendung von ZNS-Gewebe und ZNS-Gewebe haltigem Rohmaterial bei der Herstellung von Fleischerzeugnissen ... 19

2.4 Methoden zur Detektion von ZNS in Fleisch- und Fleischerzeugnissen ... 21

2.4.1 Nachweis ZNS-spezifischer Fettsäuren und Cholesterin ... 21

2.4.1.1 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode (GC-MS) ... 21

2.4.1.2 Nachweis von Cholesterin... 22

2.4.2 Immunchemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe... 23

2.4.2.1 Nachweis der neuronenspezifischen Enolase (NSE)... 23

2.4.2.2 Nachweis des sauren Gliafaserproteins (GFAP) ... 24

2.4.2.3 Nachweis weiterer Marker für ZNS-Gewebe... 24

2.4.3 Immunhistochemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe ... 25

2.4.4 Direkter Nachweis von PrP^SC... 26

2.4.5 Molekularbiologische Methoden zum Nachweis von mRNA ... 27

2.5 Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)... 29

2.6 Polymerase-Kettenreaktion-Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (PCR- RFLP) ... 30

2.7 Stabilität der mRNA... 32

2.8 Saures Gliafaserprotein (GFAP) ... 34

3 Material und Methoden... 36

3.1 Material ... 36

3.1.1 Organe und Gewebe ... 36

3.1.1.1 Zentrales Nervengewebe ... 36

3.1.1.2 Peripheres Nervengewebe ... 38

3.1.1.3 Organe und Gewebe vom Schwein ... 38

3.1.1.4 Organe und Gewebe vom Schaf... 38

3.1.2 Rohstoffe für die Fleischerzeugnisse ... 39

3.1.2.1 Fleisch ... 39

3.1.2.2 Fett... 39

3.1.2.3 Leber... 39

3.1.3 Zutaten und Zusatzstoffe für die Herstellung von Fleischerzeugnissen... 40

3.1.4 Chemikalien und Enzyme ... 40

3.1.5 Puffer und Lösungen ... 42

3.1.6 Laborgeräte, Laborhilfsmittel und Verbrachsmaterialien ... 42

3.1.7 Geräte für die Herstellung von Fleischerzeugnissen... 43

3.2 Methoden... 44

3.2.1 Herstellung der Brühwurstgrundmasse ... 44

3.2.1.1 Brühwurstgrundmasse mit Rindermuskulatur... 44

3.2.1.1.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse... 44

3.2.1.1.2 Brät für stark erhitze Brühwursterzeugnisse ... 45

3.2.1.2 Brühwurstgrundmasse mit Schweinemuskulatur ... 45

3.2.1.2.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse... 45

3.2.2 Leberwurst... 46

3.2.3 Molekularbiologische Methoden... 47

3.2.3.1 RNA-Extraktion ... 47

3.2.3.2 Reverse Transkription ... 48

3.2.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR) ... 49

3.2.3.3.1 PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev ... 49

3.2.3.3.2 PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 ... 50

3.2.3.3.3 PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 ... 52

3.2.3.4 Reinigung von DNA für die nachfolgende Sequenzierung... 53

3.2.3.5 Gelelektrophorese... 53

3.2.3.6 Untersuchungen zur Tierartspezifität des GFAP-mRNA-Nachweises ... 54

3.2.4 Untersuchungen zur Gewebespezifität des Gliafaserprotein-mRNA-Nachweises .. 55

3.2.4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schweinegeweben ... 55

3.2.4.1.1 Untersuchung nativer Gewebe ... 55

3.2.4.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)... 55

3.2.4.1.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)... 56

3.2.4.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)... 56

3.2.4.2 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schafgeweben... 57

3.2.4.2.1 Untersuchung nativer Gewebe ... 57

3.2.4.2.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)... 57

3.2.4.2.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)... 57

3.2.4.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)... 58

3.2.4.3 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystems auf den Nachweis porciner und oviner GFAP-mRNA... 58

3.2.5 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis boviner GFAP-mRNA... 59

3.2.5.1 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in unterschiedlich erhitzten Brühwursterzeugnissen ... 59

3.2.5.1.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 75°C Wasserbadtemperatur ... 59

3.2.5.1.2 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 95°C Wasserbadtemperatur ... 60

3.2.5.1.3 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 100°C Wasserbadtemperatur ... 60

3.2.5.2 Herstellung von Vollkonserven... 61

3.2.5.3 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in einen Leberwursterzeugnis... 62

3.2.5.4 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystem (PNS) auf den Nachweis boviner GFAP-mRNA in einem Brühwursterzeugnis ... 63

3.2.6 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis

porciner GFAP-mRNA ... 64

3.2.6.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 80°C Wasserbadtemperatur ... 64

4 Ergebnisse... 66

4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität von GFAP-mRNA... 66

4.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schweinegewebe ... 66

4.1.1.1 Untersuchung nativer Gewebe ... 66

4.1.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)... 67

4.1.1.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)... 69

4.1.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)... 70

4.1.1.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 h) und nachfolgend erhitzter Gewebe (80°C, 30 min) ... 71

4.1.1.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 min) ... 72

4.1.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schafgewebe ... 73

4.1.2.1 Untersuchung nativer Gewebe ... 73

4.1.2.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)... 74

4.1.2.3 Untersuchung erhitzter Gewebe (80°C, 30 Minuten)... 75

4.1.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten, 95°C, 60 Minuten)... 76

4.1.2.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 Stunden) und nachfolgend erhitzter Gewebe (80°C, 20 Minuten) ... 76

4.1.2.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 Minuten) ... 77

4.2 Fleischerzeugnisse, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an Gehirngewebe dotiert wurden ... 78

4.2.1 Fleischerzeugnisse dotiert mit Rindergehirngewebe... 78

4.2.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten (Gartemperatur 75°C)... 78

4.2.1.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten (Gartemperatur 95°C)... 80

4.2.1.3 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten (Gartemperatur 100°C)... 81

4.2.1.4 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Leberwürsten ... 83

4.2.1.5 Untersuchung von Vollkonserven... 84

4.2.1.5.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten (Vollkonserve I) ... 84

4.2.1.5.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten (Vollkonserve II) ... 86

4.2.1.6 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit peripherem Nervensystem (PNS) dotierten Brühwürsten ... 87

4.2.2 Fleischerzeugnisse dotiert mit porcinem Gehirngewebe... 89

4.2.2.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten aus Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern GFAPforw und GFAPrev... 90

4.2.2.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten aus Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 ... 90

4.3 Sequenzierung der 399 bp GFAP-mRNA-Amplifikate verschiedener Tierarten .... 92

4.4 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)... 97

5 Diskussion... 101

5.1 Saures Gliafaserprotein (GFAP) als Marker für ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen... 101

5.1.1 GFAP-mRNA als Marker für ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen... 101

5.1.2 RT-PCR Systeme zum Nachweis von GFAP-mRNA... 103

5.2 Gewebespezifität und Stabilität der GFAP-mRNA von Rind, Schwein und Schaf104 5.3 GFAP-mRNA Nachweis zur Detektion von bovinem ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen... 107

5.3.1 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem ZNS-Gewebe ... 107

5.3.2 Leberwurst mit bovinem ZNS-Gewebe ... 108

5.3.3 Vollkonserven ... 109

5.3.4 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem PNS-Gewebe ... 110

5.3.4.1 G1^a... 112

5.4 RFLP des 168 bp GFAP-mRNA Fragmentes zur Identifizierung boviner GFAP- mRNA ... 113

6 Zusammenfassung... 115

7 Summary... 117

8 Literatur... 119

9 Tabellenverzeichnis... 161 10 Abbildungsverzeichnis... 164

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung Abl. Amtsblatt Abk. Abkürzung

ARE Arginin rich elements (Arginin reiche Elemente)

BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin bp Basenpaar

BSE bovine spongiforme Enzephalopathie bzw. beziehungsweise ca. circa

CCN Zerebrocorticalnekrose cCJD klassische Creutzfeld-Jakob

Erkrankung cDNA copy-DNA

CJD Creutzfeld-Jakob Erkrankung vCJD neue Variante der Creutzfeld-

Jakob Erkrankung cm Zentimeter

CWD chronic wasting disease of elk DEPC Diethylpyrocarbonat

d.h. das heißt

DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNase Desoxyribonuklease

dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat dGTP Desoxyguanintriphosphat dNTP Desoxynucleotidtriphosphat DTT 1,4-Dithio-D,L-threitol dTTP Desoxythymintriphosphat

EEG Elektroenzephalogramm EG Europäische Gemeinschaft ELISA Enzyme-Linked Immunosorbant

Assay et al. et alii

EU Europäische Union fCJD familiäre CJD

FAME Fettsäuremethylestern

F-ELISA Fluoreszent- Enzyme-Linked

Immunosorbant Assay

FFI fatalen familiären Insomnie FSE feline spongiforme

Enzephalopathie

GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker- Syndrom

°C Grad Celsius g Gramm

g Fallbeschleunigung GC-MS Gaschromatographie-

Massenspektrometrie GFAP glialfibrillary acidic protein

(saures Gliafaserprotein) HCl Salzsäure

HWZ Halbwertzeit iCJD iatrogene CJD

IF Intermediärfilamentproteinen INV intrgriertes Nachweisverfahren IRMM Institut für Referenzmaterialien

und –messungen

ISTMEM Infektiöse septikämische, thrombosierende Meningo- Enzephalo-Myelitis kb kilobase

KCl Kaliumchlorid kg Kilogramm l Liter

LMBG Lebensmittel- und

Bedarfsgegenständegesetz MBP basisches Myelinprotein M Molar

max. maximal µl Mikroliter µm Mikrometer Met Methionin mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute

ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar

mRNA messenger Ribonukleinsäure mtDNA mitochondralen DNA

RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RNase Ribonuklease mRNP Ribonukleoprotein NaOCl Natriumhypochlorit NaOH Natronlauge

(NH4)2SO4 Ammoniumsulfat neg. negativ

no. Number (Nummer) NF Neurofilament ng Nanogramm nm Nanometer

NSE Neuronen spezifische Enolase OIE Office International des

Epizooties

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

pH pondus hydrogenii pos. positiv

PNS peripheres Nervensystem

Prion proteinaceous infectious particle PRNP Prionproteingen

PrP Prionprotein

PrP^C zelluläres Prion-Protein PrP^RES Proteinase K-resistentes Prion-

Protein

PrP^SC pathologischen Form des Prion- Proteins

RFLP Restriktionsfragment Längenpolymorphismus RNA Ribonucleic acid

(Ribonukleinsäure) RBP RNA-Bindungs-Proteine RT reverse Transkriptase S. Seite

s. siehe

SAF Scrapie assoziierte Fibrillen sCJD sporadischen CJD

SDS Dodecylhydrogensulfat Natriumsalz

s.o. siehe oben

SRM spezifiziertes Risikomaterial SSC Scientific Steering Committee Tab. Tabelle

TME transmissible mink encephalopathie

TRIS Tris(hydroxymethyl)-amino- methan

TSE transmissible spongiforme Enzephalopathie

U Unit (Einheit) u. und

u.a. unter anderem

UK United Kingdom (Vereinigtes Königreich)

UpM Umdrehungen pro Minute USA United States of Amerika UTR untranslated region (nicht

kodierender Bereich) UV Ultraviolett

Val Valin

z.B. zum Beispiel

ZNS zentrales Nervensystem

≅ entspricht

 geschütztes Warenzeichen

TM trade mark

< kleiner als

> größer als

§ Paragraph

1 Einleitung

Das Auftreten einer neuen Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD), die 1995 erstmals in Großbritannien diagnostiziert wurde (BATEMAN et al. 1995; BRITTON et al.

1995; WILL et al. 1996), wird auf den Eintrag von hochinfektiösen, TSE-Erreger-haltigen Rohstoffen, wie dem zentralnervösen Gewebe (ZNS-Gewebe) von Wiederkäuern (SSC 1999, 2001, 2002) in den Lebensmittelkreislauf zurückgeführt (WILL et al. 1996; BONS et al. 1997, 1999; COULTHART u. CASHMAN 2001). Aus tierseuchenrechtlichen sowie aus Gründen des Verbraucherschutzes wurden bestimmte Wiederkäuergewebe als spezifiziertes Risikomaterial (SRM) ausgewiesen, das unschädlich beseitigt werden muss (EU 2001c, 2000). Hinsichtlich des vorbeugenden Verbraucherschutzes sowie zur Verhinderung der weiteren Ausbreitung von TSE ist es wichtig, Testmethoden zur Detektion von SRM- Materialien zu entwickeln (EU 2001b; LÜCKER et al. 1999, 2001; WEYANDT 2001).

Zur Zeit stehen bereits verschiedene Nachweisverfahren zur Detektion von ZNS-Gewebe zur Verfügung. Dies sind zum einen immunologische Methoden, die ZNS-spezifische Proteine wie z.B. das sauere Gliafaserprotein (GFAP) oder neuronenspezifische Enolase (NSE) als Marker nutzen. Zwei Testverfahren, ein GFAP-ELISA (SCHMIDT et al. 1999) sowie ein NSE-Westernblot (LÜCKER et al. 1999) sind kommerziell verfügbar. Mit diesen ist ein semiquantitativer Nachweis von ZNS-Gewebe möglich. Mit allen bisher entwickelten Verfahren, die auf dem Nachweis bestimmter Proteine beruhen, sind jedoch Aussagen über die Tierart des nachgewiesenen ZNS-Gewebes nicht eindeutig. Zum anderen ist der Nachweis dieser Gewebe über die stabilen Fettsäuren der Sphingomyeline, (NIEDERER u.

BOLLHALDER 2001) erreichbar. Mit diesem Verfahren scheinen auch tierart- und altersbezogene Aussagen zum nachgewiesenen ZNS-Gewebe möglich.

Mit einem RT-PCR Verfahren zum Nachweis boviner GFAP-mRNA (SEYBOLDT et al.

2003) gelang es erstmals, gewebsspezifisch auftretende mRNA als Marker für bovines ZNS- Gewebe in Fleischerzeugnissen zu nutzen. Das Ziel des vorliegenden Dissertationsvorhabens ist, den Einfluss verschiedener fleischtechnologischer Parameter bei unterschiedlichen Fleischerzeugnissen auf den Nachweis der GFAP-mRNA des Rindes zu untersuchen.

Weiterhin wird die Anwendung dieser Methode zur Detektion von ZNS-Gewebe der Tierarten Schwein und Schaf überprüft. Mit Hilfe dieser Arbeiten sollen Aussagen zur Anwendungsbreite und zu Sensitivität und Spezifität dieses Testverfahrens erarbeitet werden.

2 Wissenschaftliches Schrifttum

2.1 Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE)

Bei den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) handelt es sich um eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen mit infektiösem Charakter, die bei Menschen und Tieren vorkommen können. Allen TSE ist gemeinsam, dass sie eine lange Inkubationszeit haben, die von einem Jahr bis zu mehreren Jahrzehnten andauernden kann und von der Eintrittspforte der Erreger sowie dem Genotyp des Wirtes abhängig ist (DIRINGER et al.

1994; AGUZZI 2002; DORMONT 2002). Die TSE verlaufen chronisch progressiv und enden tödlich (SCHICKER 1998). Um einzelne Nervenzellen legt sich eine Amyloidschicht, die über die Einschränkung des Zellstoffwechsels zum langsamen Absterben der Nervenzelle führt. Es findet keine Immunreaktion statt, da das Amyloid als körpereigene Substanz angesehen wird (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002). Histopathologisch zeigt sich dieser Prozess als Spongiose, Amyloidose, Hyperastrozytose, Astrogliose und Neuronenverlust. Klinisch treten bei den TSE zunehmende Störungen im Verhalten, der Sensibilität und der Motorik auf (VANDEVELDE et al. 1992; SCHICKER 1998;

DORMONT 2002; STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002).

2.1.1 Ätiologie der TSE

Es gibt viele Theorien über die eigentliche Natur des TSE-Erregers, da die physikochemische Natur des Erregers noch nicht eindeutig geklärt ist (GAREIS 1995; DORMONT 2002;

SMITH 2002). Am häufigsten wird die „Protein-only“-Hypothese von Stanley Prusiner postuliert (PRUSINER 1982), der den Namen „Prion“ für „small, proteinous infectious particle“ prägte (RAIDEN et al. 2001; SMITH 2002). Das gesunde Prion-Protein (PrP^C) wird beim Menschen von dem PrP-Gen (PRNP) kodiert und besitzt eine dreidimensionale Struktur aus drei α-Helices, zwei schmalen antiparallelen β-Faltblatt-Strukturen und einem langen flexiblen Schwanz. Es ist mit einem Glykosyl-Phophatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker) an die Zellmembran von Neuronen, Gliazellen und Zellen des lymphoretikulären Systems gebunden (RIEK et al. 1996, 1997). Die genaue Funktion von PrP^C ist nicht bekannt (PRUSINER et al.

1990; PRUSINER 1993). Da transgene Mäuse, denen das PRNP fehlt, für das TSE-Agens oder eine Prion Infektion nicht empfänglich sind, wird vermutet, dass das Prion-Protein eine Schlüsselrolle bei der TSE-Erkrankung spielt (BÜELER et al. 1993). Von dem PrP^C lässt sich

die pathologische Form des Prion-Proteins (PrP^SC) unterscheiden. Die beiden Proteine haben die gleiche Aminosäuresequenz, aber eine unterschiedliche Konformation und chemische Eigenschaften. Im Gegensatz zu PrP^C hat PrP^SC einen höheren Anteil an β-Faltblatt- Strukturen (RIEK et al. 1998), ist wasserunlöslich und wird von Proteinase K nicht vollständig abgebaut. Es bleibt ein Rest von 27 – 30 kDa, den man auch Proteinase K- resistentes Prion-Protein (PrP^RES) nennt (PRUSINER 1992; COLLINGE et al. 1996; HILL et al. 1997). Bei der Krankheitsentstehung lagert sich PrP^SC an der Zelloberfläche an PrP^C an und verursacht eine Konformationsänderung der Sekundärstruktur der Proteine. Somit wird aus PrP^C ein PrP^SC, das wiederum andere PrP^C umwandeln kann (HORIUCHI u. CAUGHEY 1999; JACKSON et al. 1999; CAUGHEY u. BARON 2002). Auch in-vitro ist es gelungen PrP^C unter Zugabe von PrP^SC zu PrP^SC zu konvertieren (RAYMOND et al. 1997). PrP^SC assoziiert in den Endolysosomen zu Fibrillen, die auch Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) genannt werden (MERZ et al. 1981; PRUSINER 1983). Diese Amyloid-Plaque lagert sich in den Endolysosomen der Nervenzellen ab (COHEN et al. 1994) und führt über die Einschränkung des Zellstoffwechsels zum Zelltod. Histologisch sind konfluierende schwammartige Veränderungen im umgebenden Neuropil nachweisbar (PRUSINER 1995;

CHAZOT et al. 1996; WILL et al. 1996). Dieser Prozess verläuft umso schneller, je ähnlicher PrP^SC dem wirtseigenen PrP^C ist (SCOTT et al. 1989, 1999; PRUSINER et al. 1990). Durch Glykolysierung entstehen drei Glykoformen von PrP. Mit den relativen Proportionen der drei Glykoformen zueinander und der Größe des unglykolysierten PrP^RES Fragments im Westernblot, kann man die verschiedenen TSE-Agens-Stämme unterscheiden (COLLINGE et al. 1996; PARCHI et al. 1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997; ASANTE et al. 2002).

Die TSE-Erreger sind resistent gegenüber Prozessen, die Nukleinsäuren inaktivieren (PRUSINER et al. 1980; PRUSINER 1982). Prozesse, die Proteine inaktivieren, reduzieren bei PrP^SC die Infektiosität, wie z.B. Behandlung mit hohen Proteinase K-Konzentrationen (PRUSINER 1983), SDS, Diethylpyrocarbonat, Guanidin-Thiocyanat und Harnstoff (KIMBERLIN u. WALKER 1978; PRUSINER et al. 1980, 1981; BROWN et al. 1986). Eine komplette Dekontamination erfolgt bei:

(a) Autoklavieren bei 132°C für 1,5 Stunden; (b) Behandlung mit 1 M Natriumhydroxid für 1 Stunde bei 20°C; (c) Behandlung mit Natriumhypochlorit (NaOCl, 2% Chlorit) für 1 Stunde bei 20°C (ERNST u. RACE 1993; TAYLOR et al. 1994; DORMONT 2002a). Die in der Entscheidung 96/449/EG (EU 1996) festgeschriebene Methode zur Dekontamination ist die Erhitzung auf 133°C bei einem Druck von drei bar für 20 Minuten (TAYLOR et al. 1995).

Diese Methode erreicht eine Reduktion der Infektiosität um den Faktor 10^2,2 (SCHREUDER et al. 1998).

Neben der Prion-Protein Hypothese gibt es auch noch alternative Hypothesen über die Erregerherkunft, wie beispielsweise die „Virino-Hypothese“ (DIRINGER et al. 1994;

AGUZZI 2002; SMITH 2002), die Hypothese des unkonventionellen Virus (SMITH 2002) sowie die Hypothese des molekularen Mimikry durch das Bakterium Actinobacter (EBRINGER et al. 1997; SMITH 2002).

2.1.2 Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier

Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier sind Erkrankungen des ZNS, die durch Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins (PrP^SC, PRUSINER 1982;

OESCH et al. 1985) in Form von Amyloid Plaques verursacht werden, die zum Zelltod der Nervenzellen führen (GIESE et al. 1995). Die Erkrankungen sind horizontal, transplazentar und oral über das Futter übertragbar (SCHICKER 1998). Bisher sind die nachfolgend beschriebenen TSE bei Tieren bekannt.

2.1.2.1 Scrapie (Traberkrankheit, Wetzkrankheit, Gnubberkrankheit)

Die bei Schafen und Ziegen vorkommende Erkrankung ist seit über 200 Jahren bekannt. Sie wurde erstmals 1922 von MCGOWAN beschrieben (MCGOWAN 1922). Die Erkrankung ist in Großbritannien enzootisch und betrifft jährlich 0,5 % – 1 % aller Schafe (AGUZZI u.

WEISSMANN 1997). Am häufigsten erkranken Tiere im Alter von 2 – 4 Jahren (SCHICKER 1998). Die Ansteckungswege verlaufen vertikal von dem Muttertier über die Plazenta auf das Lamm (BORCHERS et al. 2002) sowie horizontal durch das Muttertier während der Geburt und in der ersten Zeit nach der Geburt (FOOTE et al. 1993). Übertragungswege sind infektiöse innere Gewebe, wie z.B. die Milz, und kontaminierte Weiden (WISNIEWSKI. et al. 1996). Die Erkrankung verläuft protrahiert und führt nach chronischer Abmagerung sowie Festliegen zum Tod (BORCHERS 2002). Histologisch zeigen sich im Cerebellum spongiforme Degenerationen der Substancia grisea sowie damit einhergehende Astrogliose und amyloide Plaques, die aus assoziierten unlöslichen Fibrillen bestehen, und Scrapie- assoziierte Fibrillen (SAF) genannt werden (BORCHERS 2002). Zur Zeit sind 20 verschiedene Scrapie-Erreger-Stämme bekannt, die sich hinsichtlich der Dauer der

Inkubationszeit und der Ausbildung der neuropathologischen Veränderungen unterscheiden (GOLDMANN et al. 1994; SIMON 1996). Es ist bisher noch nicht eindeutig erwiesen, ob Scrapie die Ursache für BSE ist. Es gibt sowohl Studien, bei denen die Untersuchung der PrP^RES – Glykoform Unterschiede zwischen Schaf-Scrapie und Schaf-BSE aufzeigen (HILL et al. 1998) und Studien, bei denen dieser Unterschied nicht nachweisbar ist (BARON et al.

1999).

2.1.2.2 Übertragbare Enzephalopathie der Nerze (transmissible mink encephalopathy-TME)

TME wurde erstmals von HARTSOUGH u. BURGER beschrieben und brach 1947 zum ersten Mal in einer Nerzzuchtfarm in den USA aus (HARTSOUGH u. BURGER 1965). TME ist weltweit sehr selten und betrifft hauptsächlich die Zuchtfähen. Obwohl die genaue Ursache nicht bekannt ist, nimmt man an, dass die Verfütterung TME-Erreger-haltiger Rinder- und Schafkadaver für den Ausbruch verantwortlich sind, da bisher nur Zuchtfähen, die mit Fleisch gefüttert wurden, erkrankt sind (BORCHERS 2002). Klinisch zeigt sich die TME als progressive neurologische Dysfunktion mit histopathologisch nachweisbaren degenerativen Veränderungen im ZNS-Gerwebe (BORCHERS 2002).

2.1.2.3 Chronic Wasting Disease (CWD)

Die seit 1974 bekannte CWD ist eine weitere progressive neurologische Erkrankung mit degenerativen Veränderungen im ZNS-Gewebe und wurde erstmals von WILLIAMS u.

YOUNG beschrieben (WILLIAMS u. YOUNG 1980, 1982). CWD kommt hauptsächlich in den USA und Kanada vor und betrifft wildlebende, gezähmte Rocky Mountain Elche, Wapiti- und Maultierhirsche sowie Rehe und Elche der USA. Die auffälligsten Symptome sind Unfruchtbarkeit, chronische Auszehrung und Orientierungslosigkeit (WILLIAMS u. YOUNG 1980, 1982; BORCHERS 2002). Als Ursache für die CWD wird kontaminiertes Tiermehl aus Europa angenommen (BORCHERS 2002). Untersuchungen der PrP^RES – Proteine haben ergeben, dass sich die PrP^RES – Glykoformen von Scrapie-infizierten Rindern, Scrapie- infizierten Schafen und CWD-infizierten Cerviden nicht unterscheiden, aber von der PrP^RES – Glykoform von BSE-infizierten Rindern gut unterscheidbar sind (RACE et al. 2002). Deshalb wird angenommen, dass CWD von Schaf-Scrapie stammt (RAYMOND et al. 2000; RACE et

al. 2002). Eine Übertragung von CWD auf den Menschen wird bisher nicht angenommen und gilt als unwahrscheinlich (BELAY et al. 2001).

2.1.2.4 Feline spongiforme Enzephalopathie (FSE)

Diese Erkrankung trat 1990 das erste Mal bei Katzen im Vereinigten Königreich auf (LEGGET et al. 1990). Auch hier wird vermutet, dass der Verzehr von PrP^SC – kontaminiertem Futter die Ursache für die Erkrankung ist. Bei der Übertragung von FSE auf Mäuse, zeigen sich bei diesen BSE-ähnliche Symptome.

2.1.2.5 Bovine Spongiforme Enzephalopathie

Die bovine spongiforme Enzephalopathie ist eine Einzeltiererkrankung, die 1985 erstmals im Vereinigten Königreich aufgetreten ist (WELLS et al. 1987). In Deutschland wurde der erste BSE-Fall am 26. 11. 2000 festgestellt (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002).

Mittlerweile gibt es im Vereinigten Königreich über 183000 (OIE 2003a) und in der restlichen Welt bis insgesamt etwa 4110 (Stand: Juli 2003) amtlich gemeldete BSE-Fälle (OIE 2003b). Für die besonders starke Ausbreitung der BSE im Vereinigten Königreich sind unter anderem technische Änderungen der Tierkörper-Aufbereitung in der Tierkörperbeseitigungsanstalt eine Ursache, die im Verlauf der 70er und 80er Jahre stattgefunden haben (FRIES 2002). Mittlerweile sind die Zahlen der pro Jahr neu hinzukommenden BSE-Fälle rückläufig, was auf die Wirkung der eingeleiteten Schutz- und Kontrollmaßnahmen zurückzuführen ist (FRIES 2002). Die Inkubationszeit liegt bei 2,5 – 11 Jahren (WILESMITH u. RYAN 1992; WELLS et al. 1995; WELLS u. WILESMITH 1995).

Rinder zwischen vier und fünf Jahren erkranken am häufigsten (BRAUN 1998; SCHICKER 2001). Der Hauptinfektionsweg von BSE erfolgt oral über mit TSE-Erregern kontaminiertes Futter (SCHICKER 1998). In verschiedenen Studien ist es gelungen, durch orale Exposition von mit BSE-Agens kontaminierten Futter eine spongiforme Enzephalopathie bei Primaten (BONS et al. 1999) und Mäusen, nicht aber bei Hamstern, (RAYMOND et al. 1997) hervorzurufen. Aufgrund der Hinweise auf die orale Übertragbarkeit, wurde in der Europäischen Union die Verfütterung von Proteinen, die von Säugetieren stammen, an Wiederkäuer verboten (EU, 1994; OIE 1996, 2000). Die Infektionsroute von TSE verläuft von den peripheren Geweben zum Gehirngewebe (WILL u. IRONSIDE 1999). Die Erkrankung verläuft chronisch-progressiv. Klinisch zeigen sich Abmagerung und Milchleistungsrückgang

(AUSTIN u. SIMMONS 1993) sowie eine zunehmende Änderung des Verhaltens, der Sensibilität und des Bewegungsablaufes. Nach 2 – 6 Monaten endet die Erkrankung mit dem Tod (WILESMITH u. RYAN 1992; BRAUN et al. 1998, 1999; STAUFENBIEL u.

HÄMÄLÄINEN 2002). Bei natürlich erworbener BSE sind PrP^SC in den dorsalen Wurzelganglien und im Knochenmark nachweisbar, während bei experimentell erworbener BSE auch im distalen Ileum PrP^SC nachweisbar sind (COLLEE u. BRADLEY 1997; WILL u.

IRONSIDE 1999). Labordiagnostisch (d.h. in Vollblut, Blutserum, Harn, Pansen, Liquor cerebrospinalis) lassen sich keine diagnostisch relevanten Veränderungen feststellen (BRAUN et al. 1998a, 2001; SCHICKER 2001). Differentialdiagnostisch sind folgende Krankheiten abzuklären (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002): Tetanie, nervöse Form der Ketose, Gebärparese, Cerebrocorticalnekrose (CCN), hepatogene Enzephalopathie, Leberkoma, Urämie, Bleivergiftung, Tollwut, Tetanus, Botulismus, Listeriose, Aujeszkysche Krankheit, infektiöse septikämische thrombosierende Meningo-Enzephalo-Myelitis (ISTMEM) und sporadische ZNS-Erkrankungen mit einer Enzephalitis. Zur Diagnose der BSE am lebenden Tier wird von BRAUN et al. (1997, 1998a, 1998b) ein Untersuchungsgang beschrieben, dessen Schwerpunkte auf der Untersuchung der Körperhaltung, dem Bewegungsablauf und dem Verhalten der Tiere gegenüber akustischen, optischen und taktilen Reizen liegen. Jedoch ist bei der Anwendung dieses Testes bei Tieren mit schwacher oder untypischer Symptomatik ein erhebliches Maß an Erfahrung notwendig (GROSCHUP u.

STOLZE 2002). Momentan noch nicht verfügbare Testverfahren am lebenden Tier stützen sich auf (a) den Nachweis von PrP^SC im Blut, z.B. durch die Flouressenz-Korrelations- Spektroskopie oder die „Protein-Misfolding-Cyclic-Amplification“-Reaktion, (b) den Nachweis von Surrogatmarkern, (c) den Nachweis von Protein 14-3-3 im Liquor cerebrospinalis oder (d) den Nachweis von PrP^SC im Urin (GROSCHUP u. STOLZE 2002).

Beim toten Tier stützt sich die Diagnose auf den Nachweis der pathologischen Form des Prion-Proteins (PrP^SC) und die Histopathologie (GROSCHUP u. STOLZE 2002). Bei der Diagnose einer TSE mittels PrP^SC nutzt man bestimmte Eigenschaften des PrP^SC (z.B.: Proteinase K-Resistenz, die glykolysierte Form, molekulares Gewicht der unglykolysierten Form), um die einzelnen TSE voneinander zu unterscheiden (JEFFREY et al. 2001a).

BSE kann auch bei Schafen vorkommen. Untersuchungen mit experimentell infizierten Schafen (FOSTER et al. 1993, 1996, 2001a, 2001b) haben gezeigt, dass bei Schaf-BSE der für Scrapie typische Hautjuckreiz fehlt (FOSTER et al. 2001a, 2001b). Bei BSE ist die PrP^SC-

Akkumulation im zentralen und peripheren Nervengewebe nachweisbar. Bei Scrapie kommt die PrP^SC-Akkumulation zusätzlich in fast allen lymphoiden Geweben, wie z.B. der Milz, vor (FOSTER et al. 2001b). Experimentell ist es gelungen, bei Schafen BSE auf oralem Wege über kontaminiertes Futter hervorzurufen (FOSTER et al. 2001c; JEFFREY et al. 2001). Ob BSE auch natürlich bei Schafen vorkommt, ist zur Zeit nicht bekannt, kann aber auch nicht ausgeschlossen werden (FERGUSON et al. 2002).

2.1.3 Transmissible spongiforme Enzephalopathien des Menschen

Bei den humanen TSE unterscheidet man zwischen der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD), der neuen Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD), Kuru, der fatalen familiären Insomnie (FFI) sowie dem Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS).

2.1.3.1 Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD)

Die Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD) ist die häufigste humane TSE und wurde schon von den Neurologen H. G. CREUTZFELDT (1920) und A. JAKOB (1921) erstmals beschrieben (CREUTZFELDT 1920; JAKOB 1921). Mittlerweile wird zwischen vier Typen von CJD unterschieden. Typ 1-3 werden zu den klassischen Formen der CJD (cCJD) gezählt (PARCHI et al. 1996) und man unterscheidet hier zwischen der sporadischen (90 % der Fälle), der iatrogenen (< 1 % der Fälle) und der familiären Form (5 – 10 % der Fälle) (ALPEROVITH et al. 1994). Die Inzidenz liegt weltweit bei 0,6 – 1,5 Fälle pro eine Million Einwohner und Jahr.

Das Durchschnittsalter der Erkrankten liegt bei der sporadischen CJD bei 65 Jahren, bei der familiären CJD bei 50 – 55 Jahren und bei der sehr seltenen iatrogenen Form bei etwa 30 Jahren (BROWN et al. 1984, 1992). Symptomatisch zeigt sich bei der sporadischen CJD (sCJD) eine rasch fortschreitende Demenz begleitet von Sprachstörungen, Myklonien, Hypokinese, Akinese, starker Rigidität oder Spastiken. Der Tod erfolgt bei 90 % der Patienten innerhalb eines Jahres nach Krankheitsbeginn (AGUZZI 2002). Die nicht erbliche iatrogene CJD (iCJD) und die erbliche familiäre CJD (fCJD) zeigen eine ähnliche Symptomatik.

Patienten mit einer Homozygotie für Valin oder Methionin an Codon 129 des humanen PrP- Genes (PRNP) erkranken schneller an cCJD, als Patienten mit einer Heterozygotie an diesem Genort, die mit jahrelanger Verzögerung erkranken (BAKER et al. 1991; COLLINGE et al.

1991; PALMER et al. 1991; AGUZZI 2002). Die Ursachen der iCJD sind Transplantationen

von Cornea (DUFFY et al. 1974) oder Dura mater (NISBET 1989), ungenügend sterilisierte Instrumente in der Neurochirurgie (WILL u. MATTHEWS 1982) und das Verabreichen von Wachstumshormonen aus humanen Hypophysen (BROWN 1988). Die Diagnose der cCJD am lebenden Menschen basiert auf dem klinischen Erscheinungsbild sowie dem Nachweis (a) charakteristischer Veränderungen im EEG (FEIDEN 1998; SCHICKER 1998), (b) der unspezifischen Hirnatrophie durch bildgebende Verfahren und (c) der Erhöhung bestimmter Proteingehalte im Liquor der Patienten, wie z. B. die Neuronen spezifische Enolase (NSE) und das 14.3.3-Protein (ZERR et al. 1995). Die endgültige Diagnose findet erst am toten Patienten histopathologisch anhand der Spongiose und Astrogliose in den tiefen kortikalen Schichten der Großhirnrinde sowie den plaqueartigen Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins, die synaptisch oder perivakuolär auftreten, statt (BUDKA u.

HAINFELLNER 1996; AGUZZI 2002).

2.1.3.2 Kuru

Kuru ist eine exotische Form der CJD, die bei der „Fore“-Urbevölkerung der nördlichen Provinzen Neu Guineas vorkommt. Das klinische Erscheinungsbild zeigt Tremor, progressive zerebelläre Ataxie und Demenz. Der Tod tritt nach drei Monaten bis drei Jahren ein. Ursache ist ein ritueller Kannibalismus, der bis in die fünfziger und sechziger Jahre des vergangenen Jahrhunderts weit verbreitet war (GAJDUSEK u. ZIGAS 1957, 1959). Die Patienten infizieren sich auf dermalem, oralem und nasalem Wege (ALPERS u. GAJDUSEK 1965).

2.1.3.3 Fatale Familiäre Insomnie (FFI)

Die Fatale Familiäre Insomnie (FFI) ist eine sehr seltene Erkrankung, die 1986 erstmals bei einer norditalienischen Familie von LUGARESI beschrieben wurde (LUGARESI et al. 1986).

Das Erkrankungsalter der Patienten liegt zwischen 40 und 60 Jahren. Symptomatisch kommt es zu Schlaflosigkeit, traumähnlichen Episoden und Gedächtnisschwund sowie zu autonomen und motorischen Störungen. Histopathologisch sind Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins gering ausgeprägt oder fehlen ganz (AGUZZI 2002). Genetisch lässt sich bei allen Patienten an dem PrP-Gen an Position 178 eine Punktmutation nachweisen, bei der Aspartat zu Asparagin mutiert ist (PRUSINER 1998).

2.1.3.4 Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS)

Das Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) wurde 1928 erstmals von GERSTMANN beschrieben (GERSTMANN 1928). Die Inzidenz liegt weltweit bei 1:10⁸ Erkrankungen pro Einwohner und Jahr. Das Erkrankungsalter wird mit durchschnittlich 40 Jahren angegeben. Die Erkrankung dauert etwa fünf Jahre. Klinisch sind spinozerebelläre Ataxie mit Blickparesen, Pyramidenbahnzeichen und Demenz zu beobachten.

Histopathologisch sind im Kleinhirn und im Großhirn multizentrische, plaqueartige Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins nachweisbar (AGUZZI 2002).

Genetische Ursache der Erkrankung ist eine Punktmutation im Codon 102 in einem der PRNP-Allele, bei der Prolin zu Leucin wird (HSIAO et al 1989). Später wurden noch andere Mutationen im PRNP-Leseraster gefunden, die GSS auslösen (HSIAO et al. 1992; AGUZZI 2002).

2.1.3.5 Neue Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD)

Die neue Variante der CJD (vCJD) ist der vierte Typ der CJD (COLLINGE et al. 1996; HILL et al. 1999). Die Erstbeschreibungen dieser Erkrankung fanden 1995 durch BRITTON et al.

und BATEMAN et al. sowie 1996 durch WILL et al. im Vereinigten Königreich (BATEMAN et al. 1995; BRITTON et al. 1995; WILL et al. 1996) und kurze Zeit später in Frankreich durch CHAZOT et al. statt (CHAZOT et al. 1996). vCJD kommt bisher nur in Ländern vor, in denen auch BSE auftritt und wurde zeitlich versetzt zur BSE am häufigsten in Großbritannien diagnostiziert (STOLTENBURG-DIDINGER 2002). Im Unterschied zur cCJD betrifft die vCJD junge Menschen. Bisher bekannt gewordene klinische Fälle traten im Alter zwischen 12 und 52 Jahren auf (COUSENS et al. 1999). Im Gegensatz zur cCJD stehen bei der vCJD klinisch zunächst Persönlichkeitsstörungen oder Psychosen im Vordergrund. Im späteren Krankheitsstadium kommen Demenz, Dysästhesie und Ataxie hinzu (FEIDEN 1998;

AGUZZI 2002). Bei der vCJD sind keine charakteristischen EEG-Veränderungen nachweisbar. Die Erkrankungsdauer scheint im Vergleich zu den cCJD verlängert zu sein, da der Tod der Patienten durchschnittlich nicht nach etwa 12 Monaten, sondern erst nach 14 Monaten eintritt (KRETZSCHMAR et al. 1996). Histopathologisch zeigt sich bei den plaqueartigen Ablagerungen der PrP^SC bei der vCJD eine Besonderheit: um die plaqueartigen Ablagerungen findet sich ein Ring aus spongiformen Veränderungen, die man aufgrund der blumenartigen Form „floride Plaques“ nennt (WILL u. ZEIDLER 1996; DORMONT 2002).

Genetisch weisen alle Patienten mit vCJD eine Homozygotie für Methionin im Codon 129 des PrP-Genes auf. Versuche mit transgenen Mäusen, die humanes PrP exprimieren, dass an Codon 129 homozygot für Methionin ist, zeigen den neuropathologischen und molekularen Phänotyp von vCJD, unabhängig davon, ob die Mäuse mit BSE- oder vCJD-Prionen infiziert worden sind (ASANTE et al. 2002).

Zur Zeit wird diskutiert, dass der Eintrag von erregerhaltigen Rohstoffen in den Lebensmittelkreislauf eine Ursache für vCJD sein kann (WILL et al. 1996; BONS et al. 1997, 1999; COULTHART u. CASHMAN 2001; HILDEBRANDT et al. 2001). Hinweise darauf geben (a) das zeitlich versetzte Auftreten von BSE bei Rindern und vCJD beim Menschen in Ländern mit hoher BSE-Inzidenz (COUSENS et al. 2001), (b) die TSE-Infektiosität boviner Gewebe im Bioassay (FRASER u. FOSTER 1994; WELLS et al. 1998, 1999;

HILDEBRANDT et al. 2001), (c) die biologische und biochemische Typisierung der einzelnen TSE-Stämme (COLLINGE et al. 1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997;

SCOTT et al. 1999), (d) die Ähnlichkeit des Glykolysierungsprofils und des Molekulargewichts des unverdauten Restes der pathologischen Form des Prion-Proteins (PrP^RES) zwischen der BSE-Form und der vCJD-Form (BRUCE et al. 1993, 1994, 1997;

COLLINGE et al. 1996; HILL et al. 1997; MCLEAN et al. 1998; IRONSIDE et al. 2000;

BUDKA et al. 2002) sowie (e) die Ähnlichkeit der Pathologie von vCJD und sekundär passagierten BSE (LASMÉZAS et al. 1996, 2001; WILL et al. 1996, 2000; ZEIDLER et al.

2000).

2.2 Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE

Die bisher ergriffenen Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE haben das Ziel die Kontamination der Tierkörper und damit den Eintrag von möglichem BSE-Risikomaterial in die humane Nahrungskette soweit wie möglich zu verhindern. Deswegen werden folgende Schutzmaßnahmen zur Prävention der weiteren Verbreitung von BSE und BSE-Erreger- haltigem Material durchgeführt:

(a) Lückenlose Erfassung der Herkunft der Rinder (nach CONRATHS et al. 2002);

(b) Anzeigepflicht der Erkrankung (EU 1990);

(c) Verfütterungsverbot von proteinhaltigen Erzeugnissen und Fetten aus Gewebe warmblütiger Landtiere und von Fischen an alle landwirtschaftlichen Nutztiere, die der Lebensmittelgewinnung dienen. Dieses Verbot gilt nicht für Milch- und Milcherzeugnisse sowie für proteinhaltige Erzeugnisse und Fette aus Geweben von Fischen, die an Fische verfüttert werden sollen (ANONYM 2000a; EU 2000b, 2001, 2002b);

(d) Beschränkungen und Verbote des innergemeinschaftlichen Verbringens von lebenden Tieren und Erzeugnissen tierischen Ursprungs gemäß der Verordnung (EG) Nr.

999/2001 (EU 2001b, 2002a);

(e) Durchführung von BSE-Schnelltests bei über 24 Monate alten Rindern aus normaler Schlachtung (ANONYM 2000b, 2001a; EU 2000c) sowie bei über 24 Monate alten Rindern, die aus besonderen Anlass not- oder krankgeschlachtet werden, und stichprobenweise bei über 24 Monate alten Rindern, die verendet sind oder getötet wurden (EU 2001b);

(f) Durchführung von stichprobenartigen BSE-Schnelltests bei über 18 Monate alten, zum menschlichen Verzehr und nicht zum menschlichen Verzehr geschlachteten Schafe und Ziegen (EU 2001b);

(g) Epidemiologisches Überwachungsprogramm mit möglicher Tötung bei Erkrankungen mit Störungen des ZNS zu diagnostischen Zwecken (EU 1998, 2001d, 2002a);

(h) Nach Feststellung von BSE die in der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 Maßnahmen hinsichtlich der amtlichen Schlachttier- und Fleischuntersuchung sowie der Untersuchung verendeter oder getöteter Rinder durchzuführen (EU 2001b);

(i) Entfernung und Vernichtung von spezifizierten Risikomaterial (SRM) (ANONYM 2000b, 2001b; EU 1990a, 1995, 1999, 2001c; 2002c);

(j) Änderung tierkörperbeseitigungsrechtlicher Vorschriften (ANONYM 2000c)

(k) Maßnahmen im Rahmen des Arbeitsschutzes, wie z.B.: Empfehlungen für den Umgang mit SRM bei der epidemiologischen Überwachung und Untersuchung der Verdachtsfälle sowie spezielle Schutzmaßnahmen für die Beschäftigten (ANONYM 2001c, 2001d);

(l) Tierkörper und Teile von Tierkörpern verendeter oder nicht zum Zwecke der Gewinnung von Lebensmitteln getöteter Tiere nicht zur Herstellung von Futtermitteln für Tiere, die zur Gewinnung von Lebensmitteln bestimmt sind, zu verwenden (EU 2001a, 2001e, 2001f,; ANONYM 2001);

(m) Regeln hinsichtlich des Handels und der Einfuhr mit lebenden Schafen und Ziegen (EU 2003a, 2003c) sowie der Züchtung von TSE-resistenten Schafen (EU 2003b)

(n) Überprüfung der Fertigerzeugnisse hinsichtlich möglicherweise erhaltener Gewebeanteile des ZNS (LÜCKER et al.1999).

Die zur Zeit bei dem BSE-Screening angewandten Tests (BSE-Schnelltests, EU 2000a) verwenden zum Nachweis des PrP^SC den caudalen Obexbereich und die Medulla oblongata, die am abgetrennten Rinderkopf durch das Foramen magnum entnommen werden (OIE 2000). Aus diesen Regionen ist bei den meisten an BSE erkrankten Rindern in einem frühen Stadium der Erkrankung die höchste Konzentration an akkumulierten PrP^SC nachweisbar (WELLS et al. 1989; VAN KEULEN et al. 1995; GROSCHUP u. STOLZE 2002). Die nachfolgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die zur Zeit verfügbaren BSE-Schnelltests, die in den Testsystemen angewandte Methode und die Dauer der Durchführung bis zum Erhalt der Ergebnisse (nach MOYNAGH et al. 1999).

Tabelle 1: BSE – Schnelltests

Name Firma Vertrieb Methode

Capture ELISA

Commisseriat á l´Engerie Atomique (CEA)

(Frankreich)

BioRad (München)

Sandwich-ELISA mit monoklonalen

Antikörper, Dauer: 7-8 h

Prionics Check Testkit

Prionics AG (Schweiz)

Roche Diagnostic (Mannheim)

Western Blot mit monoklonalen

Antikörper;

Dauer: 7-8 h

ELISA Test Enfer Technology Ltd. (Irland)

Abbott GmbH (Wiesbaden)

Chemiluminescent- ELISA mit polyklonalen

Antikörper;

Dauer: ca. 4 h

So verwendet der Capture ELISA zum Nachweis von PrP^RES einen Sandwich-ELISA mit monoklonalen Antikörpern. Die Durchführung des Tests bis zum Erhalt der Ergebnisse dauert 7 – 8 Stunden (Tabelle 1). Die gleiche Zeit wird auch bei dem Prionics Check Testkit

gebraucht, um PrP^RES mittels eines Westernblot mit monoklonalen Antikörpern nachzuweisen (Tabelle 1). Bei dem ELISA Test wird ein Chemiluminescent-ELISA verwendet, um PrP^RES nachzuweisen. Die Durchführung dieses Tests benötigt vier Stunden (Tabelle 1).

An der Entwicklung von BSE-Schnelltests wird auch weiterhin geforscht. Das Institut für Referenzmaterialien und –messungen (IRMM) hat im März 2003 BSE-Schnelltests folgender Firmen dem Evaluierungsverfahren unterzogen: ID Lelystad (Niederlande), PerkinElmer Life Sciences (UK), Prionics A.G. (Schweiz), University of California in San Francisco (USA) und MRC Prion Unit, Imperial College (UK) (IRMM 2003). Das Scientific Steering Committee (SSC) hat im März 2003 zwei BSE-Tests der Firmen Prionics (Schweiz, „LIA Test“) und InPro („CDI Test“) zugelassen (SSC 2003).

Die Diagnose der BSE-Schnelltests wird im positiven Fall mit folgenden zugelassenen Diagnostikmethoden des Internationalen Tierseuchenamts überprüft (nach GROSCHUP u.

STOLZE 2002):

(a) OIE-Western Blot: vor dem eigentlichen Western Blot werden die von PrP^SC gebildeten Scrapie-assoziierten Fibrillen aufwendig präpariert (DIRINGER et al. 1997), so dass die Sensitivität dieses Testes höher ist, als die der BSE-Schnelltests;

(b) immunhistochemische Untersuchung histologischer Präparate: Detektion des PrP^SC mittels des PrP-spezifischen monoklonalen Antikörper (SCHALLER et al. 1999);

(c) histopathologische Untersuchung: Nachweis der charakteristischen Gehirngewebeläsionen (WELLS et al. 1987; EHRENSPRINGER u. VANDEVELDE 1998), zu denen die spongiformen Veränderungen (WELLS et al. 1989, 1995; LIBERSKI et al. 1992a), die Vakuolenbildung in den neuronalen Perikarya (FRANKHAUSER et al. 1972; LIBERSKI et al. 1992a, 1992b) und die Gliose (Astrozytose) gehören (ZLOTNIK 1958; WELLS et al.

1987, 1989);

(d) elektronenmikroskopische Darstellung aufgereinigter SAF (MERZ et al. 1984; WELLS et al. 1987; SCOTT et al. 1990, 1991).

Eine weitere Möglichkeit zur Abklärung von BSE ist der Mäuse-Inokulationstest, bei dem Mäusen möglicherweise infiziertes Gewebematerial, meist Gehirngewebe, intracerebral verabreicht wird und im Fall der Erkrankung der Mäuse BSE nachgewiesen wird. Diese Tests sind aufgrund der langen Inkubationszeiten von 250 bis 300 Tagen sehr aufwendig und werden deswegen überwiegend zu Forschungszwecken eingesetzt (GROSCHUP u. STOLZE 2002).

Mittels Mäuseinokulationstests und der Messung von Scrapietitern ließ das Scientific Steering Committee (SSC) die potentielle BSE-Infektiosität der Organe von Rind, Schaf und Ziege untersuchen (SSC 1999). Die nachfolgende Tabelle 2 gibt einen Überblick über die hoch-, mittel- und geringgradig infektiösen Gewebe bei Rind, Schaf und Ziege, von denen in Fall einer BSE-Erkrankung eine Infektiosität ausgehen kann (nach Hildebrandt et al. 2001):

Tabelle 2: potentielle BSE-Infektiosität verschiedener Gewebe

„Auf der Grundlage der TSE-Pathogenese und des Seuchenstatus des Herkunfts- oder Haltungslandes“ werden „bestimmte Wiederkäuergewebe“, die ein Infektionsrisiko aus tierseuchenrechtlichen Gründen für andere Tiere und aus verbraucherschutzrechtlichen Gründen für den Menschen darstellen können, „als SRM ausgewiesen“ (EU, 2001c, L 147/2).

Zu diesen sogenannten SRM (ANONYM 2000b, 2001b; EU 2001c; LÜCKER et al. 2001) zählen „Schädel, einschließlich Hirn und Augen, Tonsillen, Wirbelsäule ausschließlich der Schwanzwirbel, aber einschließlich der Spinalganglien und des Rückenmarks von über zwölf Monate alten Rindern sowie der Darm von Duodenum bis Rektum und das Mesenterium von Rindern jeden Alters“ und weiterhin „Schädel einschließlich Gehirn und Augen, Tonsillen und Rückenmark von Schafen und Ziegen, die über zwölf Monate alt sind oder bei denen ein bleibender Schneidezahn das Zahnfleisch durchbrochen hat und die Milz von Schafen und Ziegen aller Altersklassen“ (EU 2002, L45/12).

Infektiosität Schaf, Ziege Rind

Hoch

Gehirn, Rückenmark, Augen,

Paravertebralganglien, Wirbelsäule, Milz, Kopf

ohne Zunge, Lunge

Gehirn, Rückenmark, Augen,

Paravertebralganglien, Wirbelsäule, Dura mater,

Hypophyse, Kopf ohne Zunge, Lunge Mittel

Darm von Duodenum bis Rektum, Mandeln, Placenta, Uterus, foetales Gewebe, Nebenniere,

Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphknoten

Gering

Leber, Pankreas, Thymus, Knochenmark, Röhrenknochen, Nasenschleimhaut,

periphere Nerven

2.3 Mögliche Exposition des Menschen mit BSE-Erreger-haltigem Gewebe und Maßnahmen zum vorbeugenden Verbraucherschutz

Die Kontrolle der Lebensmittel und die Überwachung der Lebensmittelherstellung ist wichtig für den Verbraucherschutz und die Lebensmittelindustrie, die aus wirtschaftlichen Gründen auf das Vertrauen der Verbraucher in ihre Produkte angewiesen ist (ANKLAM u.

BATTAGLIA 2001). Lebensmittelqualität und Lebensmittelsicherheit sind eng miteinander verbunden. Im Umgang mit Lebensmitteln ist eine zuverlässige Risikoeinschätzung wichtig für ein angemessenes Risikomanagement (ANKLAM u. BATTAGLIA 2001). Jedoch werden Lebensmittel aus Kostengründen bestimmte unerwünschte Zutaten zugesetzt oder verfälscht, die dann bei sehr fein zerkleinerten Produkten durch histologische Methoden nur sehr schwer detektierbar sind (LUMLEY 1996; MILLER 1991). Dies gilt im Besonderen auch für ZNS- Material, das zu den SRM gehören kann (WENISCH et al. 1999; LÜCKER et al. 2001). Im Hinblick auf den vorbeugenden Verbraucherschutz ist die mögliche Gefährdung der humanen Gesundheit durch Aufnahme von TSE-Erreger-haltigem Material zu beachten. Mögliche Gefahren gehen von kontaminierten Fleisch und Fleischerzeugnissen, Arzneimitteln (EU 2002d) und der Arbeit mit erregerhaltigem Material (ANONYM 2001c, 2001d) aus.

2.3.1 Kontamination von Schlachtprodukten mit ZNS-Gewebe

Untersuchungen zur Kontamination der Gewebe des Rindes mit bovinem ZNS-Gewebe während des Schlachtprozesses haben ergeben, dass diese nicht ausgeschlossen werden kann (LÜCKER et al. 2002). Es ist durchaus möglich, dass Fleisch während der Schlachtung mit ZNS-Gewebe verunreinigt wird (KELLY et al. 2000, BROWN et al. 2001). Mehrere Studien haben gezeigt, dass mechanische Einwirkung, wie z.B. durch verschiedenste Bolzenschussgeräte (SCHMIDT et al. 1999), ZNS-Gewebe zerreißen kann und somit Emboli aus Gehirngewebe in die Blutbahn gelangen können (BAUER et al. 1996; GARLAND et al.

1996; SCHMIDT et al. 1999; HORLACHER et al. 2002). In einer Studie mit Pseudomonas fluorescens als Marker-Organismus für die Verteilung der ZNS-Emboli im Schlachttier wurde ZNS-Gewebe im Blut, den Organen und in der Muskulatur nachgewiesen. Die Verteilung des Marker-Organismus im Schlachttier fand besonders nach dem Bolzenschuss, dem Entbluten und der Teilung des Schlachtkörpers statt (DALY 2002). Ein Kontaminationsrisiko besteht somit bei Blut, Lunge, Arteria pulmonaris sowie rechtem Atrium und Ventrikel des Herzens (SSC 2001, 2002). Dennoch ist die Menge der entstandenen Emboli sehr gering (ANIL et al.

1999, 2002; LÜCKER et al. 2002). Die Menge an ZNS-Gewebe, die möglicherweise beim Endverbraucher in Fleisch und Fleischerzeugnissen vorkommt, wird durch die weiteren nachgelagerten technologischen Prozeduren in der Lebensmittelkette sowie von Konsumgewohnheiten der Endverbraucher sehr beeinflusst (LÜCKER et al. 2002). Die Gewebe, die im Falle einer TSE-Erkrankung potentiell eine hohe TSE-Erregerdichte aufweisen können, werden als SRM bezeichnet. Diese Gewebe von Rindern, Schafen und Ziegen müssen unschädlich entsorgt werden und dürfen nicht in die Lebensmittel- sowie Futtermittelkette gelangen (EU 2001b, 2002), da von diesen Geweben im Fall einer Infektion eine hohe Gefahr der TSE-Verbreitung ausgehen kann (EU 1997, 2000b, 2001b). Im Tierexperiment an Mäusen hat sich 0,5 g ZNS-Gewebe als minimale Infektionsdosis für eine intrazerebrale Infektion herausgestellt (MAIGNIEN et al. 1999).

Nach der Spaltung der Tierkörper in Hälften mit einer Bandsäge konnten ZNS-Gewebeteile auf der Tierkörperoberfläche, dem Auffangschalenwasser und den Schürzen des Schlachtpersonals gefunden werden (HELPS et al. 2001). Bisher ist bereits die Anwendung von Rückenmarkszerstörern untersagt (EU 2000). Neue Methoden der Tierkörperteilung sind zur Zeit in der Erprobungsphase (TROEGER 2001).

Weiterhin ist Fleisch, dass von Tieren einer Kohorte aus einem Bestand mit einem amtlichen BSE-Fall stammt, nach §17 (1) 1 des LMBG als ein nicht zum Verzehr geeignetes Lebensmittel zu erklären und zu beschlagnahmen (ANONYM 1994). Für die weitere Reduktion des Eintrages an SRM in die Nahrungsmittelkette während der Schlachtung wird folgendes für die Zukunft empfohlen (nach SCHÜTT-ABRAHAM 2002):

(a) den gesamten Kopf, Blut, Lunge und Herz zu SRM zu erklären, wenn bei der Schlachtung ein penetrierendes Bolzenschussgerät verwendet wird (BgVV 2001a);

(b) die Zunge nur dann als Lebensmittel zu verwenden, wenn sie hygienisch entnommen werden konnte und auf die Außen- und Innenwäsche des Kopfes verzichtet wurde (BgVV 2001b);

(c) Verzicht auf die Längsspaltung der Tierkörper im Schlachtbetrieb (BgVV 2001c);

(d) Darmkonvolut inklusive Darmgekröse bei Rindern jeden Alters als SRM zu betrachten (BgVV 2001d), da auch im Darm von oral infizierten Kälbern sechs Monate nach der Applikation BSE-Infektiosität nachgewiesen werden konnte (WELLS et al. 1994);

(e) alle Geräte und Einrichtungen, die mit BSE-positiven Tieren in Berührung gekommen sind, als kontaminiert anzusehen. Dieses gilt besonders für die Geräte, die zur Betäubung (Bolzenschussgerät), zum Absetzen und zur Bearbeitung des Kopfes, zum Längsspalten der Wirbelsäule und zum Herauslösen des Rückenmarks verwendet werden (BgVV 2001b).

2.3.2 Verwendung von ZNS-Gewebe und ZNS-Gewebe haltigem Rohmaterial bei der Herstellung von Fleischerzeugnissen

ZNS-Gewebe kann durch den Einsatz von Hartseparatorenfleisch und die Verwendung von Gehirngewebe über die Verarbeitungstechnologie in Fleischerzeugnisse gelangen.

Hartseparatorenfleisch ist mechanisch von Knochengewebe befreites Restfleisch. Dieser Rohstoff wurde anstelle von sehnenreichem Rindfleisch bei Brüh- und Kochwürsten sowie streichfähigen Rohwürsten eingesetzt (HILDEBRANDT et al. 2001). Da in der Vergangenheit Hartseparatorenfleisch aus Rinderwirbelknochen verwendet wurde, ist nun der Schädel, d.h. der Kopfknochen ohne Unterkiefer und Zunge einschließlich Gehirn und Augen, die Mandeln sowie das Rückenmark von über 12 Monate alten Rindern zu Konfiskat erklärt worden, dass in der Tierkörperbeseitigungsanstalt entsorgt werden muss (ANONYM 2003).

Ebenso dürfen Rückenwirbel und Röhrenknochen nicht der maschinellen Restfleischgewinnung zugeführt werden (EU 2000). Zudem muss die Verwendung von Separatorenfleisch in der Zutatenliste der Fleischerzeugnisse kenntlich gemacht werden (z.B.:„mit Schweineseparatorenfleisch“) (EU 2001g, 2002d).

Innereien, wie u.a. das Gehirn sind gute Emulgatoren und wurden bei der Herstellung von Leberwurst einfacher Qualität häufig verwendet (HILDEBRANDT et al. 2001). Laut den Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches war die Verwendung von Gehirngewebe in regionalen Wurstspezialitäten erlaubt, wie z.B. bei der Bregenwurst (ANONYM 1998). Allerdings wurde wegen der leichten Zugänglichkeit bei der Schlachtung hauptsächlich Schweinegehirn verwendet. Seit der Änderung der Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches im Oktober 2001 ist die Verwendung Hirn, Rückenmark, Bries, Milz, mit Ausnahme von Schweinemilz, Schweinemicker und Speiseröhre zur Herstellung von Fleischerzeugnissen verboten (ANONYM 2001e). Durch den Verkauf von bovinem Fettgewebe an Fettschmelzen kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass vor der Änderung der Leitsätze für Fleisch und

Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches, Lebensmittel mit Fettfraktionen aus Rindergehirn hergestellt worden sind (HILDEBRANDT et al., 2001).

Es bestehen viele Möglichkeiten, dass möglicherweise TSE-Erreger-haltiges Material beabsichtigt und unbeabsichtigt in die Lebensmittel- sowie Futtermittelkette gelangt.

Aufgrund der Tatsache, dass vCJD sehr wahrscheinlich mit BSE assoziiert ist (ALMOND u.

PATTISON 1997), erscheint es wichtig, insbesonders ZNS-Gewebe in Lebensmitteln detektieren zu können (LÜCKER et al. 1999, 2001; EU 2001b). Deswegen ist es hinsichtlich des vorbeugenden Verbraucherschutzes und zur Verhinderung der weiteren Ausbreitung von TSE von großer Bedeutung, derartige Tests zu entwickeln (WEYANDT 2001).

Eine chronologische Übersicht über die Gemeinschaftsvorschriften bezüglich BSE ist bei der EU unter der Adresse http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/legislation_de.hmtl abrufbar (EU 2003).

2.4 Methoden zur Detektion von ZNS in Fleisch- und Fleischerzeugnissen

Als mögliche Markersubstanzen für das ZNS-Gewebe eignen sich Stoffwechselprodukte, Struktur- und Stoffwechselproteine sowie Produkte der gewebespezifischen Genexpression.

Die Markersubstanzen sollten spezifisch für das ZNS-Gewebe, hitzestabil und für mögliche Detektions-Tests gut verfügbar sein. Zu den Stoffwechselprodukten, die als Marker für ZNS eingesetzt werden, gehören (a) die Nervonsäure, die zu den Glykosphingolipiden gehört und in der weißen Substanz des ZNS zu finden ist (ANONYM 1994a) sowie (b) das Cholesterin, einem einwertigen hydroaromatischen Kohlenwasserstoff, der Baustein von Membranen ist und im Nervensystem besonders reichlich vorkommt (LÜCKER u. BÜLTE 1997). Die neuronenspezifische Enolase, die an der aeroben Glykolyse beteiligt ist und als γγ-Enolase im ZNS und in neuroendokrinen Zellen zu finden ist (LÜCKER et al. 1998), ist als Enzym am Stoffwechsel des ZNS beteiligt. Zu den Strukturproteinen gehören (a) die Gruppe der Intermediärfilamente in den Axonen, zu denen das GFAP, Vimentin, sowie Neurofilamente gehören (FUCHS u. CLEVELAND 1998), (b) das basische Myelinprotein, das Bestandteil des Myelins ist (LÜCKER et al. 2002a), (c) das Tau-Protein (AUPPERLE et al. 2002), das an die Mikrotubuli bindet sowie (d) das S100- und S100L-Protein (AUPPERLE et al. 2002). Bei den Zwischenprodukten der spezifischen Genexpression wird zur Zeit die mRNA der ZNS- spezifischen Proteine GFAP (LANGE et al. 2002; SEYBOLDT et al., 2003) und basischen Myelinproteins (LANGE et al. 2002) genutzt.

2.4.1 Nachweis ZNS-spezifischer Fettsäuren und Cholesterin

2.4.1.1 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode (GC-MS)

Bei dieser Methode werden gehirnspezifische Fettsäureprofile mittels der Gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode (GC-MS) identifiziert (NIEDERER u. BOLLHALDER 2001). Nach Extraktion der Gesamtlipide und Aufreinigung durch Festphasenextraktion, findet eine säurekatalysierte Umesterung zu Fettsäuremethylestern (FAME) sowie Trennung, Identifizierung und Quantifizierung mittels GC-MS statt. Durch die charakteristischen Verhältnisse der cis- und trans-Isomeren der Nervonsäure können die Tierarten Rind, Schaf und Schwein voneinander unterschieden werden. In Referenzwürsten mit unbekanntem Nervengewebe ist die Tierartenunterscheidung bis zu einem ZNS-Gewebe-Anteil von 0,05 % möglich. Ohne Tierartenunterscheidung liegt

die Nachweisgrenze von ZNS-Gewebe in Referenzwürsten bei < 0,01 % (NIEDERER u.

BOLLHALDER 2001).

BIEDERMANN et al. (2002) vereinfachten das oben genannte GC-MS-Verfahren von NIEDERER u. BOLLHALDER (2001), indem aus den Gesamtlipiden zunächst die Fraktion der Sphingolipide (SL) abgetrennt und dann aufgereinigt zu Methylestern derivatisiert wurden (BIEDERMANN et al. 2002). LÜCKER et al. (2002b) verbesserten das Verfahren von NIEDERER u. BOLLHALDER (2001) nochmals, indem für die Extraktion der Gesamtlipide ein Chloroform-Methanol-Gemisch von 2:1 statt eines Hexan-Aceton-Gemisches verwendet wurde. Zudem wurde zur massenspektrometrischen Detektion der FAME ein anderes Verfahren angewandt, um die Empfindlichkeit zu steigern (LÜCKER et al. 2002b). Die trans- Nervonsäure (C 24:1c/t) zeigte die größten Unterschiede zwischen den einzelnen Tierarten Rind, Kalb, Schaf, Schwein und Pute. Zur besseren Unterscheidung der Tierarten Kalb und Schaf sowie Schwein und Pute wurde der Nachweis der Lignocerinsäure in das Verfahren integriert. Da das Verhältnis der cis/trans-Nervonsäure (C 24:1c/t) mit dem Alter zunimmt und beim adulten Rind am höchsten ist, konnte zwischen Kalb und adulten Rind unterschieden werden. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass das Verhältnis der cis/trans- Nervonsäure (C 24:1c/t) durch herstellungstechnische Parameter beeinflusst wird. Für den Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen (Brühwurst) erwies sich die Cerebronsäure (C 24 OH) als geeignetster Marker, da die Nachweisgrenze für Rindergehirn in Fleischerzeugnissen bei 0,2 % Gehirngewebegehalt lag (LÜCKER et al. 2002b).

2.4.1.2 Nachweis von Cholesterin

Als eines der ersten Verfahren zur Detektion von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen gilt die enzymatisch-photometrische Bestimmung des Cholesteringehaltes (LÜCKER u. BÜLTE 1997). Cholesterin weist jedoch keine absolute Spezifität für das ZNS auf, da z.B. der Cholesteringehalt von Eidotter dem Cholesteringehalt des ZNS sehr ähnlich ist. Zudem trägt die unterschiedliche Verteilung von Cholesterin im Rindergehirn (RUNQUIST et al. 1995) und in pflanzlichen Inhaltsstoffen zu der Variabilität der Testergebnisse bei (LÜCKER et al.

1999). Dennoch können mit Cholesterin-Bestimmung im Rahmen eines schnellen Screening- Verfahrens Zusätze von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen ab 2 % detektiert werden (LÜCKER u. BÜLTE 1997).

Neben dem bereits verfügbaren enzymatischen Nachweisverfahren für Cholesterin, wird zur Zeit an einem gaschromatographischen Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin geforscht (LÜCKER u. SCHLOTTERMÜLLER 2001a). Dieses Verfahren basiert auf der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG für Eier und Eiprodukte.

2.4.2 Immunchemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe 2.4.2.1 Nachweis der neuronenspezifischen Enolase (NSE)

Bei diesem Verfahren von LÜCKER et al. (1998) handelt es sich um den Nachweis der neuronenspezifische Enolase (NSE) aus ZNS-Gewebe, die auch gehirnspezifisches 14-3-2- Protein oder γγ-Enolase genannt wird, mittels mono- und polyklonaler Antikörper nach Fett- und Proteinextraktion sowie SDS-Gel-Elektrophorese im Westernblot. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,25 % ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen (Brühwurst).

Bei der Detektion von ZNS-Gewebe in fettreichen Fleischerzeugnissen (z.B. Leberwurst) verringerte sich die Sensitivität dieser Methode erheblich. Durch die Reduktion des Fettgehaltes während der Probenpräparation ist diese Unsicherheit teilweise gelöst worden (LÜCKER et al. 1999, 2000a). Bei stark erhitzten Fleischerzeugnissen (120°C für 20 Minuten) reduzierte sich die Immunoreaktivität von NSE und die Nachweisgrenze fällt auf 2 % ZNS-Gewebe (AGAZZI et al. 2002). Durch die Verwendung eines anderen Extraktionsverfahrens und der Aufkonzentrierung der Proteinextrakte konnte die Empfindlichkeit des NSE-Westernblots auf die Detektion von ca. 0,01 % ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen erhöht werden (LÜCKER et al. 2000, 2000a). Möglicherweise falsch positive Ergebnisse durch das Vorhandensein von PNS sind zu beachten (LÜCKER et al. 2000a). Kommerziell ist dieses Verfahren als Weternblot-Testkit (NSE-Kit) der Firma ScheBo-Biotech (Gießen) erhältlich. Dieses Verfahren wurde mit dem oben genannten Cholesterin-Nachweisverfahren (LÜCKER u. BÜLTE 1997) gekoppelt und als Referenz- Nachweisverfahren (INV-intrgriertes Nachweisverfahren) evaluiert (LÜCKER et al. 1998, 1999, 2000a). In einer Studie von OVERHOFF et al. (2002) konnte mittels des NSE- Westernblot natives ZNS-Gewebe der Tierarten Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, Gans, Huhn und Pute nachgewiesen werden.

2.4.2.2 Nachweis des sauren Gliafaserproteins (GFAP)

Bei dem Westernblot mit GFAP handelt es sich um das gleiche Testprinzip, das schon beim NSE-Westernblot angewandt wurde, mit dem Unterschied, dass hierbei GFAP als Marker für ZNS-Gewebe verwendet wird (LÜCKER et al. 2000). Bei dem GFAP Westernblot war die Sensitivität durch das Vorkommen unterschiedlicher Bandenanzahl sowie durch das Auftreten von nicht ZNS-spezifischen Banden herabgesetzt (LÜCKER et al. 2000). Mit dem GFAP- Westernblot konnte natives ZNS-Gewebe der Tierarten Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, Gans, Huhn und Pute nachgewiesen werden (OVERHOFF et al. 2002).

Weiterhin kann GFAP mittels eines Enzymimmunoassays (Immunosorbent-ELISA) für GFAP nachgewiesen werden (SCHMIDT et al. 1999a). Dieser Test weist ZNS-Gewebe im Blut, Muskelgewebe und in Fleischprodukten mit einer Nachweisgrenze von 0,2 – 1 µg/ml nach. Durch die Verwendung einer fluoreszierenden Substanz (GFAP-F-ELISA) konnte eine Steigerung der Sensitivität um das 10 bis 30-fache im Vergleich zu dem Immunosorbent- ELISA erreicht werden (SCHMIDT et al. 2001). Eine Erhitzung auf 80°C für 20 Minuten und Zutaten bei der Herstellung der Fleischerzeugnisse beeinträchtigten den Nachweis der GFAP nicht. Bei stark erhitzten Fleischerzeugnissen (120°C für 20 Minuten) lag die Nachweisgrenze bei 0,5 % ZNS-Gewebe (AGAZZI et al. 2002). Der GFAP-Enzymimmunoassay ist kommerziell als GFAP-Kit (RIDASCREEN^ Risk Material ELISA) der Firma r-biopharm (Darmstadt) erhältlich. Mit diesem Test war der Nachweis von Gehirn-Gewebe ab 0,2 % in erhitzten und ab 0,1 % in rohen Fleischerzeugnissen gelungen. Somit stellt dieser Test eine Alternative zu dem INV dar (HORLACHER et al. 2002a).

2.4.2.3 Nachweis weiterer Marker für ZNS-Gewebe

LOVE et al. (2000) untersuchten in ihrer Studie einen Capture ELISA für Syntaxin 1B, um ZNS-Gewebe in Blut zu detektieren. Die Nachweisgrenze lag bei diesem Test bei 50 – 100 µg ZNS-Gewebe pro Milliliter Blut. Bei einer vergleichenden Untersuchung des Syntaxin- Capture-ELISA mit dem GFAP-F-ELISA hinsichtlich der Detektion von ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischprodukten, konnte nachgewiesen werden, dass der Syntaxin-Capture-ELISA sich nicht für die Detektion von ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen (80°C für 60 Minuten) eignet, da der Gehalt an Syntaxin 1B in diesen Produkten unterhalb der

Nachweisgrenze lag (SCHMIDT et al. 2001). Somit war mit dem Syntaxin-Capture-ELISA eine Detektion geringer Mengen an ZNS-Gewebe nicht möglich (SCHMIDT et al. 2001).

OVERHOFF et al. (2002) untersuchten die Antikörper anti-GFAP (saures Gliafaserprotein), anti-NSE (Neuronenspezifische Enolase), anti-MBP (basisches Myelinprotein), anti-TAU (Tau-Protein), anti-S100 (S100-Protein), anti-S100L (S100L-Protein), anti-NF (Neurofilament), anti-Syntaxin und anti-Peripherin im Westernblot bezüglich ihrer Eignung Tierarten zu differenzieren und geringe Mengen an ZNS-Gewebe in nativen Wurstbrät sowie erhitzten Fleischerzeugnissen zu detektieren. Mit den Antikörpern für Tau und Peripherin konnte kein ZNS-Gewebe nachgewiesen werden. Mittels anti-MBP konnte Gehirngewebe der Tierarten Rind, Schaf, Ziege und Pferd spezifisch erfasst werden. Der Nachweis von ZNS- Gewebe in nativem Wurstbrät gelang mit den Antikörpern anti-GFAP, anti-NSE, anti-MBP und anti-Syntaxin. Mit anti-MBP wurde der Nachweis von ZNS-Gewebe in unterschiedlich erhitzten Fleischerzeugnissen (bis 125°C für 20 Minuten) erbracht. Bei der Erhitzung der Fleischerzeugnisse über 125°C nahm die Immunoreaktivität von MBP ab (OVERHOFF et al.

2002). In der Studie von AUPPERLE et al. (2002) hingegen ergab die Verwendung der Antikörper für Neurofilamente, basisches Myelinprotein und Peripherin zur Detektion von ZNS-Gewebe im Westernblot keine aussagekräftigen Resultate.

2.4.3 Immunhistochemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe

LOVE et al. (2000) untersuchten in ihren immunhistochemischen Arbeiten den Nachweis von ZNS-Gewebe-Emboli im Blut mittels Antikörpern gegen NSE, Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2, NF, Synaptophysin, S100ß-Protein und GFAP. Der Nachweis des S100ß-Protein war in dieser Studie mit einer Nachweisgrenze für die Detektion von ZNS-Gewebe bei ca. 2 – 4 µg/ml am sensitivsten. Da das S100ß-Protein jedoch auch in anderen Geweben als dem ZNS vorkommt, können falsch positive Ergebnisse bei der Detektion von ZNS-Gewebe nicht ausgeschlossen werden (LOVE et al. 2000).

TERSTEEG et al. (2002) untersuchten immunhistochemische Färbemethoden mit vier verschiedenen Antikörpern, dem Anti-NF (Neurofilament), Anti-MBP (Myelin Basic Protein), Anti-GFAP (saures Gliafaserprotein) und Anti-NSE (neuronenspezifische Enolase) auf ihre Fähigkeit, ZNS-Gewebe von Schwein und Rind in unterschiedlich behandelten (rohen und auf 80°C bzw. 115°C für 60 Minuten erhitzten) Fleischprodukten zu detektieren.

Bei dieser Studie erwies sich Anti-MBP als der geeignetste Antikörper, um ZNS-Gewebe in