der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch:
Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray
INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Melanie Tina Leidreiter
aus Bochum
Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2003
Die Arbeit wurde aus Mitteln der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung gefördert.
Gewidmet
meinen Eltern, meinem Opa
und in Gedenken Frau Helene Schröder
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung...13
2. Schrifttum...15
2.1 Genus Listeria...15
2.1.1 Geschichte ...15
2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften ...15
2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien...16
2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose ...17
2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen... 19
2.1.6 Prophylaxe ... 19
2.2 Hackfleisch ...20
2.2.1 Allgemeines... 20
2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp....20
2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln...23
2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden...23
2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG (DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis).... 23
2.3.2 Immunologische Nachweismethoden...27
2.3.2.1 Allgemeines... 27
2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes)...27
2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays...29
2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays... 33
2.3.3 Molekularbiologische Methoden... 35 2.3.3.1 PCR als integrales System ... 6336 2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR 36
2.3.3.4 Multiplex-PCR... 39 39
2.3.3.5 Detektion der PCR-Produkte...40
2.3.3.6.1 Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen von Listeria monocytogenes-Reinkulturen... 42
2.3.3.6.2 Nachweisgrenzen von PCR-Systemen bei Untersuchung von Listeria mono- cytogenes-dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).... 4 44
2.3.3.6.3 Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen von Feldproben... 48
2.3.4 Methodenvergleich... 51
2.4 Schlussfolgerungen aus dem wissenschaftlichen Schrifttum... 55
3. Eigene Untersuchungen ... 57
3.1 Material ... 57
3.1.1 Hackfleisch... 57
3.1.2 Mikroorganismen... 57
3.2 Methoden...58
3.2.1 Kulturelle Nachweismethode...59
3.2.2 Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA …...…... 62
3.2.3 PCR...…...64
3.2.4 NUTRI®-Chip...…... 69
3.3 Versuche ...74
3.3.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit Listeria innocua... 74
3.3.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria monocytogenes-Konzentrationen ...74
3.3.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium... 75
3.3.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination)... 76 3.3.1.4 Überprüfung des Einflusses von Brillantschwarz auf das Wachstum von
3.3.2 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode...78 3.3.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes...78 3.3.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch... 80 3.3.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR...82 3.3.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR...82 3.3.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes
in TSYE- und Halbfraser-Bouillon...82 3.3.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua... 82 3.3.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinefleisch mittels PCR... 83 3.3.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels Microarray...85 3.3.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray...85 3.3.4.2 Spezifität des Microarray-Nachweises für Mischkulturen mit Listeria
innocua in Schweinehackfleisch...85 3.3.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA... 86 3.3.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf
die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit... 86 3.3.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA... 87 3.3.6 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Feldproben mittels molekularbiologischen Verfahren... 89 3.3.6.1 Untersuchung von Listerien-positiven Feldproben mittels
Agargel-Elektrophorese und Microarray... 89
4. Ergebnisse... 90
4.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit
Listeria innocua... . 90 4.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria
monocytogenes-Konzentrationen... 90 4.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium... 91 4.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination) des Hackfleisches...92 4.1.4 Prüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Wirkungen auf das
kulturelle Wachstum von Listerien... 92 4.2 Nachweis von Listerien in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode... 93 4.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes für den qualitativen Nachweis von Listeria
monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode...93 4.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch... 95
4.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR... 97 4.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR.... 97 4.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in
TSYE-respektive Halbfraser-Bouillon... 97 4.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua... 97 4.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR... 99
4.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels Microarray...100 4.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray... 100 4.4.2 Molekularbiologischer Nachweis von Listeria monocytogenes mittels
Microarray in Anwesenheit von Listeria innocua... 105
4.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA...107
4.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit... 107
4.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA... 108
4.6 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben mittels Agargel-Elektrophorese und Microarray... 110
5. Diskussion... 115
5.1 Diskussion des Dotierens von Schweinehackfleisch ... 115
5.2 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode... 116
5.3 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR... 122
5.4 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA...132
5.5 Bedeutung der Halbfraser-Anreicherungskultur in Verbindung mit Schnellmethoden...136
5.6 Vergleich der Schnellmethoden... 136
6. Zusammenfassung...140
7. Summary... 142
8. Schrifttumsverzeichnis... 144
9. Anhang... 169
9.1 Nähr- und Differenzierungsmedien ... 169
9.2 ELISA-Materialien ... 172
9.3 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen ...172
9.3.1 Reagenzien ... 172
9.3.2 Rezepturen ... 173
9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 175
9.5 Tabellenverzeichnis ... 177
9.6 Abbildungsverzeichnis ...178
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
aqua dest. Aqua destillata
bp Basenpaar
bzw. beziehungsweise
ca. circa
d. h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. et alii
evtl. eventuell
°C Grad Celsius
FDA United States Food and Drug Administration
g Gramm
ggf. gegebenenfalls
GKZ Gesamtkeimzahl
h Stunde
i. d. R. in der Regel
inkl. inklusive
ITS Interner Standard
i. w. im wesentlichen
KbE Kolonie-bildende Einheit
kDA Kilodalton
L. Listeria
µ l Mikroliter
mAK monoklonale Antikörper
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
o. A. ohne Angabe
n Anzahl der Proben
pAK polyklonale Antikörper
PALCAM (Polymyxin B, Akriflavin, Lithiumchlorid, Ceftazidim, Moxalactam)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
pH pondus hydrogenii
RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
s. siehe
spp. Spezies
Tab. Tabelle
TSYEB Tryptone Soya Yeast Enrichment Broth USDA United States Department of Agriculture
u. und
UV Ultraviolett
v. a. vor allem
z. B. zum Beispiel
z. Z. zur Zeit
1. Einleitung
Im Sinne eines vorbeugenden Gesundheitsschutzes ist der Nachweis von Listeria monocytogenes (L. m.) in Lebensmitteln Gegenstand vieler Studien. Innerhalb der Gattung Listeria ist Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Spezies (FARBER u. PETERKIN 1991).
Die Listeriose tritt relativ selten manifest in Erscheinung, wenn sie es aber tut, dann handelt es sich - mit einer durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % - um eine äußerst ernst zu nehmende Infektion (McLAUCHLIN 1987; 1990a).
Listerien werden regelmäßig in Lebensmitteln, besonders auch in rohem Fleisch, nach- gewiesen (Tab. 3). Der herkömmliche qualitative und quantitative Listerien-Nachweis benötigt für ein Ergebnis mehrere Tage. Die Laborpraxis braucht für einen ausreichend empfindlichen, spezifischen und zuverlässigen Nachweis von Listerien Schnellmethoden, deren Entwicklung auch im Hinblick auf die begrenzte Haltbarkeitsdauer bestimmter Lebensmittel und die hohen Kosten der Lagerung erforderlich ist (NIEDERHAUSER et al.
1992).
Schnelle spezifische und sensitive Methoden sollen in Zukunft Zeit- und Arbeitsaufwand im Labor minimieren. In jüngster Zeit sind insbesondere auch Microarrays, die auf molekular- biologischen Methoden basieren, ins Zentrum des Interesses gerückt.
Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des BgVV folgt daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des BgVV anhand des quantitativen Listerien-Nachweises beurteilt werden: Als verkehrsfähig wäre beispiels- weise Hackfleisch nur anzusehen, wenn in 1 g höchstens 100 KbE Listeria monocytogenes gefunden werden könnten (WEISE et al. 1999).
Aus diesem Kontext heraus ergeben sich die Fragen nach den für den Listerien-Nachweis geeigneten Methoden. Neben der Zuverlässigkeit sowie Schnelligkeit ist die praktikable Einsetzbarkeit im Labor der entscheidende Parameter in der Wahl der Methode.
Bisher gibt es keine Veröffentlichungen über vergleichende Untersuchungen zum Nachweis von Listerien mittels bakteriologischer Untersuchung gemäß § 35 LMBG, ELISA und PCR mittels Detektion der PCR-Produkte anhand Agargel-Elektrophorese und Microarray- Analyse.
Ziel dieser Arbeit ist es, kulturelle, serologische und molekularbiologische Methoden für den spezifischen Listeria monocytogenes-Nachweis (besonders hinsichtlich Zeitaufwand) zu vergleichen. Diese Arbeit soll einen Beitrag leisten zu den Erkenntnissen hinsichtlich der Praktikabilität von Schnellmethoden für den Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch.
2. Schrifttum
2.1 Genus Listeria
Listeria-Arten sind weltweit verbreitet. Sie sind relativ anspruchslose Bakterien und werden z. B. in Wasser, Abwasser, Erdboden, Pflanzen, Silage, Schlachthofabfällen oder Gullies von LM-verarbeitenden Betrieben gefunden (GRAY u. KILLINGER 1966; BAUMGART et al.
1997, III.3, S. 61).
2.1.1 Geschichte
1893 berichtete Henle nach Sektionen von Patienten in Deutschland von gram-positiven Stäbchenbakterien, bei denen es sich aus heutiger Sicht um pathogene Listerien gehandelt hat (GRAY u. KILLINGER 1966). Als Auslöser einer Erkrankung bei Laborkaninchen, die mit einer charakteristischen Vermehrung der Monozyten im Blut einherging, wurde der Keim 1926 von Murray erstmals beschrieben und als Bacterium monocytogenes bezeichnet. Den gleichen Keim isolierte Pirie 1927 bei einer seuchenartigen Erkrankung von Wüstenspring- mäusen und nannte ihn Listerella hepatolytica. Seit 1940 trägt der Keim die bis heute gültige Bezeichnung Listeria monocytogenes (s. Review FARBER u. PETERKIN 1991).
Erst seit den 1980er Jahren wird L. monocytogenes (Erreger der Listeriose) als ein wichtiger Faktor der öffentlichen Gesundheit wahrgenommen, nachdem der Verzehr kontaminierter LM mit Listeriose-Epidemien in Verbindung gebracht wurde (SCHLECH et al. 1983).
Im (human-)medizinischen Sinne galten die Listerien bis dahin als relativ unbedeutend, und es gab weder offizielle noch zufriedenstellende Nachweismethoden für die Isolation und Identifizierung von pathogenen Listerien (McLAUCHLIN 1987).
2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften
Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (SEELIGER u. JONES 1986) führt die Gattung Listeria unter der Gruppe der regelmäßigen, nicht sporenbildenden, gram-positiven Stäbchen- bakterien. Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology (HOLT et al. 1994) unterscheidet sieben Arten: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. murrayi, L. seeligeri und
Nach phylogenetischen, molekularbiologischen Studien wird jedoch davon ausgegangen, dass L. grayi und L. murrayi eine einzige Spezies (Grayi) darstellen (BOERLIN et al. 1992).
Die an den Enden abgerundeten, zumeist kurzen Stäbchenbakterien (Länge 0,5 bis 2,0 µm und Durchmesser 0,4 bis 0,5 µm) kommen einzeln und in kurzen Ketten, V-förmig oder palisadenförmig aneinandergereiht vor. Listerien bewegen sich charakteristisch taumelnd, was sie bei Temperaturen von 20 - 25°C am besten ausprägen. Das Wachstum ist fakultativ an- aerob und optimal bei Temperaturen zwischen 30 und 37°C. Temperaturen von unter 1°C und über 45°C verhindern eine Vermehrung (HOLT et al. 1994). Der Mindest-pH-Wert ist tem- peraturabhängig (FARBER u. PETERKIN 1991). Kolonien sind katalase-positiv, hydro- lysieren Äskulin und können Hämolysin (Listeriolysin O) sowie Cytochrome produzieren (SEELIGER u. JONES 1986). Generationszeiten verschiedener Stämme waren annähernd vergleichbar (BESSER 2000). Weitere mikrobiologische Eigenschaften s. unter 2.1.3.
2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien
Die Spezies der Listerien werden im Allgemeinen mit Hilfe von kulturellen, biochemischen und mikroskopischen Methoden differenziert (SEELIGER u. JONES 1986).
Für die Unterscheidung β-hämolysierender Kulturen (L. ivanovii, L. monocytogenes und L. seeligeri) muß der CAMP-Test durchführt werden (Tab. 1).
Tab. 1: Charakteristika zur Differenzierung der Listerien (nach HOLT et al. 1994).
+ = 90 % der Stämme oder mehr sind positiv; - = 90 % der Stämme oder mehr sind negativ.
V = 11 - 89 % der Stämme sind positiv.
(1) im Allgemeinen breite Zonen oder multiple Zonen (2) wenige Stämme sind nicht-hämolytisch
Merkmal L.
grayi
L.
innocua
L.
ivanovii
L.
monocytogenes
L.
murrayi
L.
seeligeri
L.
welshimeri
β-Hämolyse – – +(1) +(2) – + –
CAMP-Test
mit S. aureus – – – + – + –
CAMP-Test
mit R. equi – – + – – – –
Säurebildung aus:
Rhamnose – V – + V – V
Xylose – – + – – + +
Nach der Beurteilung des Hämolyseverhaltens eines Stammes wird das Fermentations- verhalten geprüft (Tab. 1). L. monocytogenes ist der einzige hämolytische Stamm, der Rhamnose – unter Säurebildung – fermentiert.
Die serologischen Methoden zur Differenzierung von L. monocytogenes in 13 Serotypen sollen hier nicht weiter erläutert werden.
2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose
Die humane Listeriose tritt sowohl epidemisch als auch sporadisch in Erscheinung. Die Er- krankungsrate beträgt durchschnittlich 6,2 bzw. 8 Erkrankte pro eine Million Einwohner und Jahr. Die Erkrankungsrate wird sehr wahrscheinlich unterschätzt, weil in vielen Fällen der Erreger entweder nicht vermutet (z. B. bei Aborten) oder auch nicht nachgewiesen wird (FARBER u. PETERKIN 1991; ANON. 1991). Die klinische Listeriose geht mit einer durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % einher. Bei den nicht mit perinataler Listeriose assoziierten Fällen steigen das Risiko einer manifesten Erkrankung und die Mortalitätsrate mit dem Alter (McLAUCHLIN 1987; 1990b). Bundesländer mit einer Melde- pflicht für listerielle Meningitiden verzeichneten für diese einen Anteil an den bakteriellen Meningitiden zwischen 4 und 6 %. Klinische Listeriosen treten am häufigsten bei Neugeborenen und Menschen über 60 Jahren auf (McLAUCHLIN 1990a; ANON. 1991).
Nach dem deutschen Infektionsschutzgesetz unterliegt lediglich die Neugeborenen-Listeriose (Erkrankung und Tod) der Meldepflicht. Pro Jahr werden zwischen 30 und 40 Fälle amtlich erfasst (ANON. 1999).
Lebensmittel (LM) gelten als wichtigste Infektionsquellen für den Menschen (BAUMGART 2000). Risikoreich ist u. a. der Verzehr von roher Milch und Rohmilchprodukten sowie von rohem Fleisch und nur unzureichend durchgegartem Fleisch und Fleischerzeugnissen. Die Serotypen 1/2a und 1/2b sowie 4b verursachen über 90 % der menschlichen Listeriosen (FARBER u. PETERKIN 1991). Weltweit dominiert beim Fleisch der Serotyp 1 (ANON.
1991; FARBER u. PETERKIN 1991; VINES u. SWAMINATHAN 1997; PERLBERG et al.
2000). Die orale Aufnahme der Listerien führt u. U. zu einer lokal begrenzten Besiedlung des Intestinaltraktes. Symptomfreie Dauerausscheider innerhalb der Bevölkerung (FARBER u.
PETERKIN 1991; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999) spielen wahrscheinlich eine Rolle in
BOJSEN-MØLLER (1964) berichtete über die Isolation des Erregers aus menschlichen Fäzes bei listeriosekranken Kindern, bei Personen mit Kontakt zu Listeriosekranken, bei stationären Patienten sowie bei symptomfreien Schlachthofarbeitern. Bei immunkompetenten Menschen verläuft eine L. monocytogenes-Infektion i. d. R. subklinisch bzw. nicht-invasiv mit einem leichten Verlauf und leichtem Fieber, wobei über das Ausmaß der Verbreitung subklinischer Infektionen kaum etwas Konkretes bekannt ist (ANON. 2000; McLAUCHLIN 1987). Bei Ausbruch einer fieberhaften Gastroenteritis in Schweden deuteten alle mikrobiologischen und epidemiologischen Analysen darauf hin, dass es sich dabei um einen Ausbruch von Listeriose handelte (CARRIQUE-MAS et al. 2003).
Zu den Risikogruppen für eine klinische Manifestation zählen Schwangere und deren un- oder neugeborene Kinder, ältere Menschen und immungeschwächte Personen. Zu letzteren gehören u. a. Patienten mit Krebs, AIDS oder Diabetes mellitus (ANON. 1991; ANON. 1999;
ANON. 2000; BECKER u. HOLZAPFEL 2000; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999). Das Listeriose-Risiko für die Bevölkerung nimmt in dem Maße zu, in dem das Durchschnittsalter der Bevölkerung steigt (ANON. 1991).
Die infektiöse Dosis ist stark von dem Gesundheitszustand der einzelnen Person abhängig.
Bedingt durch die lange Inkubationszeit sind Daten über die aktuelle Erregerexposition resp.
die minimale infektiöse Dosis bei invasiven Listeriosen spärlich gesät. Infektiöse Dosen bei gesunden Erwachsenen in dokumentierten Listeriose-Fällen rangierten zwischen 109 und 105 KbE pro ml bzw. g LM. Für gefährdete Personen betrug die infektiöse Dosis 104, 102 – 104 bzw. weniger als 10 KbE pro g LM. Weit unter 102 KbE L. moncytogenes können wahr- scheinlich eine Listeriose auslösen, wenn diese Erregermengen über einen längeren Zeitraum täglich aufgenommen werden. Auch der Verzehr von überdurchschnittlichen Mengen eines kontaminierten Lebensmittels ist bei der Entstehung einer LM-Infektion evtl. von Bedeutung (MAIJALA et al. 2001). Kontaminationsraten von weniger als 1 KbE pro g liegen zu häufig in LM vor, als dass sie für Erkrankungsfälle verantwortlich gemacht werden könnten. Die in den USA festgestellte Listerioserate ging allerdings mit der Wahrscheinlichkeit einher, eine Dosis von ≥ 103 KbE pro g Lebensmittel zu sich zu nehmen (HITCHINS 1996).
Die Zeit von der Aufnahme des Erregers bis zur Erkrankung (Inkubationszeit) ist nicht eindeutig zu definieren (1 Tag bis 90 Tage). Symptome können bei Aufnahme großer Mengen des Erregers bereits nach 1 bis 7 Tagen auftreten (McLAUCHLIN 1990b; ANON. 1999).
2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen
Die Listeriose manifestiert sich in schweren, invasiven Fällen mit Blutvergiftungen (Septi- tiden) und Hirnhautentzündungen (v. a. eitrige Meningitiden). Alle Organe können im Krank- heitsverlauf angegriffen werden. Bei schwangeren Frauen nimmt die Listeriose i. d. R. einen milden grippeähnlichen Verlauf (McLAUCHLIN 1987). Schon vor bzw. während der Geburt kann der Erreger auf das Kind übergehen. Spontane Aborte, Früh- und Totgeburten sowie verschiedene Formen der neonatalen Listeriose (Granulomatosis infantiseptica, Meningitis) sind charakteristisch (ANON. 1999; ANON. 1991). Selbst bei einer baldmöglichst einge- leiteten Therapie ist die Letalität kaum zu beeinflussen (ANON. 1999; ANON. 2000).
2.1.6 Prophylaxe
Für die Bekämpfung der Listeriose haben präventive Maßnahmen, die eine Vermehrung von L. monocytogenes in LM verhindern oder eine wirkungsvolle Keimabtötung sicherstellen, sowie umfassende Produktkontrollen auf L. monocytogenes, die sich am Risikopotential des Lebensmittels orientieren, eine besondere Bedeutung. Die Etablierung des Hazard Analysis and Critical Control Point-Konzeptes (HACCP) ist wichtig für die Kontrolle von L. mono- cytogenes-Kontaminationen von Lebensmitteln. Als CCP (critical control point) ist die Ein- haltung der Lagerungstemperatur gekühlter verzehrsfertiger LM anzusehen. Die Anwendung hygienischer Maßnahmen trägt wesentlich zur Minimierung von Listerien-Kontaminationen in Lebensmitteln bei (ANON. 1991). Insbesondere bei der Herstellung von LM, die für Risikogruppen bestimmt sind, sind Kontrollen im Rahmen des HACCP-Konzepts von Be- deutung (MAIJALA et al. 2001). Herkömmliche mikrobiologische Nachweismethoden sind ungeeignet für den Gebrauch innerhalb von HACCP-Systemen, weil die Ergebnisse erst mit zeitlicher Verzögerung zu erhalten sind und sich z. T. als unzuverlässig erwiesen (SHERIDAN et al. 1997; PENG u. SHELEF 2001). Solange keine kosteneffektiven Schnell- methoden in HACCP-Konzepten angewendet werden, bereiten die Kontrollen von L. mono- cytogenes-Kontaminationen Schwierigkeiten. Schnellmethoden ermöglichen ein Online- Monitoring im Rahmen von HACCP-Konzepten der LM-Industrie (SHERIDAN et al. 1997).
Bewertungskriterien für Schnellmethoden sind Sensitivität, Arbeitsaufwand, (Anschaffungs-)
2.2 Hackfleisch
2.2.1 Allgemeines
Hackfleisch ist ein Gemenge aus stark zerkleinerter roher Muskulatur, das außer Kühlung keine weitere Zubereitung oder Behandlung erfährt. Gegenüber dem Rohstoff Fleisch besitzt Hackfleisch eine enorm vergrößerte Oberfläche. Dadurch bietet es ideale Vermehrungs- bedingungen für Mikroorganismen und stellt im Hinblick auf einen möglichen Rohverzehr ein besonders hohes hygienisches Risiko dar (SCHALCH et al. 1996).
Die GKZ handelsüblichen Hackfleisches beträgt innerhalb von 48 h ab Herstellung bei einer konstanten Lagerungstemperatur von 2 - 7°C i. d. R. etwa 105 KbE pro Gramm (LOUWERS et al. 1999). Die Fleischhygiene-Verordnung (FlHV vom 21.5.1997) gibt einen Grenzwert für die aerobe mesophile GKZ von log 6,7 KbE pro Gramm vor, der allerdings in praxi immer wieder überschritten wird (HILDEBRAND et al. 2001; SCHALCH et al. 1996).
Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des ehemaligen BgVV folgt daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des BgVV anhand des quantitativen Nachweises beurteilt werden: Im Sinne des vorbeugenden Gesundheitsschutzes soll ein Inverkehrbringen nur bei Keimgehalten < 102 KbE pro g bzw.
ml möglich sein (WEISE et al. 1999).
Gemäß der Lebenmittelhygiene-Verordnung (LMHV) sind die Betriebe zur Durchführung von Eigenkontrollsystemen im Rahmen eines HACCP-Konzepts verpflichtet. Die Über- wachung des Vorkommens sowohl pathogener als auch apathogener Listerien unterliegt dieser Vorschrift, deren Anwendung die hygienische Unbedenklichkeit sicherstellen soll.
2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp.
Ein nicht unerheblicher Anteil von frischem Fleisch (19 % bis 100 %) und Fleisch- erzeugnissen ist mit Listeria monocytogenes und Listeria innocua kontaminiert. In Hack- fleischprodukten und Produkten, die vor dem Verzehr gegart werden müssen, rangierte die Häufigkeit der Listerien nach JOHNSON et al. (1990) zwischen 8 % und 92 %.
Gelegentlich werden L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. murrayi und L. ivanovii als Kontaminanten in Fleisch nachgewiesen. Mischkulturen aus L. monocytogenes und anderen Listeria spp., insbesondere mit L. innocua, kommen regelmäßig vor (BREUER u. PRÄNDL 1988; BUNČIĆ 1991; COMI et al. 1992; NICOLAS et al. 1989; OZARI u. STOLLE 1990;
RYSER et al. 1996; SCHMIDT et al. 1988; SKOVGARD u. MORGEN 1988; SKOVGARD u. N∅RRUNG 1989; TENGEL et al. 2001). Der Nachweis von Listeria spp. ist auch als Indikator für das Vorhandensein von Listeria monocytogenes anzusehen. Keimgehalte reichen von über 0 bis 2000 KbE L. monocytogenes pro Gramm (Tab. 2).
Tab. 2: Konzentrationen von L. monocytogenes (L. m.) oder Listeria spp. in Fleisch.
Art der Proben Range KbE g-1 Anteil positiver Proben Referenz gemischtes
Hackfleisch (je 50 % Rind und Schwein)
> 0 - ≤ 1,1
> 1,1 - ≤ 12
> 12 - ≤ 110 Listeria spp.
13 % 17 % 23 %
BREUER u. PRÄNDL (1988)
Hackfleisch (Schwein)
< 10 L. m. 8 (50%) SCHMIDT
et al. (1988) Hackfleisch (Rind)
Schweinefleisch
< 100 L. m.
< 100 L. m.
91,6 % 92,6 %
COMI et al. (1992) Hackfleisch
(Schwein)
< 0,3 0,3 - < 1,1 1,1 - < 10 10 - < 100 L. m.
28,6 % 14,3 % 28,6 % 28,6 %
INOUE et al. (2000)
Die L. monocytogenes-Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c und 4b wurden am häufigsten isoliert, seltener wurden die Serotypen 3c, 4c und 4e gefunden (COMI et al. 1992; CORDANO u.
ROCOURT 2001; FANTELLI u. STEPHAN 2001; INOUE et al. 2000; NICOLAS et al.
1989 ; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE 1990; SCHMIDT et al. 1988; WANG et al. 1990).
Mit dem Grad der Bearbeitung nimmt die Häufigkeit von Listeria spp. zu (BREUER u.
PRÄNDL 1988; JOHNSON et al. 1990; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE 1990; SKOVGARD u. N∅RRUNG 1989; VAN DEN ELZEN u. SNIJDERS 1993). Auf den Oberflächen von Schlachttierkörpern von Schweinen und Rindern wurde L. monocytogenes in 2 % und 22 % der Fälle bzw. Listeria spp. in 10 % und 54 % der Fälle nachgewiesen
Die Inzidenz in Muskulatur und Milz von Schlachttieren war hingegen mit unter 1 % gering (AMTSBERG et al. 1969). Im Zerlegeraum wurde eine mindestens siebenfache Konzen- trierung gegenüber der reinen Seite der Schweineschlachtlinie festgestellt (VAN DEN ELZEN u. SNIJDERS 1993). In Feldproben von Fleisch und Fleischerzeugnissen wurden Mischkulturen aus unterschiedlichen Spezies und / oder Stämmen einer Spezies festgestellt (RYSER et al. 1996).
Als Kontaminationsquellen sind dabei vor allem die Fäzes der Schlachttiere und das Personal anzusehen (WEISS u. AMTSBERG 1995). Lokalisationen, an denen Sekundärkontaminatio- nen auftreten, müssen an jedem einzelnen Punkt der Herstellung vermutet werden und ent- stehen vermutlich über den Kontakt des Fleisches mit Schneidebrettern, Messern, anderen Oberflächen und über den Kontakt mit Menschen (JOHNSON et al. 1990).
Tab. 3: Inzidenz von L. monocytogenes sowie Listeria spp. bzw. L. innocua in Fleisch und Fleischerzeugnissen.
Probe Anteil der Proben
mit positivem Nachweis von L. mono Listeria spp. L. innocua
Referenz
rohes Fleisch (Schwein) Hackfleisch (Rind) Wurstwaren
15,9 % 9,5 % 14,3 %
19,0 % 43,2 % 43,9 %
(ja) COMI
et al. (1992) rohes Fleisch (Schwein) 35,7 % 60,0 %
nicht L. m
k. A. WANG
et al. (1992) rohes Fleisch, stückig
rohes Fleisch, zerkleinert (v. a. Hack- und
Schabefleisch)
8,6 % 23,6 %
32,9 % 29,8 %
k. A. NOACK u.
JÖCKEL (1993)
Hackfleisch (Rind) Wurst (Schwein) Hackfleisch (Pute) Geflügelfleisch
40 %*
100 %*
40 %*
60 %*
89 % 96 % 76 % 75 %
60 %*
40 %*
100 %*
80 %*
RYSER et al. (1996)
Hackfleisch (Schwein) 13,5 % k. A. k. A. HILDEBRAND et
al. (2001) Hackfleisch (Schwein)
gemischtes Hackfleisch (50 % Schwein, 50 % Rind)
20,6 %
25,0 % k. A. k. A. INOUE
et al. (2000)
400 Hackfleischproben (Schwein bzw. Rind)
10,8 % 17,5 % k. A. FANTELLI u.
STEPHAN (2001)
* von 15 Listeria spp.-positiven Proben
2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln
2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden
Ältere Studien demonstrierten das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen nach Durch- führung verschiedener kultureller Nachweis- und Referenzmethoden (HEISICK et al. 1989;
KING et al. 1989; NIEDERHAUSER et al. 1992; RYSER et al. 1996; WALKER et al. 1990).
HAYES et al. ermittelten 1992, dass in 25 % aller L. monocytogenes-positiven Lebensmittel der Zoonoseerreger kulturell nicht nachweisbar war. Falsch-negative Resultate gängiger mikrobiologischer Referenzmethoden, die noch immer als golden standard für den Nachweis von Listeria monocytogenes herangezogen werden, hatten zur Ursache, dass entweder die L. monocytogenes-Kontamination aus einer sehr geringen Anzahl Bakterien bestand oder die Zielkeime sich nicht homogen über die Untersuchungsmatrix verteilten.
Die Identifikation von L. monocytogenes gelang generell häufiger, sobald die Lebensmittel- proben in mehr als einem Anreicherungsmedium angereichert wurden (SCHMIDT et al.
1988; HAYES et al. 1992; RYSER et al. 1996; SCOTTER et al. 2001).
2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG (DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis)
Studien mit dem Referenzverfahren DIN EN ISO-Methode 11290-1 (1996) belegten, dass L. monocytogenes-positive aber auch L. innocua-positive Proben mit dem kulturellen Verfahren nicht in jedem Fall identifizierbar sind (Tab. 4).
Die Arbeitsgruppe nach § 35 LMBG „Molekularbiologische Methoden – Mikrobiologie“ des damaligen BgVV (ANON. 2002) stellte zwei kritische Punkte in der praktischen Durch- führung heraus:
Erstens waren Proben, die auch L. innocua enthielten, anfällig für falsche Diagnosen. Dafür wurden sowohl das kompetitive Wachstum als auch fehlerhafte Interpretation von L. innocua als L. monocytogenes verantwortlich gemacht. Zweitens konnte L. monocytogenes aus LM
Tab. 4: Leistungsfähigkeit des kulturellen Referenzverfahrens nach § 35 LMBG (DIN EN ISO 11290-1 (1996).
Spezifität Sensitivität Referenz
100 % 93,6 % BECKER et al. (1998)
97,4 % 85,6 % SCOTTER et al. (2001)
95,0 % 88,3 % ANON. (2002)
Erfahrungen mit den selektiven Anreicherungsmedien und Nährböden gemäß DIN EN ISO 11290-1 von 1996 (§ 35 LMBG) wurden seit deren Entwicklung gegen Ende der 1980er Jahre gewonnen.
FRASER und SPERBER (1988) entwickelten die Fraser-Bouillon (Fraser) mit der Ziel- setzung, die präsumtive Anwesenheit von Listerien in Proben anhand des Anreicherungsme- diums ablesen zu können. Alle Listeria spp. hydrolysieren Äskulin. In Fraser reagieren Eisen- ionen mit den Produkten der Äskulinhydrolyse zu stabilen Komplexen, erkennbar an einem schwarzen Präzipitat. Nach dem Bebrüten wurden Anreicherungskulturen, die sich schwärz- ten, als listerienverdächtig bezeichnet. Die Schwärzung vollzog sich besser bei 35°C als bei 30°C und war nach 24 h komplett abgeschlossen.
In anderen Versuchen trat die Schwarzfärbung erst nach 48 h bei allen Proben ein (WALKER et al. 1990). Schließlich färbten sich auch Anreicherungskulturen, die keine Listerien enthiel- ten, schwarz (WALKER et al. 1990).
Das selektive Agens Akriflavin beeinträchtigt das Wachstum von Listeria monocytogenes nicht aber von Listeria innocua, wodurch letzterer insbesondere in Fraser (höher konzentriert als Halbfraser) einen Selektionsvorteil hat (BEUMER u. HAZELEGER 2003).
Auf dem nach DIN EN ISO 11290 vorgeschriebenen Oxford-Agar (CURTIS et al. 1989) bilden sich i. d. R. nach 24 h Inkubation präsumtive Listerienkolonien, die makroskopisch zu erkennen sind – zum einen an der Färbung, zum anderen an den schwarzen Höfen, die sich aufgrund der Reaktion zwischen Produkt der Äskulinhydrolyse und Eisen-Ammonium-Citrat bilden. Nach 48 h weisen typische Kolonien eingesunkene Zentren auf. Die Produktivität von L. monocytogenes als auch L. innocua erschien annähernd gleich zu sein.
Bei erheblichem Wachstum der Begleitflora wurde die Isolation von Listeria spp. teilweise unmöglich (BUNČIĆ 1991; KORSAK et al. 1998).
Der zweite feste Nährboden, den die DIN EN ISO 11290 vorschreibt, ist der PALCAM-Agar (VAN NETTEN et al. 1989). Auch im PALCAM-Agar sind Äskulin und Eisen enthalten, so dass nach 24 h Inkubation ca. 1 mm große, graugrüne Kolonien entstehen, die regelmäßig nach 48 h in den Zentren eingesunken und von schwarzen Höfen umgeben sind.
SCOTTER et al. (2001) demonstrierten eine höhere Sensitivität des PALCAM-Agars, die allerdings nicht signifikant war. In Fleischerzeugnissen wurde mit Oxford-Agar, PALCAM- Agar und LPM je eine vergleichbare Anzahl positiver Nachweise ermittelt (CORDANO u.
ROCOURT 2001). Weitere Studien bestätigen PALCAM gegenüber Oxford als sensitiveren und selektiveren Nährboden für die Isolation von Listerien (JOHANSSON 1998; WANG et al. 1992). Bei Untersuchungen von Fleisch bzw. Fleischerzeugnissen verhinderte PALCAM- Agar das Wachstum der Begleitflora effektiver als Oxford-Agar (WANG et al. 1992;
GUNASINGHE et al. 1994).
Die Ergebnisse verdeutlichen die Abhängigkeit der tatsächlichen Sensitivität der festen selektiven Nährmedien von der Art der untersuchten Lebensmittelprobe. In vergleichenden Studien konnte kein Nährbodentyp in jedem Fall Listerien aus den Proben isolieren. Die Verwendung zweier Nährmedientypen zur Differenzierung wurde als positiv bewertet, wenn nicht gar als notwendig angesehen (BRUNNER u. BÜLTE 2001; CORDANO u.
ROCOURT 2001; JINNEMAN et al. 2003; SCHMIDT et al. 1988).
Lebensmittel enthalten häufig Mischkontaminationen, in denen L. innocua aufgrund einer kürzeren Generationszeit den eigentlichen Zielkeim in der Anreicherungskultur überwachsen kann, was dann zu falsch-negativen Ergebnisse führt (BECKER et al. 1998; BRUNNER u.
BÜLTE 2001; CURIALE u. LEWUS 1994; JOHANSSON 1998). In Abwesenheit von Listeria innocua wurde Listeria monocytogenes immer nachgewiesen. Je größer ein gegebe- nes Verhältnis von Listeria monocytogenes zu Listeria innocua ist, desto wahrscheinlicher ist der Nachweis des Erregers (CURIALE u. LEWUS 1994). Obwohl das Verhältnis 1:2 betrug, wurden nur 5,4 % der Erreger-enthaltenden Proben als solche identifiziert. Damit wird die entscheidende Bedeutung des Verhältnisses von L. monocytogenes zu L. innocua deutlich.
Die bevorzugte Wiederfindung von Innocua ist vereinbar mit den Unterschieden in der Wachstumsrate.
Falsch-negative Ergebnisse konnten dadurch erklärt werden, dass v. a. L. innocua aufgrund einer schnelleren Generationszeit L. monocytogenes überwuchs und interferierte bzw. dass die Medien nicht das Potential hatten, zwischen L. monocytogenes und L. innocua zu unterschei- den (JOHANSSON 1998). Daraus folgt, dass der Nachweis von nicht-pathogenen Listerien in Lebensmitteln nicht die Möglichkeit ausschließt, dass L. monocytogenes enthalten sein könnte, jedoch nicht isoliert wurde. Bei JOHANSSON (1998) belief sich die Übereinstim- mung bezüglich positiver Proben, die mit unterschiedlicher Sensitivität mittels verschiedener Nährböden erkannt wurden, auf 77 % (Übereinstimmung für alle Proben und alle Nährböden).
Es wurde vorgeschlagen, neue Differenzierungsnährböden in das Protokoll der ISO 11290- 1 zu integrieren, damit die Identifizierung von L. monocytogenes in zusätzlichen positiven Proben ermöglicht wird, die evtl. nicht mit der bisherigen Vorgehensweise erkannt würden (BEUMER u. HAZELEGER 2003). Die Häufigkeiten von L. monocytogenes in Lebens- mitteln würden dann mit großer Wahrscheinlichkeit höhere Werte erreichen.
Arbeiten liegen vor zum Rapid’ L. mono-Agar (BECKER u. MURPHY 2001; POLIVKA 2001; GRACIEUX et al. 2002), zum Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti(ALOA) (VLAEMYNCK et al. 2000; BAUWENS et al. 2003; BÜLTE et al. 2003; GRACIEUX et al.
2003), zum BCM L. monocytogenes-Agar (BCM-Agar) (JINNEMAN et al. 2003) und zum Listeria monocytogenes-Blutagar (LMBA) (JOHANSSON 1998; BRUNNER u. BÜLTE 2001).
2.3.2 Immunologische Methoden
2.3.2.1 Allgemeines
Als immunologische Methoden werden alle Analyseverfahren bezeichnet, die auf der Immunoreaktion zwischen Antigen und Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper- Komplexes basieren. Die Immunoreaktion verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz (OELLERICH 1983, S. 239f; NELSON u. COX 2001, S. 242 f).
Markersubstanzen für die Reagenzien eines Immunoassays können radioaktive Isotope oder Enzyme, Hemmstoffe von Enzymen, fluorogene Substrate, Fluoreszenzfarbstoffe und metallische Atome sein (OELLERICH 1983, S. 236 – 237, S. 233).
Antigen-Antikörper-Reaktionen mit enzymmarkierten Reagenzien (Enzymimmunoassay, EIA, und Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) verfügen im Vergleich zu anderen immunologischen Methoden über eine um 2 bis 3 Zehnerpotenzen gesteigerte Nachweis- empfindlichkeit (BAUMGART et al. 1997, III.4, S. 2).
Für den Nachweis von Antigenen in der Lebensmitteldiagnostik kommt hauptsächlich der ELISA zum Einsatz. Verwendete Systeme sind der Sandwich-ELISA (nicht-kompetitiver ELISA) und der kompetitive ELISA, die sich in ihrem Testprinzip unterscheiden (BAUMGART et al. 1997, III, S. 2 – 4; GOTTSTEIN 1991).
2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes)
Innerhalb der Gattung Listeria gibt es eine beträchtliche Anzahl gemeinsamer Antigene (SEELIGER u. JONES 1986), weshalb Listeria monocytogenes nicht auf Basis konventio- neller serologischer Reaktionen identifiziert werden kann.
Polyklonale Antikörper gegen Listeria spp. erwiesen sich als nicht gattungsspezifisch (GRAY u. KILLINGER 1966). Um L. monocytogenes z. B. in LM nachzuweisen, wurden auf monoklonalen Antikörpern (mAK) basierende Enzymimmunoassays entwickelt (FARBER u.
SPEIRS 1987; FARBER et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988; McLAUCHLIN u. PINI 1989). Diese mAK richteten sich gegen Proteine (BUTMAN et al. 1988), Zell- oberflächenproteine (FARBER u. SPEIRS 1987; BHUNIA et al. 1991), Stoffwechselprodukte und Virulenzfaktoren wie Listeriolysin O (NATO et al. 1991).
Listeriolysin O zeigte strukturell strenge Homologien zu Cytolysinen von Streptococcus pyogenes und von Streptococcus pneumoniae (KEHOE et al. 1987; MENGAUD et al. 1987, 1988), die sich immer wieder in Kreuzreaktionen niederschlugen (NATO et al. 1991).
Frühe mAK reagierten entweder gattungsspezifisch mit Listerien (BUTMAN et al. 1988;
FARBER u. SPEIRS 1987; MATTINGLY et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988) oder mit L. monocytogenes, wobei Kreuzreaktionen mit L. welshimeri und / oder L. innocua (SIRAGUSA u. JOHNSON 1990; BHUNIA et al. 1991) auftraten.
Der Schwerpunkt der Entwicklung von Listeria spp.-spezifischen Antikörpern verlagerte sich auf das Protein p60 (s. Tab. 5).
Für einen indirekten Fluoreszenz-Immunoassay wurden polyklonale Antikörper (pAK) hergestellt, die sich gegen ein extrazelluläres 60 kDA Protein (p60; Tab. 5) von L. mono- cytogenes richteten. Das Anti-p60-Antiserum reagierte mit verschiedenen Listerien-Stämmen (RUHLAND et al. 1993). Alle Spezies der Gattung Listeria sekretieren p60 als extrazelluläres Protein (BUBERT et al. 1992a), wobei das p60 von Listeria monocytogenes charakteristische Unterschiede in der Aminosäuren-Sequenz gegenüber anderen Listerien-Arten aufweist.
Bei invasiven Stämmen ist die Aktivität der Sekretion sehr hoch (KUHN u. GOEBEL 1989;
BUBERT et al. 1992b). Das p60 kommt an der Zelloberfläche gleichmäßig verteilt vor (RUHLAND et al. 1993).
Aufgrund dieser Charakteristika ist das p60 prädestiniert, in der Lebensmitteldiagnostik als Ziel-Antigen für Listeria monocytogenes zu fungieren.
Tab. 5: Charakterisierung des Antigens p60 (sowie des p60-kodierenden Gens iap).
Eigenschaften Referenz
Protein in Überständen von Anreicherungskulturen
jede Listeria-Spezies besitzt spezifisches Molekulargewicht
KUHN u. GOEBEL 1989
Mureinhydrolase: essentiell für die Vermehrungsfähigkeit der Zelle WUENSCHER et al. 1993 thermoregulierte Genexpression RUHLAND et al. 1993 kodiert durch das iap-Gen („invasion associated protein“) KÖHLER et al. 1990 interne iap-Sequenzen für die spezies-spezifische Differenzierung
von Listeria monocytogenes oder von Listeria innocua geeignet
BUBERT et al. 1992a, 1992b, 1999; FURRER et al. 1991;
NIEDERHAUSER et al. 1992
Mit g a n z e n Zellen von L. monocytogenes reagierte das Anti-p60-Antiserum in jedem Fall und unabhängig von der Wachstumsphase der Kultur und von der Inkubationstemperatur (RUHLAND et al. 1993). In Ü b e r s t ä n d e n von Kulturen, die sich in einer frühen oder mittleren Wachstumsphase befanden, war das p60 hingegen n i c h t nachweisbar.
Inkubationstemperaturen von 37°C begünstigten die Antigen-Antikörper-Reaktion: bei geringeren Temperaturen (26°C) war eine weniger intensive Reaktion zu beobachten. Bei apathogenen L. monocytogenes-Stämmen stagnierte die Sekretion des p60, nicht aber die Genexpression des p60 als Zelloberflächenantigen.
Antiserum gegen ein synthetisches Peptid reagierte mit p60 aller L. monocytogenes- Serotypen, ohne mit anderen Listeria spp. kreuzzureagieren (BUBERT et al. 1994). Die pAK reagierten im ELISA mit sekretiertem p60, was anzeigte, dass zusätzlich zur denaturierten Form des p60 auch das native Antigen erkannt wurde. Zusätzlich wurde das Vorhandensein von p60 in Listeria monocytogenes-Feldstämmen nachgewiesen.
2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays
Allgemeine Mängel der kulturellen wie auch immunologischen Nachweissysteme offenbarten sich ebenso wie die Inkompatibilität von Bestandteilen des Analysensystems wie Anreicherung und Differenzierung (FELDSINE et al. 1997).
Die Sensitivität eines immunologischen Testsystems scheint von der Art des untersuchten Lebensmittels wie auch von der für ein LM typischen bakteriellen Flora abhängig zu sein (BEUMER u. BRINKMAN 1989; HEISICK et al. 1989; BARBUTI et al. 1995), und die Notwendigkeit, Inkubationszeiten an die Nachweismethoden anzupassen, wurde deutlich. Die Nachweisbarkeit scheint sowohl von der initialen Listerienanzahl als auch von der Vitalität der Zielkeime und von der Konzentration der lebensmitteltypischen Mikroflora abzuhängen (HEISICK et al. 1989). Diese Tatsache erlaubt den Schluß, dass bei einem Methodenvergleich zwischen einem neuen Test und einer Standardmethode die ermittelte Leistungsfähigkeit eines Tests von Sensitivität und Selektivität der verwendeten Medien abhängig ist. Dieser Zusammenhang wird durch die Aussagen einer Studie bekräftigt, bei der kulturelle Ergebnisse getrennt nach Typ des Nährbodens dokumentiert wurden (CAPITA et al. 2001). Sensitivitäts- und Spezifitätsgrade sowie die Übereinstimmungsgrade zwischen der kulturellen Methode
Ein Ansatz, den Anteil (falsch-)positiver Diagnosen eines getesteten immunologischen Systems gegenüber der kulturellen Methode zu verringern, war es, jede Probe, sobald sie als Listeria-positiv identifiziert war, als (richtig-)positiv anzusehen (HEISICK et al. 1989;
BECKER et al. 1998).
Zur Verkürzung des Untersuchungszeitraums wurden Methoden erprobt, den Zielkeim aus dem LM zu konzentrieren und zu extrahieren. Die Konzentrierungsmethoden wurden teilweise mit einem, selektiven oder nicht-selektiven, Anreicherungsschritt kombiniert (SHERIDAN et al. 1991, 1997; CLOAK et al. 1999).
Verschiedene Kombinationen aus mehreren Anreicherungsmedien wurden durchführt, um die vergleichsweise erfolgversprechendste zu ermitteln (ROBERTS 1994). Kombinationen mit Halbfraser-Bouillon stellten sich als die effektivsten heraus. Bei 30°C wurden noch Antigene (Flagellen) ausgebildet, während die Wachstumsrate der Keime suboptimal war.
Die Nachweisgrenze eines Sandwich-ELISA lag bei über 106 KbE pro ml (KERR et al. 1990).
Die Resultate ließen vermuten, dass der ELISA in Proben mit geringen Konzentrationen von Listerien falsch-negative Ergebnisse erzielte; nach Reinkubation über 24 Stunden lieferte der Test positive Listerien-Nachweise.
Vergleichende Untersuchungen mit immunologischen Testsystemen (z. T. automatisiert wie EiaFoss oder VIDAS LIS, Vitek Immunodiagnostic Assay System) und herkömmlichen Methoden wurden durchgeführt (HEISICK et al. 1989; WALKER et al. 1990; ROBERTS 1994; FELDSINE et al. 1997; KERDAHI u. ISTAFANOS 1997; PETERSEN u. MADSEN 2000).
Nachdem früher mit Hilfe der entwickelten Enzymimmunoassays und Koloniematerial der Nachweis von Listerien in LM geführt wurde (FARBER u. SPEIRS 1987; McLAUCHLIN u.
PINI 1989), gelangen immunologische Systeme heute typischerweise nach selektiven Anreicherungsschritten zur Anwendung (MATTINGLY et al. 1988; S∅LVE et al. 2000; s.
auch Tab. 6).
Die Tabellen 6 und 7 enthalten Ergebnisse verschiedener Studien, die Untersuchungen von dotiertem Fleisch bzw. Feldproben mit Hilfe von genus-spezifischen immunologischen Test- systemen durchführten.
Tab. 6: Nachweisgrenzen verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nach- weissysteme nach Untersuchungen von dotiertem Fleisch.
Referenz BEUMER u. BRINKMAN (1989) BEUMER u. BRINKMAN (1989) SHERIDAN et al. (1991) UYTTENDAELE et al. (1995) CLOAK et al. (1999)
Nachweis- grenze 107 Listerien/ml (negativer Nachweis) ca. 105 KbE/g (positiver Nachweis) 103 - 4 KbE/g
Anreicherung - Ja (selektiv) PA/SA - Ja (selektiv) PA/SA Ja (nicht- selektiv)
Immunologisches System Listeria-Tek ELISA Listeria-Tek ELISA Indirekter Immuno- fluoreszenztest (Bewertung in Kom- bination mit Hämolyse-Reaktion) Listeria-Tek ELISA SAIF (surface adhesion immunofluorescent technique)
Antikörper mAK mAK mAK CL 2 mAK CL 2
Dotiert: [KbE] 103 , 105 und 107 Listerien/ ml 10 – 100/ 25 g ca. 102 - 107 /g 1, 10 und 100 KbE/ 25 g 100 KbE/g
Probenmaterial u. a. Hackfleisch (o. A. der Tierart) u. a. Hackfleisch (o. A. der Tierart) Rindfleisch (Homogenat) gemischtes Hackfleisch Hackfleisch vom Rind
Tab. 7: Sensitivität und Spezifität verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von Feldproben.
Referenz SHERIDAN et al. (1991) CLOAK et al. (1999) BEUMER et al. (1996) ROBERTS et al. (1994)
Übereinstimmung Immunologisches
System & Kultur 62,5 % 96,7 % 82,6 % 99,9 % Spezifität
(Immunologisches
System) 100 % 100 % 100 % 100 %
Sensitivität
(Immunologisches
System) 25 % 91,3 % 79,2 % 98 %
Immunologisches
System –, Kultur + 3 2 5 1
Immunologisches
System +, Kultur – 0 0 0 0
Immunologisches
System & Kultur – 4 37 19 945
Immunologisches
System & Kultur + 1 21 19 49
Feldproben Rindfleisch (n = 8) Geflügel und Rinderhackfleisch (n = 60) Fleischerzeugnisse (n = 46) diverse LM (n = 995; davon 155 Fleischproben)
Vergleich mit
Kultur ja ja ja ja
Immunologisches System Indirekter Immuno- fluoreszenztest SAIF (surface adhesion immunofluorescent technique) Listeria Rapid Test Clearview Listeria Rapid Test Clearview
2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays
Der Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA (Zielantigen p60) wurde auf künstlich
kontaminierte Hackfleisch- und Brühwurstproben (rohe und hitzebehandelte Fleisch- erzeugnisse) sowie auf Feldproben von rohen Lebensmitteln angewendet, die nach zwei Anreicherungsschritten untersucht wurden (KLEINER u. SCHINKEL 2002). Die
Ergebnisse (s. Tab. 8) wurden mit den kulturellen Nachweisergebnissen gemäß § 35 LMBG in Beziehung gesetzt. Dieses ELISA-System bewies dieselbe Sensitivität wie die amtliche Methode nach § 35 LMBG, wobei die Nachweisrate in deutlicher Abhängigkeit zur anfänglichen Kontaminationsrate zu sehen war. Innerhalb von 2 Tagen lag der Anwesenheits- bzw. Abwesenheitsnachweis von L. monocytogenes vor. Weil mit dem Überstand einer Listerien-Anreicherung gearbeitet wird, sind weniger Komponenten der Lebensmittelprobe in dem zu untersuchenden Aliquot (0,1 ml) vorhanden. Ein negativer Einfluß auf die Nachweisgrenze des ELISA-Systems wird dadurch unwahrscheinlicher. Der p60-Nachweis wird anhand von denaturierten Zellen geführt, was für das Laborpersonal den Vorteil bietet, im geringeren Umfang mit infektiösem Material arbeiten zu müssen.
Eine vergleichende Studie unternahmen KERDAHI und ISTAFANOS (2000). Sie unter- suchten künstlich kontaminierte Lebensmittel mit dem VIDAS LMO (Vitek Immuno Diagnostic Assay System Listeria monocytogenes) (s. Tab. 8).
In Abhängigkeit vom Inokulationsniveau wurden 100 % und 89 % der positiven Proben bestätigt. Die positive Bestätigung gelang mit einer DNA-Gensonde bei 96 % und 87 % der- selben Proben. Der VIDAS LMO kombiniert mit der DNA-Gensonde erwies sich in einem Vergleich mit dem kulturellen Nachweis als sehr spezifisches System, das nach Anreicherung zwischen L. monocytogenes und anderen Listeria spp. unterscheiden kann.
Tab. 8: Nachweisgrenzen verschiedener L. monocytogenes-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.
Probenmaterial Dotiert: Immunologisches System
Nachweisgrenze Referenz Gemüse,
Räucherlachs
1 – 10 und 10 – 100 KbE/25 g
VIDAS LMO 1 – 10 bis 10 – 100 KbE/25 g
KERDAHI u.
ISTAFANOS (2000) Hackfleisch,
Brühwurst
1 und 10 KbE/10 g
Transia plate Listeria monocytogenes-
1
KbE/10 g
KLEINER u.
SCHINKEL
BECKER et al. (1998) führten auch Untersuchungen mit den ELISA-Testkits von Merck (Pathalert Listeria monocytogenes) und bioMerieux (VIDAS LMO) durch.
Die untersuchten Proben und prinzipiell die Vorgehensweise waren dieselben wie bei dem gattungs-spezifischen Nachweis (2.3.2.3). Die Testsysteme zeigten eine Anfälligkeit für falsch-negative Ergebnisse. Sie erwiesen sich aber als geeignet, in einer Mischkultur aus L. monocytogenes und L. innocua den Erreger nachzuweisen. In einer anderen Probe korrespondierten die immunologischen Tests bezüglich des positiven Ergebnisses, obwohl aus keiner Anreicherung kulturell L. monocytogenes isoliert wurde. Allerdings wurde kulturell mehrfach L. innocua differenziert.
Prinzipiell ist der Nachweis nur schwach hämolytischer Monocytogenes-Stämme möglich, wie anhand des Pathalert Listeria monocytogenes gezeigt wurde (FRIEDRICH u.
SCHUBERT 1995).
Mittlerweile stehen mAK zur Verfügung, die ausschließlich l e b e n d e Listerien – auch L. monocytogenes-spezifisch – detektieren (TORENSMA et al. 1993; KATHARIOU et al.
1994). Diese mAK könnten bei immunologischen Separationen nützlich sein, die im Vorfeld einer PCR durchgeführt werden könnten (S∅LVE et al. 2000). Dadurch könnten falsch- positive PCR-Ergebnisse ausgeschlossen bzw. könnten Anreicherungszeiten reduziert werden.
2.3.3 Molekularbiologische Methoden
Bei den molekularbiologischen Methoden gibt es zum einen die Möglichkeit der direkten DNA-Hybridisierung mit molekularen Gensonden. Zum anderen ist im Rahmen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach der Vervielfältigung (Amplifikation) von DNA- Abschnitten die Darstellung spezifischer PCR-Produkte (Amplifikate) möglich. Eine Anzahl von Gensonden (Segmente einzelsträngiger Nukleinsäuren) wurden für den Nachweis von L. monocytogenes konstruiert und radioisotopisch (KLINGER et al. 1988), enzymatisch (KING et al. 1989) oder chemolumineszent (BOBBITT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992;
BECKER u. MURPHY 2001) markiert. Die Sonden basierten entweder auf dem Listeriolyin O-(β-Hämolysin-) Gen (CHENEVERT et al. 1989; DATTA et al. 1987, 1988a, 1988b, 1990;
KIM et al. 1991) oder auf einer 16s rRNA-Sequenz (KLINGER et al. 1988; KING et al. 1989;
BOBBIT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992; BECKER u. MURPHY 2001).
NASBA®, eine alternative, isothermal ablaufende Amplifikationstechnik, wurde ebenfalls erprobt (UYTTENDAELE et al. 1995). Die Amplifikationsprodukte wurden per Agarosegel- Elektrophorese oder Enzyme Linked Gel Assay (ELGA) nachgewiesen. Die enzymmarkierte ELGA-Sonde war spezifisch für 16s rRNA und hybridisierte mit den NASBA®-Produkten.
Nicht-hybidisierte ELGA-Sonden und Hybride wurden mittels vertikaler Polyamidgel- Elektrophorese getrennt.
Die Nachweisgrenze betrug 2 x 106 KbE Listeria monocytogenes pro ml.
Die PCR ist ein Instrument für die exponentielle Vervielfältigung gesuchter Nukleotid- sequenzen von Genombereichen, die z. B. für den spezifischen Nachweis von Listeria monocytogenes geeignet sind. Die PCR steigert die Sensitivität des Nachweises, der theoretisch mit einem einzigen Molekül der Ziel-DNA geführt werden kann (BEJ et al. 1990).
Die DNA-Sequenz erreicht nachweisbare Konzentrationen, die z. B. durch Agargel- Elektrophorese oder DNA-Hybridisierung dargestellt werden können.
In Schritt 1 (Denaturierung der DNA-Doppelstränge) des ersten Amplifikationszyklus einer PCR wird die DNA durch Erhitzen auf 95°C in ihre Einzelstränge überführt.
In Schritt 2 (Annealing) erfolgt eine Abkühlung auf ca. 55°C. Die Primer können mit den
Für Schritt 3 (DNA-Synthese bzw. Elongation) wird die Temperatur auf die optimale Reaktionstemperatur der hitzestabilen DNA-Polymerase (72°C) erhöht. Die DNA-Polymerase kopiert von 3‘ nach 5‘ einen neuen komplementären Strang unter Verwendung der vier Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der neue Strang ist einseitig begrenzt durch die Sequenz des Primers und enthält die Sequenz, die komplementär zum zweiten Primer ist.
Im zweiten Zyklus dient der neu synthetisierte Strang neben dem ursprünglichen als Matrize.
Weil der Strang mit der Sequenz des ersten Primers endet, kommt es bei der DNA-Synthese an dieser Stelle zum Kettenabbruch. Durch Wiederholung der Zyklen kommt es zu einer exponentiellen Vervielfältigung des zwischen den beiden Primern gelegenen DNA- Abschnittes (CANDRIAN et al. 1991).
2.3.3.1 PCR als integrales System
Die Definition integraler Systeme ist, dass alle Prozessschritte einer Analyse, bei der als letzter Schritt eine PCR durchgeführt wird, aufeinander abgestimmt sind (KRISMER et al.
2002). Dabei sind die Prozessschritte (Probenaufbereitung, Anreicherung, Extraktion der DNA) geprüft worden, ob sie für die PCR in einem speziellen Fall kompatibel sind.
Die dringende Notwendigkeit, integrale Systeme zu etablieren, ergibt sich sowohl aus der Komplexität als auch aus der Verschiedenheit der Lebensmittelmatrizes hinsichtlich ihrer mikrobiologischen und chemischen Bestandteile.
2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR
Die Keimzahlen der Ziel-Organismen liegen nach Anreicherung mit höherer Wahrschein- lichkeit oberhalb der Nachweisgrenze eines PCR-Systems (CANDRIAN et al. 1991). Vor der Durchführung des eigentlichen Schnelltests erfolgen oft zweistufige Inkubationsschritte, damit geringe Mengen von Pathogenen in Lebensmitteln höhere Zielkeim-Konzentrationen erreichen, die genügen, um detektiert werden zu können.
Gegenstand heutiger Studien ist das Interesse, mit Hilfe von Schnellmethoden innerhalb eines Tages zu einer Diagnose über die Präsenz von L. monocytogenes zu gelangen (DEVER et al.
1993).
Die PCR ist eine hochsensitive Methode (s. 2.3.3). Sie ist in der Lage, DNA von toten respektive nicht vermehrungsfähigen Mikroorganismen nachzuweisen.
Durch die Verdünnung mit einem Anreicherungsmedium reduziert sich das Risiko falsch- positiver Ergebnisse durch nicht kultivierbare Mikroorganismen (CANDRIAN et al. 1991;
WERNARS et al. 1992; NIEDERHAUSER et al. 1992; SCHEU et al. 1998).
Verglichen mit der Nachweisgrenze für Reinkulturen oder reiner DNA liegt die Nachweis- grenze für natürliche Proben oft deutlich höher (WERNARS et al. 1992; ROSSEN et al. 1991, 1992; DICKINSON et al. 1995). Das Erreichen einer höheren Zielkeim-Konzentration mit Hilfe einer Anreicherung ist gerade bei der Diagnostik aus Lebensmittelmatrizes von Be- deutung, weil bei der Durchführung der PCR technische Probleme durch Inhibitions- phänomene auftreten können (ROSSEN et al. 1992). In einer Studie zum PCR-Nachweis von Yersinia enterocolitica inhibierte ein Zusatz von Schweinefleischhomogenat die PCR- Reaktion vollständig (LANTZ et al. 1998). Anreicherungsmedien (z. B. Fraser) können inhibierend auf eine PCR-Reaktion wirken (ROSSEN et al. 1991, 1992). Die PCR toleriert lediglich 0,0001 % der gebräuchlichen Eisen-Ammoniumcitrat-Konzentration, was einer 50- fachen Verdünnung der Fraser-Bouillon entspricht (ROSSEN et al. 1992). PCR-Inhibitoren werden durch eine Anreicherung vor der PCR-Amplifikation ebenfalls verdünnt.
Die Anreicherung von Lebensmittelproben vor der PCR-Analyse wurde in vielen Studien angewendet (Tab. 10) und ist i. d. R. angezeigt.
Die direkte PCR (Verzicht auf Anreicherung) bietet die Möglichkeit, schwer kultivierbare Mikroorganismen nachzuweisen oder Proben zu analysieren, die ohnehin mit einer hohen Konzentration des Zielkeimes belastet sind (BECKER u. HOLZAPFEL 2002). Die direkte PCR zum Nachweis von L. monocytogenes aus Lebensmitteln (z. B. WERNARS et al. 1992;
MAKINO et al. 1995; SIMON et al. 1996) wird als eine nicht praktikable Methode für die Routine-Detektion angesehen. Gerade dem Nachweis dieses Erregers aus Fleisch sind enge Grenzen gesetzt (ROSSEN et al. 1992; LANTZ et al. 1998; DICKINSON et al. 1995).
Nur geringe Volumina einer Anreicherungskultur resp. einer Lebensmittelprobe können je PCR-Reaktion analysiert werden, was ein zusätzliches Problem bei der direkten Anwendung einer PCR darstellt (CANDRIAN 1994).
Das limitierte Volumen der Aliquote in Verbindung mit einer nicht-homogenen Verteilung der Zielkeime in der Lebensmittelmatrix kann zu falsch-negativen Resultaten in der Analyse
Idealerweise wird während der Anreicherung das Wachstum einer Auswahl bestimmter Keime unterstützt; und zwar am besten mehr als eine Spezies und / oder mehr als eine Art von Interesse (CLOAK et al. 1999). BAILEY und COX (1992) beschrieben die Anwendung eines simultanen Anreicherungsschrittes für Listeria und Salmonella in Lebensmitteln.
Ein simultaner Anreicherungsschritt wäre insofern vorzuziehen, als dass die Durchführung billiger und weniger arbeitsintensiv wäre. Ein Nachteil ist die Selektivität einer einzigen Anreicherungs-Bouillon für die verschiedenen Organismen und die Effektivität der Bouillon bei der simultanen Isolation von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen (BEUMER u. HAZELEGER 2003).
Frische Anreicherungskulturen sollten bevorzugt eingesetzt werden, weil eine Lagerung zum Abbau der DNA führen könnte (NIEDERHAUSER et al. 1992).
Zur Verkürzung der Nachweiszeit gibt es weitere Methoden, die die Konzentration und Extraktion der Ziel-Spezies aus dem Lebensmittel ermöglichen (SCHEU et al. 1998).
2.3.3.3 Listeria monocytogenes-spezifische Zielsequenzen
Verschiedene Proteine wurden charakterisiert, die für die Pathogenität von L. monocytogenes von Bedeutung sind. Dazu gehören das Listeriolysin O und die Zink-Metalloprotease.
Die Eigenschaften (letale Toxizität im Mausversuch, entzündungsauslösend) des Hämolysins, als Listeriolysin O bezeichnet, führten zu der Annahme, dass es sich dabei um einen wichtigen Pathogenitätsfaktor von L. monocytogenes handelt (GEOFFROY et al.1987). Es wird kodiert durch das L. monocytogenes-spezifische hlyA-Gen (MENGAUD et al. 1988).
Das Listeriolysin O (Molekulargewicht 58 kDa), nicht zell-assoziiert, liegt in relativ großen Mengen – verglichen mit sekretierten Mengen an Protein p60 – in den Überständen von Anreicherungskulturen vor (KUHN u. GOEBEL 1989; RUHLAND et al. 1993). Es ist hämo- lytisch aktiv und essentiell für die Virulenz bzw. das intrazelluläre Vorkommen von L. mono- cytogenes (COSSART et al. 1989; PORTNOY et al. 1988). Die Serotypen 1/2b und 4b verfügen über eine identisches Listeriolysin O (VINES u. SWAMINATHAN 1997). Trotz zahlreicher Homologien mit anderen Cytolysinen in Sequenzen der Aminosäuren (MENGAUD et al. 1987, 1988; KEHOE et al. 1987) besteht hinsichtlich der DNA-Sequenzen keine substantielle Homologie (MENGAUD et al. 1988).
