Untersuchungen zum Nachweis von Salmonellen in natürlich und künstlich kontaminierten Lebensmitteln mittels kultureller Methode, ELISA, PCR und Microarray

___________________________________________________________________________

Untersuchungen zum Nachweis von Salmonellen

in natürlich und künstlich kontaminierten Lebensmitteln mittels kultureller Methode, ELISA, PCR und Microarray.

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Elmar Lubenow aus Ravensburg

Hannover 2002

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. S. Wenzel

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 29. November 2002

Die Arbeit wurde aus Mitteln der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung gefördert.

1. Einleitung ...11

2. Schrifttum ...13

2.1 Salmonellen... 13

2.1.1 Entdeckung... 13

2.1.2 Taxonomie... 13

2.1.3 Kulturelle Eigenschaften ... 15

2.1.4 Serologische Eigenschaften... 16

2.1.5 Epidemiologie ... 17

2.1.6 Pathogenese... 20

2.1.7 Klinische Salmonellose des Menschen ... 21

2.1.8 Prophylaxe... 22

2.2 Nachweisverfahren von Salmonellen in Lebensmitteln... 23

2.2.1 Kulturelle Untersuchungsverfahren ... 23

2.2.1.1 Standard-Kulturverfahren... 23

2.2.1.2 Kulturelle Schnellmethoden... 27

2.2.2 Immunologische Nachweisverfahren... 30

2.2.3 Molekularbiologische Nachweisverfahren... 34

2.2.4 Methodenvergleich... 37

2.2.5 Bisher durchgeführte Vergleiche verschiedener Nachweisverfahren ... 39

2.2.5.1 Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität mit Bakterien- Reinkulturen... 39

2.2.5.2 Untersuchungen zur Nachweisgrenze verschiedener Nachweisverfahren von Salmonellen in Lebensmitteln... 42

2.2.5.3 Untersuchungen zur Nachweisgrenze verschiedener Salmonellen- Nachweisverfahren unter Ausschluss der Salmonellenanreicherung... 44 2.2.5.4 Vergleichende Untersuchungen verschiedener Nachweisverfahren

3.1.1 Hackfleisch... 63

3.1.2 Mikroorganismen ... 63

3.2 Methoden ... 64

3.2.1 Kulturelle Methode... 64

3.2.2 Tecra^® unique^TM Salmonella ELISA... 67

3.2.3 PCR ... 69

3.2.4 NUTRI^®-CHIP ... 72

3.3 Versuche... 80

3.3.1 Dotierung von Hackfleisch mit Salmonellen ... 80

3.3.1.1 Ermittlung der für die Dotierung erforderlichen Keimzahl ... 80

3.3.1.2 Verfahren zur Überprüfung einer ausreichenden Durchmischung nach der Dotierung... 82

3.3.1.3 Erstellung einer Dotierungslösung und Dotierung des Hackfleisches ... 83

3.3.2 Vergleich der Sensitivität der verschiedenen Nachweisverfahren ... 85

3.3.3 Bestimmung der Mindest-Voranreicherungszeit für die verschiedenen Nachweisverfahren... 87

3.3.4 Vergleich der Sensitivität der Untersuchungsverfahren bei Verwendung von Salmonella-Reinkulturen und Verzicht auf eine nicht-selektive Voranreicherung... 90

3.3.5 Einfluss einer definierten Begleitflora auf den kulturellen Nachweis von Salmonellen nach selektiver Anreicherung in Rappaport-Vassiliadis- Medium ... 90

3.3.6 Vergleichende Untersuchung von Feldproben... 91

4. Ergebnisse ...93

4.1 Dotierung von Hackfleisch mit Salmonellen ... 93

4.1.1 Ermittlung der für die Dotierung erforderlichen Keimzahl... 93

4.1.2 Verfahren zur Überprüfung einer ausreichenden Durchmischung nach der Dotierung... 94

4.4 Vergleich der Sensitivität der Untersuchungsverfahren bei Verwendung von Salmonella-Reinkulturen und Verzicht auf eine nicht-selektive

Voranreicherung... 109

4.5 Einfluss einer definierten Begleitflora auf den kulturellen Nachweis von Salmonellen nach selektiver Anreicherung in Rappaport-Vassiliadis-Medium .... 113

4.6 Vergleichende Untersuchung von Feldproben... 115

5. Diskussion...119

5.1 Dotierung ... 119

5.1.1 Dotierungsmaterial ... 119

5.1.2 Verfahren zur Überprüfung einer ausreichenden Durchmischung nach der Dotierung... 120

5.2 Vergleich der Sensitivität verschiedener Nachweisverfahren... 121

5.3 Bestimmung der Mindest-Voranreicherungszeit für verschiedene Nachweisverfahren... 122

5.4 Nachweisgrenze der „eigentlichen“ Nachweisverfahren mit Salmonella- Reinkulturen... 123

5.5 Vergleichende Untersuchung von Feldproben... 125

5.6 Beurteilung des NUTRI^®-Chip-Testverfahrens ... 129

5.7 Vergleich der Nachweisverfahren hinsichtlich des Zeit-, Arbeits- und Materialaufwandes ... 131

5.8 Schlussfolgerungen ... 133

6. Zusammenfassung ...135

7. Summary ...138

8. Literatur ...141

9.3 Nähr- und Differenzierungsmedien... 179

9.4 ELISA-Materialien... 183

9.5 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen... 183

9.5.1 Reagenzien ... 183

9.5.2 Rezepturen... 184

9.6 Geräte und Verbrauchsmaterialien... 186

9.7 Tabellenverzeichnis ... 188

9.8 Abbildungsverzeichnis... 191

Aqua dest. Aqua destillata

BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin

BHI-Bouillon Brain Heart Infusion (Hirn-Herz-Glucose-Bouillon)

bp Basenpaar

BPLS-Agar Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar

bzw. beziehungsweise

ca. circa

d.h. das heißt

DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

E. Escherichia

E. c. Escherichia coli

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbant Assay

et al. et alii

evtl. eventuell

°C Grad Celsius

g Gramm

g Fallbeschleunigung

GKZ Gesamtkeimzahl

h Stunde

H2S Schwefelwasserstoff

HACCP Hazard Analysis Critical Control Point

i.d.R. in der Regel

Ig Immunglobulin

inkl. inklusive

ITS Interner Standard

Kontr. Kontrolle

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

MSRV Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium

neg. negativ

nm Nanometer

P Phosphor

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

pH pondus hydrogenii

pos. positiv

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

RV Rappaport-Vassiliadis

S. Salmonella

s. siehe

s.o. siehe oben

SC Selenit-Cystin

spp. Species

ssp. Subspezies

Tab. Tabelle

u. und

UV Ultraviolett

u.v.a.m. und vieles andere mehr

v.a. vor allem

vgl. vergleiche

v.l.n.r. von links nach rechts

VP Voges Proskauer

z.B. zum Beispiel

1. Einleitung

Zu den häufigsten bakteriell bedingten Anthropozoonosen zählen nach wie vor die Salmonellen-Infektionen. Die Enteritis-Salmonellen stellen nicht nur in der Bundesrepublik Deutschland derzeit die überwiegende Ursache bakteriell bedingter gastrointestinaler Erkrankungen dar. Allein durch Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhimurium erkranken nach WHO-Angaben jährlich weltweit über 33 Millionen Menschen (KREUZER 2002).

Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie über kontaminierte Lebensmittel tierischer Herkunft. Bei diesen Lebensmitteln handelt es sich vor allem um Rind- und Schweinefleisch, Geflügelfleisch, Eier, Milch und Erzeugnisse aus diesen Produkten.

Die infektiöse Dosis von Salmonellen ist u.a. abhängig von der Art des Lebensmittels, der Virulenz des Salmonellen-Stammes und der Immunlage des Menschen. Da bereits wenige Salmonellen zu einer Erkrankung führen können, muss jedes mit Salmonellen kontaminierte Lebensmittel als gesundheitliches Risiko für den Menschen angesehen werden (SINELL 1992).

Zum Schutz der Gesundheit des Menschen enthält das Lebensmittelrecht zahlreiche Vorschriften zu den hygienischen Anforderungen an die Herstellung, Behandlung und das Inverkehrbringen von Lebensmitteln (MERSMANN 2001), wozu auch die systematische Untersuchung auf Salmonellen gehört.

Zahlreiche Untersuchungsverfahren zum Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln wurden in den vergangenen zwei Jahrzehnten entwickelt. Sie lassen sich einteilen in kulturelle Nachweisverfahren, immunologische und molekularbiologische Methoden.

Um detektierbare Salmonellenkonzentrationen zu erzielen, ist für die meisten Nachweisverfahren die Durchführung einer Salmonellenanreicherung erforderlich.

Die verschiedenen Untersuchungsmethoden unterscheiden sich hinsichtlich der Sensitivität, der Spezifität, der Dauer vom Beginn der Untersuchungen bis zum Vorliegen eines sicheren Ergebnisses, sowie in ihrem Labor- und Arbeitsaufwand.

In der Literatur wurden verschiedene Versuche beschrieben, um die Nachweisgrenze der

12

Sensitivität und Spezifität ermittelt. Zumeist wurde ein Schnellverfahren mit der Kulturmethode verglichen, daneben wurden auch parallele Vergleiche mehrerer Nachweisverfahren beschrieben. Die gleichzeitige Untersuchung von Kulturmethode, ELISA- Verfahren und Polymerase-Kettenreaktion wurde bislang aber nur selten durchgeführt.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher der parallele Vergleich der Kulturmethode, eines ELISA-Verfahrens und eines PCR-Verfahrens hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität unter besonderer Berücksichtigung des Voranreicherungsprozesses. Dieser Vergleich sollte sowohl mit Dotierungsversuchen von Hackfleisch als auch anhand natürlich kontaminierter Proben durchgeführt werden.

Zusätzlich sollte in den Versuchsaufbau ein neuartiger Biochip-basierter Microarray integriert werden.

2. Schrifttum

2.1 Salmonellen

Salmonellen sind 0,7 – 1,5 x 2,0 – 5,0 µm lange, gramnegative Stäbchenbakterien der Familie Enterobacteriaceae. Sie lassen sich in eine Vielzahl von Stämmen und Serovaren unterteilen, viele von ihnen gelten als Zoonoseerreger (ROLLE u. MAYR 2002). Die meisten Salmonellen sind peritrich begeißelt und daher gut beweglich.

2.1.1 Entdeckung

Im Jahr 1880 wiesen Eberth und Koch zum ersten Mal den Erreger des Typhus abdominalis des Menschen mikroskopisch nach, und 1884 gelang es Gaffky diesen Erreger anzuzüchten.

Unter der Leitung von D. E. Salmon konnte T. Smith 1885 den Erreger der Schweinecholera erstmals nachweisen. 1900 wurde von Lignières die Genusbezeichnung Salmonella vorgeschlagen (ROLLE u. MAYR 2002).

Inzwischen sind 2463 Serotypen/Serovare bekannt (POPOFF et al. 2000).

2.1.2 Taxonomie

KAUFFMANN (1966) definierte die unterschiedlichen Stämme als Arten („one serotype – one species concept“) und teilte diese anhand ihrer serologischen Eigenschaften (O- und H- Antigene) in Gruppen ein, die im Kauffmann-White Schema aufgelistet sind.

Aufgrund der Klärung der verwandtschaftlichen Beziehungen (z.B. durch DNA-DNA- Hybridisierungen) werden die Salmonella-Stämme allerdings besser als Serovare bezeichnet (CROSA et al. 1973). Der Gattung (Genus) Salmonella lassen sich zwei Arten (Spezies) zuordnen: Salmonella choleraesuis und Salmonella bongori (POPOFF et al. 1992, SELBITZ u. BISPING 1995). Die Spezies S. choleraesuis wiederum lässt sich mit genetischen, biochemischen und serologischen Methoden in sechs Unterarten (Subspezies) unterteilen: ssp.

choleraesuis (Subspezies I), ssp. salamae (Subspezies II), ssp. arizonae (Subspezies IIIa,

14

Subspezies V bezeichnet. Jeder dieser Subspezies (und der Spezies bongori) sind unterschiedlich viele Serovare zugeordnet (s. Tabelle 1).

Da die Bezeichnung „choleraesuis“ neben der Spezies- und Subspeziesbezeichnung auch die Bezeichnung eines Serovars darstellt, führte dies in der Praxis häufig zu Verwirrung. 1986 wurde daher vorgeschlagen, die Spezies- / Subspeziesbezeichnung „choleraesuis“ durch

„enterica“ zu ersetzen (LE MINOR u. POPOFF 1987, BRENNER et al. 2000). Dieser Vorschlag wurde unter anderem von dem „Center for Disease Control and Prevention“ (CDC) und verschiedenen Laboratorien angenommen, und auch in der Praxis hat sich diese Bezeichnung durchgesetzt. Die „Judicial Commission of the International Committee of Systematic Bacteriology“ lehnte die Umbenennung jedoch ab, da man annahm, dass dem Serovar Typhi unter der Bezeichnung Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi nicht die nötige Bedeutung zugemessen wird (BRENNER et al. 2000).

Die Serovare, die zu der Subspezies choleraesuis bzw. enterica gehören, werden weiterhin mit ihrer ursprünglichen Bezeichnung (vgl. Kauffmann-White-Schema) beschrieben (z.B.

Salmonella choleraesuis ssp. choleraesuis Serovar Typhimurium bzw. Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhimurium, oder kurz: S. Typhimurium). Die übrigen Serovare werden mit den römischen Zahlen der entsprechenden Subspezies (II bis VI) und den Antigenformeln beschrieben (z.B. Salmonella IIIb 6,7,14:z39:1,2) (BISPING u. AMTSBERG 1988).

Für die vorliegende Arbeit wurde die praxisübliche Speziesbezeichnung „enterica“ gewählt (s. Tabelle 1).

Tab. 1: Salmonella spezies, subspezies, Serovare und ihr üblicher Lebensraum (aus BRENNER et al. 2000)

Salmonella spezies und üblicher Lebensraum:

subspezies

Anzahl der Serovare

S. enterica ssp. enterica (I) 1454 warmblütige Lebewesen, inklusive Mensch S. enterica ssp. salamae (II) 489 kaltblütige Tiere, Umwelt, auch Mensch S. enterica ssp. arizonae (IIIa) 94 kaltblütige Tiere, Umwelt

S. enterica ssp. diarizonae (IIIb) 324 kaltblütige Tiere, Umwelt S. enterica ssp. hountenae (IV) 70 kaltblütige Tiere, Umwelt S. enterica ssp. indica (VI) 12 kaltblütige Tiere, Umwelt

S. bongori (V) 20 kaltblütige Tiere, Umwelt

Summe 2463

2.1.3 Kulturelle Eigenschaften

Salmonellen stellen an Nährmedien keine besonderen Ansprüche. Um auch subletal geschädigte Salmonellen kultivieren zu können, empfiehlt es sich, eine nicht-selektive Voranreicherung (z.B. mit Peptonwasser) durchzuführen. Eine selektive Anreicherung (z.B.

mit Selenit-Cystin-Medium) dient der Unterdrückung der Begleitflora. Da Salmonellen auf Standard-Nährböden kein spezifisches Wachstum zeigen, werden zur Unterscheidung von anderen Enterobakterien Differentialnährböden verwendet (ROLLE u. MAYR 2002). Als solche festen Selektivplatten kommen z.B. Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar (BPLS-Agar), Rambach-Agar und der Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar (XLD-Agar) zum Einsatz (BAUMGART 1997). Zur Vermehrung bedarf es einer Temperatur zwischen 5,2 °C und 46,2 °C, wobei das Temperaturoptimum 35 – 45 °C beträgt. Außerdem muss der pH- Wert zwischen 4 und 8 liegen, und die minimale Wasseraktivität (aw-Wert) beträgt ca. 0,93 (BAIRED-PARKER 1991, BAUMGART 1997).

16

Für die meisten Serovare gelten folgende kulturell-biochemischen Eigenschaften (BISPING u. AMTSBERG 1988, ROLLE u. MAYR 2002):

- fakultativ anaerob,

- Laktose negativ (d.h. unfähig Laktose zu spalten; dient z.B. zur Identifizierung mittels BPLS-Agar ),

- Glucoseabbau, Sorbitabbau, Mannit- und Malonatabbau, - Lysindecarboxylasebildung, Ornithindecarboxylasebildung, - keine Indolbildung, keine Ureasebildung,

- kein Adonitabbau, kein Saccharoseabbau, - positive Methylrot-Reaktion,

- negative Voges-Proskauer-Reaktion,

- H2S- Bildung (schwärzliches Aussehen der Kolonien auf XLD-Agar),

- Abbau von Propylenglykol unter Säurebildung (charakteristische Rotfärbung der Kolonien auf Rambach-Agar),

- Fermentation von Glucuronat (Farbumschlag nach pink bei SMID-Agar), - negativer Phenylalanindesaminase-Test,

- Katalase positiv, Oxidase negativ.

2.1.4 Serologische Eigenschaften

Die verschiedenen Salmonellenserovare unterscheiden sich durch ihre Antigeneigenschaften.

Die O-Antigene (=Zellwandantigene) stellen eine Komponente des Lipopolysaccharid- Protein-Komplexes dar. Dieser ist ein Bestandteil der Hülle aller gramnegativen Bakterien.

Anhand der Haupt-O-Antigene lassen sich die Serovare nach dem Kauffmann-White-Schema bestimmten Gruppen zuordnen. Innerhalb einer Gruppe (mit Buchstaben gekennzeichnet) tragen alle Serovare die gleichen Haupt-O-Antigene.

Bei den Minor-O-Antigenen dagegen handelt es sich um Antigene, die in mehreren Gruppen bei verschiedenen Serovaren vorkommen können. O-Antigene werden mit arabischen Ziffern bezeichnet (ROLLE u. MAYR 2002).

H-Antigene (Geißelantigene) treten in zwei Phasen auf. Die meisten Serovare sind diphasisch, d.h. beide Phasen des H-Antigens sind vorhanden. Ausschließlich monophasisch sind z.B. S.

Typhi, S. Dublin und S. Abortusequi. Salmonella Gallinarum ist unbegeißelt und trägt daher gar keine H-Antigene.

Auf einem einzelnen Bakterium sind immer nur die Antigene einer Phase vorhanden, in einer Kultur eines diphasischen Serovars kommen sowohl Bakterien mit H-Antigenen der Phase 1, als auch der Phase 2 vor. Die Bezeichnung der H-Antigene der Phase 1 erfolgt mit kleinen lateinischen Buchstaben, die der Phase 2 mit arabischen Ziffern (BISPING u. AMTSBERG 1988, ROLLE u. MAYR 2002).

Das Vi-Antigen wird nur bei wenigen Serovaren (S. Typhi, S. Paratyphi und S. Dublin) angetroffen. Es entspricht dem Kapselantigen anderer Enterobakterien.

Zur Diagnostik von S. Enteritidis kann außerdem das Fimbrienantigen SEF-14 mittels Latexagglutination nachgewiesen werden.

Um einen unbekannten Salmonellen-Stamm zu identifizieren (=Serotypisierung) werden die Antigene mit speziellen O- und H-Antiseren durch eine Objektträgeragglutination bestimmt (ROLLE u. MAYR 2002).

2.1.5 Epidemiologie

Im Jahr 2001 wurden in Deutschland 76.732 Salmonella-Darminfektionen bei Menschen gemeldet (2000: 79.515 gemeldete Fälle) (ANONYM 2002a). Damit hat sich der rückläufige Trend der gemeldeten Erkrankungen seit 1992 (195.000 Salmonella-Darminfektionen) weiter fortgesetzt. Es ist allerdings davon auszugehen, dass trotz der Meldepflicht lediglich 10 bis 20% der tatsächlich vorkommenden Salmonellose-Erkrankungen erfasst werden (ANONYM 2000a). Grund dafür ist zum einen bei vielen Erkrankten ein relativ leichter, kurzzeitiger Krankheitsverlauf ohne Arztbesuch, zum anderen das Unterbleiben der bakteriologischen Diagnostik oder auch der Meldung an das Gesundheitsamt. Aufgrund seroepidemiologischer Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass ca. 40% der Bevölkerung in den letzten Jahren Kontakt mit Salmonellen hatten (ANONYM 1997b). Hierbei ist allerdings zu beachten, dass nicht jeder Salmonellenkontakt auch zu einer Erkrankung führt. Die Infektion mit Enteritis-Salmonellen stellt in Deutschland aber nach wie vor die häufigste erfasste Ursache von Durchfallerkrankungen dar. Das Auftreten von Salmonellosen über den Zeitraum

18

Hauptursache einer Salmonelleninfektion ist die Aufnahme von kontaminierten Lebensmitteln tierischen Ursprungs. Hierbei kommt rohem bzw. ungenügend erhitztem Fleisch sowie Eiern die hauptsächliche Bedeutung zu (RASCH u. SCHRADER 1998). KÄSBOHRER et al.

kamen 1997 zu dem Ergebnis, dass ca. 6% aller in Deutschland geschlachteten Schweine im Darmtrakt und im Lymphsystem mit Salmonellen behaftet sind. Der direkte Übertragungsweg von Mensch zu Mensch spielt nur eine geringe Rolle (Ausnahme: Kinder). Allerdings hat der Mensch als „Beschäftigter im Lebensmittelverkehr“ großen Einfluss auf die Kontamination von Lebensmitteln (ANONYM 1997b). Die Kontamination des Fleisches erfolgt meist erst im Schlachthof während der Schlachtung und Verarbeitung Salmonellen-infizierter Schweine.

Hierbei sind v.a. auch Kreuzkontaminationen von Bedeutung (ALTROCK et al. 1999, KÄSBOHRER 1998). BERENDS und SNIJDERS (1997) gehen davon aus, dass bei Tieren, bei denen Salmonellen im Kot nachgewiesen wurden, mit einer drei- bis vierfach höheren Wahrscheinlichkeit auch Salmonellen auf dem Schlachttierkörper zu finden sind. Die direkte Infektion des Menschen durch salmonellenausscheidende Tiere spielt ebenfalls kaum eine Rolle. Lediglich beim Kontakt mit Heimtieren kann sie von Bedeutung sein (ANONYM 2002b).

In der Todesursachenstatistik des Statistischen Bundesamtes wurden 1998 insgesamt 62 Salmonellosefälle als Todesursache ausgewiesen (ANONYM 2000a). 1997 waren 80 Salmonellose-Fälle als Todesursache verzeichnet (183 Fälle durch Darminfektionen anderer Ätiologie) (ANONYM 1999) und 1992 sogar 229 (ANONYM 1997b).

Der überwiegende Anteil der diagnostizierten Salmonellosen tritt sporadisch auf. Es wurden 1998 zwar 105 registrierte Salmonellose-Häufungen festgestellt, die Anzahl der betroffenen Patienten (1.695) entspricht aber nur einem Anteil von 2% aller registrierten Salmonellosefälle aus diesem Jahr (ANONYM 1999). Dennoch sind die Salmonellose- Ausbrüche nicht zu vernachlässigen. 2001 erkrankten über 500 Menschen nach dem Verzehr von Schokolade durch eine Infektion mit dem Serovar Oranienburg. Besonders zu beachten ist hierbei, dass unter den Betroffenen der Anteil der unter 10jährigen bei über 40% lag (ANONYM 2002c). HALD et al. beschrieben 1997 die Schwierigkeiten der Klärung von epidemiologischen Zusammenhängen bei einem Salmonelloseausbruch verursacht durch kontaminiertes Schweinefleisch in Dänemark. Ein gehäuftes Auftreten von

Einzelerkrankungen in einer bestimmten Region kann daher immer auf eine noch nicht erkannte Gruppenerkrankung hinweisen (ANONYM 2002b).

Von den bislang bekannten 2463 Serovaren treten nur ca. 50 Serovare mit einer bedeutenden Häufigkeit als human- oder tierpathogene Erreger auf. Diese 50 Serovare gehören alle zur Subspezies enterica (BUXTON u. FRASER 1977, MILLER et al. 1995).

UZZAU et al. (2000) untergliederten die Salmonellen-Serovare in drei Gruppen:

1. Wirts-begrenzte („host-restricted“) Serotypen, 2. Wirts-adaptierte („host-adapted“) Serotypen 3. Wirts-unbeschränkte („un-restricted“) Serotypen.

Die Serovare der ersten Gruppe (Wirts-begrenzt) kommen fast ausschließlich nur bei einer Wirtsspezies vor (z.B. die Serovare Typhi (Mensch), Paratyphi A und C (Mensch), Sendai (Mensch), Abortusequi (Pferd), Gallinarum (Geflügel), Typhisuis (Schwein) und Abortusovis (Schaf)). Sie verursachen bei ihren jeweiligen Wirten überwiegend systemische Erkrankungen. Symptome einer Enteritis sind hier nur schwach oder gar nicht erkennbar.

Nach einer oralen Aufnahme gelangen die Bakterien in den Magen und besiedeln schließlich den Dünndarm. Nach der Überwindung der Darmwand erfolgt die Ausbreitung der Erreger über das Lymph- und Blutsystem und die Besiedlung der Organe (v.a. Leber, Milz und Knochenmark) (FAROOQUI et al. 1991).

Die Serovare, die vornehmlich bei nur einer Wirtsspezies vorkommen, aber daneben auch bei anderen Lebewesen Krankheiten verursachen können, gehören zu der Gruppe der Wirts- adaptierten Serovare (z.B. S. Dublin (Rind, aber auch Mensch und Schaf), S. Choleraesuis (Schwein, aber auch Mensch)). Bei diesen Serotypen treten beide klinischen Verlaufsformen (Enteritis und systemische Erkrankung) in Erscheinung, wobei eine ausgeprägte systemische Salmonellose häufiger bei Jungtieren zu beobachten ist (UZZAU et al. 2000, ROOF et al.

1992).

Ubiquitär vorkommende Serovare (z.B. S. Typhimurium, S. Enteritidis) treten bei einer Reihe

20

Diese ubiquitär vorkommenden Serovare verursachen nur selten systemische Krankheitsbilder und werden aufgrund der lokalen Begrenzung des Krankheitsgeschehens auf den Darm auch als Enteritis-Salmonellen bezeichnet (ALTROCK et al. 1999).

Ob eine Salmonellose eintritt, oder ob nur eine latente Salmonelleninfektion vorherrscht, hängt zum einen von der Empfänglichkeit des Wirtes ab, zum anderen spielen die Virulenz der Salmonellen und die Infektionsdosis eine entscheidende Rolle. Die Virulenz wird insbesondere durch folgende Eigenschaften der Bakterien bestimmt:

Adhäsivität, Invasivität, fakultativ intrazellulärer Parasitismus und Toxinbildung (Endo-, Cyto- und Enterotoxine) (ROLLE u. MAYR 2002).

2.1.6 Pathogenese

Nach oraler Aufnahme der Salmonellen gelangen diese zunächst in den Magen. Das saure Milieu stellt die erste Barriere für die Mikroorganismen dar. Die Überwindung dieser Barriere ist abhängig von der Infektionsdosis. Werden salmonellenkontaminierte Lebensmittel verzehrt, die entweder den Magen sehr schnell passieren (Flüssigkeiten) oder den Magen-pH neutralisieren (Milch, Käse), ist eine geringere Salmonellen-Anzahl zur Überwindung der Magen-Barriere erforderlich (DARWIN u. MILLER 1999). Personen mit einem hohen Magen-pH (insbesondere alte Menschen), sowie Patienten mit Achlorhydrie (Magensaftmangel), Gastrektomie oder Gastenterotomie sind besonders gefährdet (LOOS u.

WASSENAAR 1994).

Im Dünndarm kommt es zum Kontakt der Salmonellen mit nicht-phagocytierenden Epithel- und/oder M-Zellen der Darmwand. Hierbei spielen die Fimbrien der Salmonellen als Adhäsine eine besondere Rolle. Um in die genannten Zellen eindringen zu können (Invasion), injizieren Salmonellen mithilfe des Typ-III-Sekretionssystems Effektorproteine in die Wirtszelle. Die Gene für das Sekretionssystem und für die meisten Effektorproteine befinden sich auf der chromosomalen Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (salmonella pathogenicitiy island 1) (HACKER u. HEESEMANN 2000, RAKEMAN u. MILLER 1999). Einige dieser Gene dienen auch dem Salmonellennachweis mittels PCR-Analysen. Die Effektorproteine beeinflussen die Wirtszelle dahingehend, dass das Cytoskelett umgeordnet wird und sich die Zellmembran kräuselt (membrane ruffling), sodass nun das Bakterium in die Zelle eindringen

kann (SUKHAN 2000). Außerdem werden Cytokine produziert, die zu einem Entzündungsprozess führen (KAISER et al. 2000). Die Virulenzfaktoren, die es der Salmonelle ermöglichen, in einer Wirtszelle zu überleben und sich zu vermehren, werden von der Salmonella- Pathogenitätsinsel 2 codiert (HACKER u. HEESEMANN 2000).

Von den Epithel- und M-Zellen aus gelangen die Salmonellen in die Lamina propria des Darmes. Dort werden einige Salmonellen von den Gewebs-Makrophagen aufgenommen, in denen sie persistieren können, oder die Makrophagen werden zerstört. Ein weiterer Teil der Salmonellen in der Lamina propria gelangt über die Peyer-Plaques (Folliculi lymphatici aggregati) mit der Lymphe in den Blutkreislauf und besiedelt verschiedene Organe (BOISE u.

COLLINS 2001, WENDT 2001).

Die entzündliche Reaktion mit Infiltration von neutrophilen Granulozyten in die Lamina propria des Darms und die Synthese von Prostaglandin führen zu einer Malabsorption von Flüssigkeit und Elektrolyten, in deren Folge Durchfall auftritt (FEDORKA-CRAY 1997, DARWIN u. MILLER 1999, WENDT 2001).

Daneben wird der Einfluss von Enterotoxinen und Cytotoxinen als Auslöser einer Diarrhoe beschrieben (LOOS u. WASSENAAR 1994, FEDORKA-CRAY 1997, DARWIN u.

MILLER 1999, ROLLE u. MAYR 2002).

2.1.7 Klinische Salmonellose des Menschen

Anhand von experimentellen Studien wurde lange Zeit angenommen, dass die minimale infektiöse Dosis beim Menschen 10⁵ bis 10⁷ Salmonellen beträgt. Bei der epidemiologischen Untersuchung von Salmonellose-Ausbrüchen stellte sich aber heraus, dass infektiöse Dosen von 10¹ bis 10¹¹ (im Mittel 10²) Auslöser der Erkrankungen waren. Insbesondere bei dem Verzehr von Käse (kontaminiert mit S. Heidelberg) und Schokolade (kontaminiert mit S.

Eastbourne) reichten 10 Salmonellen aus, um eine Salmonellose zu verursachen (ANONYM 2000b). Die infektiöse Dosis ist außer von der Virulenz der Bakterien und der Art des kontaminierten Lebensmittels auch vom Alter und der Immunlage der betroffenen Personen abhängig.

Nach einer Inkubationszeit von 5 bis 72 h beginnt eine Salmonellose meist plötzlich mit

22

Stunden bis Tage. Bei ca. 5% der Infizierten verläuft eine Salmonellose zusätzlich systemisch.

Hierbei treten Schüttelfrost, höheres Fieber und Kollaps als Symptome auf. Bei vorgeschädigten Patienten können auch eine Perikarditis, neurologische Erkrankungen, reaktive Arthritis, Spondylitis oder Osteomyelitis die Folgen einer Salmonellose sein. Etwa 2% der systemischen Salmonellosen verlaufen tödlich (BAIRD-PARKER 1994).

Nach dem Infektionsschutzgesetz besteht für Salmonellose eine Meldepflicht (ANONYM 2002b).

2.1.8 Prophylaxe

Zur Vermeidung von Salmonellosen stellt die Einhaltung der hygienischen Normen in privaten Haushalten das bedeutendste Mittel dar (ANONYM 1999). Daneben ist es zur Bekämpfung der Salmonellen besonders wichtig, die Zirkulation der human-pathogenen Serovare in den für die Lebensmittelproduktion wichtigen Tierbeständen zu unterbinden (ANONYM 1997b).

Um den Verbraucher vor einer Salmonellose zu schützen, bedarf es daher einerseits der Aufklärung der Bevölkerung zum Verhalten beim Umgang mit Lebensmitteln, die mit einem erhöhten Risiko einer Salmonellenkontamination behaftet sind. Darüber hinaus ist es das Ziel, eine Reduzierung/Verhinderung von Salmonellosen zu erreichen, den Salmonelleninfektionsdruck zu senken, und langfristig „salmonellenfreie“ Tierbestände zu schaffen (ROLLE u. MAYR 2002). Außerdem sind Kontrollmechanismen auf jeder Stufe des Lebensmittelherstellungsprozesses durch die Einführung von HACCP-Systemen nötig (BLACKBURN 1993, BYRNE 1996).

Mit den Maßnahmen zur Salmonellenbekämpfung in Deutschland befassen sich verschiedene Rechtsvorschriften (Rinder-Salmonellose-Verordnung, Hühner-Salmonellen-Verordnung, verschiedene Bestimmungen des Futtermittel- und Lebensmittelrechtes). Darüber hinaus sind im Rahmen der betrieblichen Eigenkontrolle (Produkthaftung) verschiedene Salmonellenmonitoringprogramme und HACCP-Konzepte etabliert worden.

Für das Q+S System in der Landwirtschaft wird derzeit in Deutschland ein Salmonellen- Überwachungsprogramm nach dänischem Vorbild favorisiert. Hierbei wird der Salmonellen- Antikörper-Status der Schweinebestände ermittelt. Dies geschieht durch einen ELISA- Nachweis in Fleischsaft oder Blut. Anschließend erfolgt eine Eingruppierung eines getesteten

Bestandes in eine von drei Kategorien (entsprechend dem Anteil Salmonellen-Antikörper- positiv-getesteter Tiere), und die daraus resultierende Einleitung von Schutzmaßnahmen oder Sanktionen (BLAHA et al. 1998).

2.2 Nachweisverfahren von Salmonellen in Lebensmitteln

Bei den Untersuchungsmethoden, die derzeit zum Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln zur Verfügung stehen, handelt es sich um kulturelle, immunologische oder molekularbiologische Nachweisverfahren. Oftmals werden diese Verfahrenstechniken auch kombiniert, um sichere und schnelle Testergebnisse zu erzielen. So ist es bei den meisten immunologischen und molekularbiologischen Methoden erforderlich, mithilfe einer Voranreicherung die Salmonellen zu vermehren, um detektierbare Bakterienkonzentrationen zu erreichen (MOLLA 1997).

Einige Salmonellen-Nachweisverfahren wurden in die Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG aufgenommen. Hierbei handelt es sich um ein kulturelles Nachweisverfahren von Salmonellen (L 00.00-20), einen Fluoreszenzimmunoassay (L 00.00-66), ein Impedanz-Verfahren (L 00.00-67) und eine PCR- Methode (L 00.00-52). Die in der amtlichen Sammlung aufgeführten Methoden stellen standardisierte Nachweisverfahren dar, deren Anwendung keiner besonderen Begründung bedürfen (ANONYM 2000c). Außerdem wird die Anwendung dieser Verfahren durch Rechtsvorschriften vorgeschrieben (z.B. Eiprodukte-Verordnung).

Sind keine § 35-Untersuchungsmethoden rechtlich vorgeschrieben, oder handelt es sich z.B.

um Untersuchungen im Rahmen der gewerblichen Eigenkontrolle, können auch andere Salmonellennachweisverfahren angewendet werden. Es ist aber auf die Zuverlässigkeit der einzusetzenden Methoden zu achten.

2.2.1 Kulturelle Untersuchungsverfahren 2.2.1.1 Standard-Kulturverfahren

24 1. nicht-selektive Voranreicherung

2. selektive Anreicherung

3. Isolierung auf festen Selektivnährböden 4. Subkultivierung verdächtiger Kolonien

5. biochemische und serologische Bestätigung salmonellen-verdächtiger Kolonien

Die Durchführung der nicht-selektiven Voranreicherung ermöglicht zum einen die Rehydratisierung und Revitalisierung subletal geschädigter Bakterien, zum anderen dient sie der Vermehrung der Salmonellen, die im Lebensmittel selbst häufig nur in geringen Konzentrationen vorliegen (FRICKER 1987).

Eine subletale Schädigung der Salmonellen kann durch den Einfluss von Stressfaktoren erfolgen, wie z.B. Hitze, Kälte, Trockenheit, hoher osmotischer Druck, Änderungen des pH- Wertes oder durch Konservierungsstoffe. Eine höhere Anfälligkeit der Bakterien gegen Umwelteinflüsse und eine verminderte Vermehrungsfähigkeit sind die Folge (ANONYM 1980, BAILEY u. COX 1996).

Auch nicht-geschädigte Salmonellen können bei Kontakt mit Selektivanreicherungsmedien in geringen Mengen absterben (VASSILIADIS et al. 1974). Um diese Hürde zu überwinden, ist es erforderlich, die Salmonellen der Lebensmittelprobe zuvor auf eine bestimmte Anzahl zu vermehren. D´AOUST et al. (1992a) zeigten, dass eine direkte Selektivanreicherung einer Lebensmittelprobe zu einem erhöhten Anteil falsch-negativer Untersuchungsergebnisse führte.

Ursprünglich wurde hauptsächlich Laktose-Bouillon als Voranreicherungsmedium verwendet, inzwischen hat sich jedoch gepuffertes Peptonwasser bei den meisten Lebensmitteluntersuchungen durchgesetzt (BAILEY u. COX 1996). Bei der Untersuchung von Magermilchpulver erfolgt die Voranreicherung häufig mit Brillantgrünwasser (BAUMGART 1997). Zur Unterdrückung von hemmenden Einflüssen auf das Salmonellenwachstum (z.B. durch hohe Kontamination mit Begleitkeimen oder durch hemmende Substanzen im Lebensmittel) wurde der Zusatz von Selektivagenzien beschrieben (VAN SCHOTHORST u. RENAUD 1985). Bei solchen Selektivagenzien handelt es sich beispielsweise um Malachitgrün (Hemmung der grampositiven Begleitflora) oder um Casein (Hemmung von bakteriziden Substanzen in Kakaoprodukten, verwendet wird fettarme H-

Milch als Voranreicherungsmedium) (DE SMEDT u. BOLDERDIJK 1990, BAUMGART 1997). Üblich ist eine Voranreicherung im Verhältnis 1:10 (Masse [Probe] zu Volumen [Voranreicherungsmedium]) und eine Bebrütung bei 37 °C über 18 bis 24 Stunden (BAUMGART 1997, VAN SCHOTHORST u. RENAUD 1985, MOLLA 1997). Eine Verkürzung der Voranreicherungszeit (6h) resultierte häufig in einer Zunahme falsch- negativer Untersuchungsergebnisse (D´AOUST u. MAISHMENT 1979, D´AOUST 1981).

Nach 18 bis 24 h Voranreicherung beträgt die Konzentration der Salmonellen (und auch die Konzentration anderer Enterobacteriaceen!) durchschnittlich 10⁸ Keime pro ml, unabhängig von der Ausgangskeimzahl (MULINDWA u. PIETZSCH 1979).

Bei der selektiven Anreicherung werden die Umweltbedingungen derart modifiziert, dass die unerwünschten Begleitkeime in ihrem Wachstum behindert werden, und die Salmonellen auf diese Weise einen Selektionsvorteil erhalten (Wachstumsförderung) (HAHN et al. 1994).

Ein solches Anreicherungsmedium erfüllt zum einen lediglich die minimalen Bedürfnisse der anzureichernden Bakterien, zum anderen können selektive Substanzen zugegeben werden, die hemmend auf Begleitkeime wirken, auf die nachzuweisenden Bakterien aber keinen oder nur einen geringen Einfluss haben (z.B. durch Resistenz/Toleranz) (SCHLEGEL 1985).

Bei der selektiven Anreicherung von Salmonellen sind folgende Medien von Bedeutung (STEINHOF 1995):

1. Tetrathionat-Anreicherung 2. Selenit-Cystin-Anreicherung 3. Rappaport-Anreicherung

Die selektive Eigenschaft der Tetrathionat-Anreicherung begründet sich auf dem toxischen Effekt von Tetrathionat (BAIRD et al. 1987a). Aufgrund der Fähigkeit, Tetrathionat reduzieren zu können, werden z.B. Salmonellen nicht am Wachstum behindert.

Gegebenenfalls kann dieser Anreicherung Brillantgrün und Rindergalle zugesetzt werden, um grampositive Keime am Wachstum zu hindern. Eine Bebrütungstemperatur von 43 °C hat ebenfalls selektierende Wirkung (D´AOUST et al. 1992a). Für die Anreicherung werden i.d.R. 10 ml der inkubierten Voranreicherungsflüssigkeit zu 100 ml Tetrathionat-Medium

26

Die Selektivität der Selenit-Cystin-Anreicherung beruht auf der toxischen Wirkung des Natriumselenits (ROSE et al. 1971). Auch hier werden 10 ml Voranreicherungsflüssigkeit zu 100 ml Medium pipettiert. Die Bebrütung erfolgt bei 37 °C (BAIRD et al. 1987b).

Die Rappaport-Anreicherung (Modifikation: Rappaport-Vassiliadis-(RV)-Anreicherung) enthält Magnesiumchlorid und Malachitgrün. Die selektierenden Eigenschaften resultieren aus dem hohen osmotischen Druck der Lösung (aufgrund der Magnesiumchlorid- Konzentration), einem geringen pH-Wert, einer hohen Inkubationstemperatur (42-43 °C), dem geringen Nährstoffangebot und der toxischen Eigenschaft von Malachitgrün, gegen die Salmonellen resistent sind (STEINHOF 1995).

Abweichend zu den zuvor beschriebenen Anreicherungen wird bei der RV-Anreicherung eine 1:100 Verdünnung verwendet, indem 0,1 ml Voranreicherungsflüssigkeit zu 10 ml RV- Medium gegeben werden.

Die Inkubationszeiten der Selektivanreicherungen betragen 24 h bis 48 h. Eine verkürzte Selektivanreicherung führte bei D´AOUST et al. (1992b) dazu, dass nicht alle Salmonella- positiven Proben erkannt wurden.

Feste Selektivnährböden enthalten zum einen Selektivzusätze zur Unterdrückung der Begleitflora, zum anderen ermöglichen biochemische Indikatoren die Differenzierung zwischen Salmonella-verdächtigen Kolonien und Nicht-Salmonella-Kolonien (MOATS 1981). Es stehen unter anderem folgende Selektivnährböden zur Verfügung (STEINHOF 1995):

Differenzierung aufgrund der Fähigkeit, Laktose zu spalten:

- Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar (modifiziert nach Edel und Kampelmacher),

- Salmonella-Shigella-Agar

- Desoxycholat-Citrat-Laktose-Saccharose Agar,

- Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Agar nach Gassner, - Lackmus-Laktose-Agar nach Drigalski und Conradi - Fuchsin-Laktose-Agar nach Endo

- Eosin-Methylenblau-Laktose-Agar nach Levine - MacConkey-Agar

- Hektoen-Agar

Differenzierung aufgrund der Ausfällung schwarzer Sulfitverbindungen:

- Wismut-Sulfit-Agar nach Wilson-Blair - Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar - Hektoenagar

Differenzierung aufgrund der Fähigkeit, Propylenglykol zu fermentieren:

- Rambach-Agar

Die Inkubation des mit Selektivanreicherungsbouillon beimpften festen Selektivnährbodens erfolgt bei 37 °C über 24 h. Bei Verdacht auf sehr langsam wachsende Serovare ist die Inkubation um weitere 24 h zu verlängern (BISPING u. AMTSBERG 1988).

Zur Bestätigung Salmonellen-verdächtiger Kolonien werden sowohl die biochemischen als auch die serologischen Eigenschaften der Kolonien untersucht. Es sind verschiedene biochemische Testkits kommerziell erhältlich (FUNG u. COX 1981). Bis zum Vorliegen der biochemischen Befunde vergehen 24-48 h (BLACKBURN 1993).

Die serologische Identifizierung erfolgt in Form eines Agglutinationstests mit poly- und monovalenten Antiseren (MOLLA 1997).

Mit der konventionellen Kulturmethode wird ein Untersuchungszeitraum von 3 bis 4 Tagen benötigt, um zu einem negativen Untersuchungsergebnis zu gelangen. Bei einem positiven Untersuchungsergebnis beträgt der Untersuchungszeitraum 5 bis 6 (7) Tage (BANDEKAR et al. 1995, QUINN et al. 1995, BAUMGART 1997).

2.2.1.2 Kulturelle Schnellmethoden

Neben der konventionellen Kulturmethode stehen verschiedene kulturelle Schnellmethoden zur Verfügung:

Eine Verkürzung der Selektivanreicherung ist mithilfe der Hydrophobic grid membrane filtration (HGMF) möglich (ENTIS et al. 1982). Nach einer konventionellen Voranreicherung folgt eine 6 h-Selektivanreicherung. Anschließend wird das Selektivmedium mit der Membran gefiltert. Auf diese Weise findet eine Konzentration der Bakterien statt. Die

28

Auch mittels magnetisierbarer Antikörper-beschichteter Kügelchen (Dynabeads^®) ist eine Konzentrierung möglich. Nachdem die Kügelchen zu einem Anreicherungsmedium gegeben wurden, heften sich die darin enthaltenen Salmonellen über Antigen-Antikörper-Bindungen an die Kügelchen. Durch ein magnetisches Feld werden danach die Kügelchen separiert, und die restlichen Bestandteile des Anreicherungsmediums (inkl. Begleitflora und Hemmstoffe) können beseitigt werden. Die mit Salmonellen behafteten Kügelchen können entweder direkt auf Selektivagar überführt werden, oder sie werden zunächst in ein Selektivanreicherungsmedium verbracht und inkubiert (OLSVIK et al. 1994a und 1994b, MANSFIELD u. FORSYTHE 1993). Daneben können auch ELISA- und molekularbiologische Verfahren an dieses immunomagnetische Separationsverfahren angeschlossen werden.

Ein weiterer kommerziell erhältlicher Schnelltest ist das Salmosyst^®-Kit von Merck. Hierbei handelt es sich um eine Zwei-Stufen-Anreicherung (BLACKBURN 1993). Die zu untersuchende Probe wird zunächst in einem nicht-selektiven Medium inkubiert (6-8 h, 37

°C), anschließend werden selektive Agenzien (Salmosyst^®-Supplement-Tablette) zugegeben.

Während sich die Tablette auflöst (30 min), können sich die Salmonellen allmählich an die veränderten Umweltbedingungen anpassen. Nach der Inkubation (18-22 h, 37 °C) folgt die Differenzierung auf festen Selektivplatten und schließlich die serologische und biochemische Bestätigung (FIERENS u. HUYGHEBAERT 1996).

Bei dem MSRV-Medium (Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis Medium) handelt es sich um eine Modifikation des RV-Mediums. Die selektive Wirkung geht hier neben dem Malachitgrün, dem Magnesiumchlorid und der Inkubationstemperatur von 42 °C zusätzlich von dem Zusatz Novobiocin aus. Aufgrund des Zusatzes von Agar handelt es sich um ein halbfestes Medium (DE SMEDT et al. 1986). Auf das MRSV-Medium wird entweder direkt aus der Voranreicherungsflüssigkeit oder nach der Selektivanreicherung (8h) ein Tropfen Flüssigkeit aufgetropft und anschließend 24 h bei 42 °C inkubiert. Aufgrund der Motilität der Salmonellen (außer Serovar Gallinarum) schwärmen diese ringförmig über das MRSV- Medium, und es bildet sich eine opake Schwärmzone (BAUMGART 1997). Andere motile Bakterien werden aufgrund der Selektivität des Mediums am Wachstum gehindert (FIERENS u. HUYGHEBAERT 1996). Nach der Inkubation folgt die serologische und biochemische Bestätigung der gewachsenen Bakterien.

Auf der Grundlage der Motilität von Salmonellen basiert auch das Funktionsprinzip des Oxoid Salmonella Rapid Test (OSRT) (HOLBROOK et al. 1989). Bei diesem Test wandern die Salmonellen in Reaktionsgefäße, die mit Selektiv- und Differentialmedien bestückt sind.

Aufgrund der biochemischen Eigenschaften der Salmonellen sind auf den Differentialmedien charakteristische Farbumschläge zu erkennen.

Bei dem Salmonella 1-2 Test^TM wird ebenfalls die Bewegungsfähigkeit der Salmonellen ausgenutzt. Allerdings werden die Salmonellen hier durch spezifische Antikörper immobilisiert, sodass aufgrund einer Agglutination erkennbare Bakterienbanden an der entsprechenden Stelle auf dem Medium sichtbar werden (FLOWERS u. KLATT 1989).

Die Reaktion spezifischer Antikörper mit Salmonellen wird auch bei den Latexagglutinationstests verwendet. Die Antikörper sind hierbei an Latex-Körnchen gebunden und ermöglichen so die Erkennung Salmonellen-positiver Proben nach verschiedenen Anreicherungsschritten (BLACKBURN 1993). Kommerzielle Testkits, die nach diesem Verfahren arbeiten, sind z.B. der Microscreen^®-Test, der ANI^TM-Test, das Spectate^®-Testverfahren, sowie der Serobact Salmonella-Test und der Bactigen^® Salmonella- Shigella-Test (BLACKBURN 1993, MOLLA 1997, BAUMGART 1997).

Die biochemischen Eigenschaften der Salmonellen können außer zur Identifizierung verdächtiger Kolonien auf Indikatorplatten auch zum physikalischen Schnellnachweis von Salmonellen eingesetzt werden.

Aufgrund spezifischer Stoffwechselleistungen entstehen Produkte, die zu einer Änderung der elektro-physikalischen Eigenschaften des Mediums führen. Messbar werden diese Veränderungen durch Impedanzmessungen. Die Reduktion von Trimetylamin-N-oxid (TMNO) zu Trimethylamin (TMA) erhöht beispielsweise die Leitfähigkeit eines mit Salmonellen beimpften Mediums (EASTER u. GIBSON 1985). Weitere biochemische Eigenschaften, die für dieses Verfahren genutzt werden, sind z.B. die Fähigkeit der Salmonellen zur Decarboxylierung von Ornithin und Lysin (BLACKBURN 1993).

Die Messung erfolgt z.B. mit dem Malthus Radiometer, dem Bactometer^®, dem RABIT- oder dem BacTrac-System (BLACKBURN 1993, MOLLA 1997). Bei diesen Verfahren können

30

hervorgerufen werden, deren biochemische Eigenschaften zum Teil ähnlich denen der Salmonellen sind (GIBSON 1987).

Mithilfe dieser mikrobiologischen Schnellmethoden liegen Untersuchungsergebnisse bereits nach 42 bis 78h vor. Hierbei ist allerdings zu beachten, dass es sich bei den Untersuchungsergebnissen nicht um biochemisch und serologisch bestätigte Ergebnisse handelt. Es wird daher von vielen Herstellern empfohlen, ein positives Untersuchungsergebnis weitergehend abzusichern (MOLLA 1997).

2.2.2 Immunologische Nachweisverfahren

Das Funktionsprinzip der immunologischen Nachweisverfahren beruht auf der spezifischen Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Das nachzuweisende Antigen (z.B.

Salmonellen) wird zunächst über entsprechende Antikörper an einen festen Träger (z.B.

Polystyrolkunststoffplatten) gebunden (immobilisiert), anschließend wird dieser Antigen- Antikörperkomplex durch einen markierten Antikörper, der an das immobilisierte Antigen bindet, sichtbar gemacht. Als Markierung dienen radioaktive Isotope (Radioimmuntest), fluoreszierende Farbstoffe (Immunfluoreszenztest) oder Enzyme (ELISA) (HAHN et al. 1994, ROLLE u. MAYR 2002). Der markierte Antikörper kann entweder direkt an das nachzuweisende Antigen binden (direktes Nachweisverfahren), oder zwischen dem markierten Antikörper und dem nachzuweisenden Antigen befindet sich ein weiterer Antikörper (indirektes Nachweisverfahren).

Radioimmuntests sind zwar für den Nachweis von Salmonellen einsetzbar, aufgrund der strengen Auflagen für die Handhabung radioaktiver Isotope werden diese Verfahren heute allerdings kaum noch angewendet (IBRAHIM et al. 1986).

Bereits 1957 nutzten THOMASON et al. einen Immunfluoreszenztest zum Nachweis von Salmonella Typhi, indem sie Fluorescein-markierte Antikörper gegen die O-, Vi- und H- Antigene dieser Bakterien verwendeten. Der Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln gelang mit verschiedenen polyvalenten Antiseren gegen O- und/oder H-Antigene sowohl mit direkten, als auch mit indirekten Verfahren. Insbesondere der kombinierte Nachweis verschiedener Antigene führte zu einer gesteigerten Spezifität (GEORGALA u.

BOOTHROYD 1964, HAGLUND et al. 1964, SILLIKER et al. 1966, INSALATA et al.

1967). Vor der Durchführung des eigentlichen Immunfluoreszenztestes ist es erforderlich, die

nachzuweisenden Bakterien mithilfe verschiedener Anreicherungen zu kultivieren (INSALATA et al. 1972). Der Nachweis der Salmonellen erfolgt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Aufgrund der vergleichsweise hohen Anzahl falsch-positiver Untersuchungsergebnisse und des hohen Laboraufwandes hat sich der Immunfluoreszenznachweis zum Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln nicht durchgesetzt (THOMASON 1981).

Bei einem ELISA (enzyme-linked immuno-sorbant assay) handelt es sich um ein immunologisches Nachweisverfahren, bei dem die Bindung des mit einem Enzym markierten Antikörpers (=Konjugat) an das Antigen erst nach Zugabe eines Substrates sichtbar wird, da das Enzym das Substrat (farblos) zu einem farbigen Abbauprodukt umbaut. Bei den Enzymen handelt es sich i.d.R. um Peroxidase oder alkalische Phosphatase (HAHN et al. 1994, ROLLE u. MAYR 2002).

KRYSINSKI und HEIMSCH (1977) fixierten Salmonellen auf einem Cellulose-Acetat-Filter und inkubierten anschließend mit Antikörpern vom Kaninchen, die gegen Geißelantigene von Salmonella Typhimurium gerichtet waren. Der Filter wurde danach mit Konjugat-Lösung bedeckt (Antikörper einer Ziege, gerichtet gegen Kaninchen-Antigen, das mit Peroxidase gekoppelt war) und anschließend gewaschen. Nach der Zugabe des Substrates färbte sich die Filtermembran an. Ein ähnliches Verfahren verwendeten TAPCHAISRI et al. (1999). Bei dem von ihnen durchgeführten Dot-ELISA fixierten sie einzelne Tropfen einer Bakterienanreicherung auf einer Nitrocellulosemembran. Salmonellen-positive Proben wurden unter Zuhilfenahme eines monoklonalen Antikörpers (102B2) und eines Konjugates angefärbt.

Im Gegensatz zu diesen indirekten ELISA-Verfahren handelt es sich bei den meisten kommerziell erhältlichen ELISA-Kits um direkte „sandwich“ ELISA. Bei einem „sandwich“

ELISA ist das Antigen „eingebettet“ zwischen zwei Antikörpern: zum einen der Antikörper, der auf einer festen Matrix verankert ist und das Antigen immobilisiert, zum anderen das Konjugat (Antikörper mit Enzym), das direkt an das immobilisierte Antigen bindet.

KRYSINSKI und HEIMSCH (1977) verwendeten bei ihren Versuchen polyvalente Antikörper. Dabei handelt es sich um viele verschiedene Antikörper, die an das jeweilige

32

Untersuchungsergebnisse auftreten (JANEWAY u. TRAVERS 1995). Um die Spezifität des ELISA zu erhöhen verwendeten MINNICH et al. (1982) aufgereinigtes (von IgM befreites) Immunglobulin G (IgG). Weitere unspezifische Kreuzreaktionen konnten durch die Verwendung monoklonaler Antikörper vermieden werden (SMITH u. JOHNES 1983, ROBINSON et al. 1983). Bei diesen Antikörpern handelte es sich z.B. um IgA- Mausmyelomproteine (MOPC 467), die mit einem Antigen der Salmonellengeißel reagieren.

Ausschließlich mit diesen spezifischen Antikörpern war es aber nicht möglich, alle Salmonellenserovare nachzuweisen. Bei vielen kommerziellen ELISA-Kits werden deshalb verschiedene Antikörper kombiniert, oder aber es werden polyklonale Antikörper verwendet, bei denen allerdings auch Kreuzreaktionen mit Begleitkeimen vorkommen können (ANDERSON u. HARTMAN 1985).

Bei dem Salmonella BioEnzabead^TM ELISA wurden zunächst nur MOPC 467-Antikörper zur Immobilisation der Salmonellen verwendet. Angeheftet an magnetische Kügelchen (beads) wurden Salmonellen aus Proben nachgewiesen, nachdem zunächst eine Voranreicherung (24h), eine Selektivanreicherung (24h) und eine Anreicherung mit M-broth (6h) durchgeführt wurde (FLOWERS et al. 1992). Um die Spezifität des ELISA zu erhöhen, wurden später zusätzlich die monoklonalen Antikörper IgG2b des Hybridomes 6H4 eingesetzt, die mit einem Nicht-Geißel-Antigen reagieren (MATTINGLY 1984).

Die gleichen Antikörper (MOPC 467 und 6H4) werden auch bei dem Salmonella-Tek^TM- ELISA eingesetzt (BLACKBURN 1993). Der Unterschied zu dem Salmonella BioEnzabead^TM ELISA besteht in der Verwendung einer Mikrotiterplatte anstelle der magnetischen Kügelchen. Die Vorbehandlung des Probenmaterials (Voranreicherung, Selektivanreicherung, Anreicherung mit M-broth) entspricht dem zuvor genannten ELISA- Verfahren. Die Farbreaktion kann bei beiden ELISA-Systemen makroskopisch oder mithilfe eines Photometers beurteilt werden.

Für den BacTrace^TM ELISA werden polyklonale Antikörper (CSA-1) verwendet, die gegen Oberflächenantigene von Salmonellen gerichtet sind. Die Reaktionen finden in einer Mikrotiterplatte statt. Vor der Durchführung des ELISA ist eine Voranreicherung und eine Selektivanreicherung erforderlich, um die Anzahl falsch-negativer Untersuchungsergebnisse zu minimieren (BLACKBURN u. STANNARD 1989).

Eine Kombination aus polyklonalen Antikörpern gegen Oberflächenantigene zum einen und Geißelantigene zum anderen wird bei dem Assurance^® Salmonella Enzyme Immunoassay Testkit verwendet (MOLLA 1997). Außerdem wird hier ein weiterer Antikörper eingesetzt, der zwischen Antigen und Konjugat lokalisiert ist (=indirekter ELISA) (BLACKBURN 1993).

Lediglich eine Voranreicherung und eine Anreicherung mit M-broth ist für die Durchführung des TECRA^TM Salmonella Visual Immunoassay Testkit erforderlich.

Bei der Weiterentwicklung dieses Systems wurde ein Dipstick verwendet, der mit den immobilisierenden Antikörpern beschichtet ist (TECRA^® unique^TM Salmonella ELISA).

Die Anreicherung mit M-Broth ist in diesem ELISA-Kit integriert worden. Ein positiver Salmonellennachweis wird in Form eines angefärbten Dipsticks sichtbar.

Ein weiteres Beispiel für einen Dipstick-basierten ELISA ist das LUMAC^® PATH-STIK Testsystem. Bei diesem Testkit befindet sich eine Antikörper-Bande auf einer Membran. Die zu untersuchende Probe wird nach je einem Vor- und Selektivanreicherungsschritt direkt auf die Membran gegeben. Ein positives Testergebnis liegt vor, wenn 2 farbige Banden (eine Bande als Kontrolle) zu erkennen sind (VAN BEURDEN u. MACKINTOSH 1994).

Um ein vollständig automatisiertes ELISA-Verfahren handelt es sich bei dem VIDAS SLM^TM System. Die Bakterien einer zu untersuchenden Probe werden zunächst mit einer Selektivanreicherung und danach mit einer M-broth-Anreicherung kultiviert. In die M-broth- Anreicherung taucht ein Röhrchen ein, das auf der Innenseite mit monoklonalen Antikörpern beschichtet ist. Automatisch wird das Röhrchen mit Anreicherungsflüssigkeit durchgespült, und die enthaltenen Salmonellen binden an die Antikörper. Anschließend wird das Röhrchen nacheinander mit Waschlösung, Konjugat, Waschlösung und Substrat gespült. Danach wird die Farbreaktion im Röhrchen mit einem Photometer ausgemessen (D´AOUST 2001).

Der Zeitraum vom Beginn der Untersuchung bis zum Vorliegen des Untersuchungsergebnisses beträgt für die ELISA-Verfahren zwischen 1 und 3 Tagen, abhängig von der Anzahl und Dauer der erforderlichen Anreicherungsschritte. Auch für diese Schnellmethoden wird die kulturelle Absicherung eines positiven Testergebnisses empfohlen.

34 2.2.3 Molekularbiologische Nachweisverfahren

Für den molekularbiologischen Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln stehen prinzipiell zwei Verfahren zur Verfügung:

- Gensonden

- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mithilfe spezifischer, markierter Gen-Sonden kann die Salmonellen-DNA durch eine Hybridisierungsreaktion sichtbar gemacht werden. Bei einigen Untersuchungsverfahren muss die Salmonellen-DNA vor der Hybridisierung aus dem Mikroorganismus isoliert (extrahiert) werden, bei anderen Techniken ist es möglich, die Hybridisierung in situ (in der Zelle) durchzuführen.

Eine andere Technik wird mit der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Hierbei werden Salmonellen-spezifische DNA-Abschnitte zunächst vervielfältigt (amplifiziert), danach ist eine Identifizierung anhand der Amplifikatgröße oder durch Hybridisierungstechniken möglich (TAPCHAISRI et al. 1999, MÜLHARDT 2000).

Salmonellennachweis mit Gen-Sonden

Bei Gen-Sonden handelt es sich um einzelsträngige DNA-Fragmente oder Oligonukleotide, die mit Markern bestückt sind. Diese Sonden passen komplementär zu der Ziel-DNA /-RNA, mit der die Hybridisierung erfolgt (SNAIDR u. BEIMFOHR 2001). Als Marker dienen z.B.

Radioisotope (³²P), Farbstoffe (Fluorescein) oder Enzyme. Kommerziell verfügbar ist z.B. das Gene-Trak^® Hybridisierungsverfahren. Nach einer Anreicherung von 24 bis 48 Stunden wird aus dem zu untersuchenden Probenmaterial die DNA extrahiert und denaturiert, sodass die Erbsubstanz der Zellen in Einzelsträngen vorliegt (BYRNE 1996). Anschließend erfolgt die Hybridisierungsreaktion, und danach werden die ungebundenen DNA-Sonden entfernt.

Ursprünglich wurde bei der Gene-Trak^®-Methode eine Radioisotopenmarkierung mit ³²P verwendet. Die Auswertung erfolgte hier mit einem Radioaktivitätsmesser (MOLLA 1997).

Um die Gesundheitsgefährdung für den Anwender zu senken, wurde die Markierung mit einem Enzym vorgezogen, sodass eine positive Probe nach Zugabe eines Substrates durch eine Farbreaktion sichtbar wird (CURIALE u. KLATT 1990).

BANDEKAR et al. beschrieben 1995 eine Salmonellennachweismethode, bei der die ³²P- markierte Sonde IS-200 verwendet wurde. Einige Salmonellenserovare (S. Virchow, S.

Agona) konnten mit diesem Verfahren allerdings nicht nachgewiesen werden. Die Spezifität dieses Verfahrens ist abhängig von der Spezifität der Gen-Sonde (TAPCHAISRI et al. 1999).

Bei dem von SNAIDR und BEIMFOHR (2001) beschriebenen in-situ- Hybridisierungsverfahren werden mit fluoreszierenden Farbstoffen markierte Gen-Sonden für rRNA direkt zu einer Bakterienkultur gegeben. Die Sonden dringen in die Bakterienzelle ein und die Hybridisierung erfolgt. Mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops können die farbigen Salmonellen detektiert werden (SNAIDR 2001).

Salmonellennachweis mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Der Salmonellennachweis mithilfe der PCR erfolgt aus einer Voranreicherung oder einer Selektivanreicherung. Auf diese Weise wird zum einen das Vorliegen einer Mindestanzahl von Zielzellen gewährleistet, zum anderen werden eventuell vorkommende PCR-Hemmstoffe aus der Lebensmittelprobe verdünnt (TAPCHAISRI et al. 1999). Vor der Durchführung der PCR muss zunächst die Bakterien-DNA präpariert werden. Hierfür stehen verschiedene Verfahrenstechniken zur Verfügung. Ziel ist es, die DNA zu extrahieren und PCR-hemmende Substanzen wie z.B. Proteine, Phenol- oder Salzreste zu eliminieren (MÜLHARDT 2000).

Mithilfe der hitzestabilen Polymerase wird anschließend ein spezifisches DNA-Fragment vervielfältigt (amplifiziert). Die Amplifikate können nun in einer Agarose-Gelelektrophorese mithilfe von Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Spezifität und die Sensitivität dieses Nachweisverfahrens beruhen auf der Verwendung charakteristischer Primer-Paare, durch die sowohl der amplifizierte Gen-Lokus als auch die Länge des Amplifikats bestimmt werden.

Für den Nachweis von Salmonellen sind in der Literatur verschiedene Gene als Zielsequenzen für die PCR-Methode beschrieben worden. Bei diesen Gensequenzen handelt es sich z.B. um das agf-, oriC-, HindIII-, fimA-, spv-, flicB/C oder das invA/E-Gen (WOODWARD u.

KIRWAN 1996, SCHRANK et al. 2001, ECHEITA et al. 2002).

Aufgrund der Agarosegel-Auswertung ist eine Aussage zum Vorliegen einer DNA-Bande mit einer bestimmten Basenpaar-Länge möglich. Dieses Ergebnis kann mit verschiedenen Methoden bestätigt werden, um nachzuweisen, dass es sich bei dem vorliegenden DNA- Fragment tatsächlich um das Salmonellen-spezifische Fragment handelt. SCHRANK et al.

36

zerlegen. BURKHALTER et al. (1995) verwendeten zur weiteren Absicherung eine „nested PCR“. Hierbei handelt es sich um eine „verschachtelte“ PCR, bei der das PCR-Produkt einer durchgeführten PCR als Ausgangsprodukt für eine zweite PCR dient. Das zweite Primerpaar liegt dabei zwischen dem ersten Primerpaar, sodass falsche Amplifikatprodukte der ersten PCR ausselektiert werden (MÜLHARDT 2000). Amplifikate können auch durch ein ELISA- Verfahren detektiert werden. Hierbei werden die PCR-Produkte durch spezifische DNA- Sonden auf einer Mikrotiterplatte fixiert und nach Zugabe eines Konjugates photometrisch sichtbar (PCR-ELISA) (ANONYM 1997a). PCR-Produkte können außerdem durch Hybridisierungstechniken überprüft werden. Dazu wird das Amplifikat zunächst von dem Agarosegel auf eine Membran übertragen (Southern Blot). Anschließend werden spezifische DNA-Abschnitte durch die Hybridisierung mit markierten Sonden sichtbar gemacht (FEDER et al. 2001).

Ein weiteres Einsatzgebiet der Hybridisierungstechnik stellt die Verwendung von Microarrays dar. Hierbei handelt es sich um DNA-Sonden, die auf eine feste Unterlage (z.B.

Objektträger) gedruckt sind. Wird nun Proben-DNA zu diesen Sonden gegeben, so hybridisieren komplementäre DNA-Stränge, unpassende DNA-Abschnitte werden dagegen nicht gebunden und lassen sich leicht von der Unterlage abwaschen (CUZIN 2001). Durch die Markierung der Proben-DNA (z.B. durch die Verwendung markierter dNTPs bei der PCR) können gebundene DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden. Ein Microarray kann mit tausenden verschiedener Gensonden bedruckt sein (BALL u. TREVORS 2002). Ihre Einsatzmöglichkeiten liegen daher u. a. auf den Gebieten der Genomforschung, der Klärung pharmakologischer Mechanismen und des Monitorings für bestimmte Bakterien. Für verschiedene Mikroorganismen (z.B. E. coli, Bacillus subtilis) sind bereits mit Sonden bedruckte Microarrays kommerziell erhältlich (LUCCHINI et al. 2001). Der Nachweis von Salmonellen mithilfe von Microarrays wurde bereits von BUSCH et al. (2001) und HUBER et al. (2001) beschrieben. Mit dem verwendeten NUTRI^®-Chip war der parallele Nachweis von Salmonella spp., Campylobacter jejuni/coli und Listeria monocytogenes aus kulturell- bestätigten Feldproben möglich.

Der benötigte Untersuchungszeitraum für den Nachweis von Salmonellen mit molekularbiologischen Nachweismethoden beträgt zwischen 12 und 72h, abhängig v.a. von

den Anreicherungsschritten und einer erforderlichen DNA-Extraktion (FERRETTI et al.

2001, PIKNOVÁ et al. 2002)

2.2.4 Methodenvergleich

Die verschiedenen Nachweisverfahren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität (Zuverlässigkeit), in der Dauer bis zum Vorliegen des Untersuchungsergebnisses (Schnelligkeit) und in dem benötigten Aufwand von Arbeitszeit und Labormaterial (Preis).

Von entscheidender Bedeutung für die Einsetzbarkeit eines Untersuchungsverfahren in der Routinepraxis sind die Sensitivität und die Spezifität.

Eine Nachweismethode ist um so spezifischer, je weniger falsch-positive Ergebnisse mit ihr erzielt werden.

Spezifität =

) (

)

(richtig negative falsch positive negative

richtig

− +

−

− =

insgesamt negative

negative richtig

−

−

Die Spezifität eines Salmonellen-Nachweisverfahrens gewährleistet, dass nur Salmonellen nachgewiesen werden und keine Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien auftreten (FACH et al. 1999).

Eine Nachweismethode ist um so sensitiver, je weniger falsch-negative Ergebnisse vorliegen.

Sensitivität =

) (

)

(richtig positive falsch negative positive

richtig

− +

−

− =

insgesamt positive

positive richtig

−

−

Die Sensitivität eines Salmonellen-Nachweisverfahrens zeigt an, ob z.B. alle Salmonellen- Serovare und auch evtl. geschädigte Salmonellen diagnostiziert werden können.

Grundsätzlich muss bei einem Methodenvergleich unterschieden werden, ob es sich bei den untersuchten Proben um künstlich kontaminierte Proben handelt, oder ob die Kontamination der Proben auf natürlichem Weg stattgefunden hat. Natürlich kontaminierte Feldproben unterscheiden sich von experimentell kontaminierten Proben durch die

„ökologische Vielfalt“ der beteiligten Mikroorganismen. Insbesondere die technologischen

38

auch die durch Stressfaktoren geschädigten Mikroorganismen eine Rolle, die subletal geschädigt sein können, sodass eine Kultivierung nur schwer möglich ist (DE PAULA et al.

2002). Die vergleichende Untersuchung mit natürlich kontaminierten Proben bietet daher den Vorteil der besseren Übertragbarkeit auf die tatsächliche Situation in der Routinepraxis (FIERENS u. HUYGHEBAERT 1996). Der Nachteil einer Feldprobenuntersuchung liegt darin, dass der tatsächliche Anteil der Salmonellen-positiven Proben nur schwer zu bestimmen ist. Als „Gold Standard“ zur Erkennung Salmonellen-positiver Proben hat sich die Kulturmethode durchgesetzt (SNAIDR 2001). Bei vergleichenden Untersuchungen hat sich aber herausgestellt, dass auch diese Methode falsch-negative Ergebnisse erzielen kann. Grund dafür ist z.B. das Vorliegen einer hohen Anzahl von Begleitkeimen (FIERENS u.

HUYGHEBAERT 1996, TAPCHAISRI et al. 1999). Wird die Kulturmethode als Basis für einen Vergleich mit Schnellmethoden verwendet, werden die unerkannten Salmonellen- kontaminierten Proben (=falsch-negative Proben) der Kulturmethode als falsch-positive Proben der Schnellmethoden angesehen.

Die Untersuchung künstlich kontaminierter Proben bietet neben dem Vorteil der bekannten Anzahl Salmonellen-positiver Proben auch die Möglichkeit, Aussagen zu einer Nachweisgrenze (detection limit) machen zu können. Mithilfe von Dotierungsversuchen kann herausgefunden werden, wie viele Salmonellen in einer bestimmten Menge Lebensmittel vorkommen müssen, um zu einem positiven Untersuchungsergebnis zu gelangen. FACH et al.

(1999) unterschieden hierbei zwischen der Nachweisgrenze lebender und toter Salmonellen in Lebensmitteln. Durch Untersuchungen dotierter Proben, bei denen auf die Durchführung der Salmonellenanreicherung verzichtet wurde, ist die Bestimmung der Nachweisgrenze der eigentlichen Untersuchungsmethode (ohne die Kombination mit Anreicherungsschritten) möglich (TIAN et al. 1996, TAPCHAISRI et al. 1999). Diese Nachweisgrenze indiziert die Salmonellen-Konzentration, die mit der Durchführung der Anreicherungsschritte erreicht werden muss, um ein positives Testergebnis anzuzeigen.

2.2.5 Bisher durchgeführte Vergleiche verschiedener Nachweisverfahren

2.2.5.1 Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität mit Bakterien-Reinkulturen Um zu klären, welche Salmonellenstämme mit einem Nachweisverfahren erkannt werden, und ob Bakterien der Begleitflora falsch-positive Untersuchungsergebnisse verursachen, wurden von verschiedenen Autoren Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität mit Bakterien-Reinkulturen durchgeführt (s. Tabelle 2). Hierbei wurden verschiedene Konzentrationen von Bakterienkulturen mit dem jeweiligen Nachweisverfahren untersucht.

MALORNY et al. (2001) stellten hierbei fest, dass bei den von ihnen durchgeführten PCR- Untersuchungen mit bestimmten Primersystemen von einigen Salmonellenstämmen keine oder nur undeutliche DNA-Banden erzeugt werden konnten. Mit dem Primerpaar 139/141 (invA-Gen) wurden Amplifikate von E. coli, Shigella und Citrobacter erzeugt, die allerdings von den Salmonellen-Amplifikaten anhand ihrer Größe (bp-Länge) zu unterscheiden waren.

Durch Veränderungen der Annealing-Temperatur der PCR konnte die Spezifität der Primer erhöht werden.

Auch bei den ELISA-Systemen wurden Bakterienstämme entdeckt, die falsch-negative oder falsch-positive Untersuchungsergebnisse verursachten. BLACKBURN et al. (1994) berichteten über Kreuzreaktionen von einigen Citrobacter freundii-Stämmen bei Verwendung des VIDAS Salmonella Assay. HUGHES et al. (1996) beschrieben falsch-positive Untersuchungsergebnisse mit dem Tecra^®Salmonella VIA durch Stämme von Citrobacter freundii und Enterobacter cloacae. Mit dem Tecra^®Salmonella VIA konnten 12 von 300 untersuchten Salmonellenstämmen erst ab einer Konzentration von 1x10⁸/ml nachgewiesen werden, während die übrigen 288 Stämme bereits bei einer Konzentration von 1x10⁷/ml festgestellt werden konnten.

40

Tab. 2: Sensitivität und Spezifität verschiedener Nachweissysteme bei Verwendung von Salmonella- und nonSalmonella-Reinkulturen

Fortsetzung der Tabelle 2:

42

2.2.5.2 Untersuchungen zur Nachweisgrenze verschiedener Nachweisverfahren von Salmonellen in Lebensmitteln

Anhand von Dotierungsversuchen wurde die Salmonellen-Konzentration (Salmonellen / x g Lebensmittel) ermittelt, die in einem Lebensmittel vorhanden sein muss, um zu einem positiven Untersuchungsergebnis zu führen. Die in der Literatur beschriebenen Nachweisgrenzen liegen zwischen 10⁰ und 10¹ Salmonellen / 25g Lebensmittel (s. Tabelle 3).

CHEN et al. (1997a) bezeichneten diese Art der Dotierung als „pre-spiking experiment“ um deutlich zu machen, das die Dotierung vor der Voranreicherung (pre-enrichment) durchgeführt wurde. Bei einem „post-spiking experiment“ wurde dagegen erst eine Probe mit Anreicherungsmedium inkubiert, anschließend wurde mit Salmonellen dotiert, und danach folgten die weiteren Arbeitsschritte der Untersuchungsmethode (vgl. 2.2.5.3)

Die von TIAN et al. (1996) ermittelte Nachweisgrenze von 0,69 Salmonellen pro 25 g Hühnerfleisch wurde rechnerisch ermittelt, nachdem die Dotierung mit unterschiedlich konzentrierten Salmonellenlösungen durchgeführt wurde.

FLINT und HARTLEY (1993) dotierten ein Gemisch aus 25 g Probenmaterial und 225 ml Voranreicherungsflüssigkeit mit 10, 100 und 1000 Salmonellen und untersuchten nach der Inkubation mit dem Tecra^® Immunocapture-ELISA. Die Nachweisgrenze von 0,4 Salmonellen/g Probe wurde rechnerisch bestimmt, nachdem auch die mit nur 10 Salmonellen dotierte Mischung aus Probe und Voranreicherungsflüssigkeit ein positives Untersuchungsergebnis zeigte.

Tab. 3: Nachweisgrenzen verschiedener Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Salmonellen aus dotierten Lebensmittelproben

44

2.2.5.3 Untersuchungen zur Nachweisgrenze verschiedener Salmonellen- Nachweisverfahren unter Ausschluss der Salmonellenanreicherung

Während die unter 2.2.5.2 beschriebene Nachweisgrenze für die Kombination aus Anreicherungsschritten und der eigentlichen Nachweismethode gilt, handelt es sich hier um die Bestimmung der Nachweisgrenze ausschließlich für die eigentliche Nachweismethode.

Die Tabelle 4 zeigt einen Überblick der in der Literatur beschriebenen Nachweisgrenzen verschiedener Untersuchungsmethoden unter Ausschluss der Salmonellenanreicherung.

Um die Nachweisgrenze nur für die eigentliche Nachweismethode zu bestimmen, wurden verschiedene Verfahren angewendet.

Zum einen wurde salmonellenfreies Probenmaterial inkubiert („Voranreicherung der Begleitkeime“), und anschließend erfolgte die Dotierung dieser „vorangereicherten“ Proben (= post-spiking experiment) sowie die folgenden Schritte der Nachweisverfahren (CHEN et al. 1997a, HUGHES et al. 1996, BAILEY 1998).

FACH et al. (1999) dagegen dotierten zuerst das Probenmaterial und versetzten dieses anschließend mit Voranreicherungsmedium. Ohne danach die Inkubation durchzuführen, untersuchten sie direkt mit dem Probelia^®-PCR-Verfahren.

In einem anderen Versuch dotierten FACH et al. (1999) verschiedene Lebensmittel mit toten Salmonellen und führten anschließend die Voranreicherung und danach die PCR- Untersuchung durch.

Tab. 4: Nachweisgrenzen verschiedener Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Salmonellen unter Ausschluss der Salmonellenanreicherung