(Institutsleiter Prof. Dr. med. S. Suerbaum) Zentrum Laboratoriumsmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover
Der Nachweis invasiver Pilzinfektionen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) -
Evaluation und Erweiterung der Methode bei Risikopatienten
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Christoph Goldbecker aus Hannover
Hannover 2011
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 24.01.2012
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Philip Kirschner Referent: Prof. Dr. med. Anke Franzke
Korreferent: PD Dr. med. Ulrich Baumann Tag der mündlichen Prüfung: 24.01.2012 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. med. Andreas Klos
Prof. Dr. med. Reinhard Brunkhorst
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einführung und Zielsetzung ... 7
1.1 Einführung ... 7
1.1.1 Allgemeines zu Pilzinfektionen... 7
1.1.2 Gefährdete Patientengruppen für invasive fungale Infektionen... 7
1.1.3 Bedeutung verschiedener Pilzspezies bei disseminierten Infektionen . 8 1.1.4 Bedeutung der Gattung Candida als Krankheitserreger... 9
1.1.5 Bedeutung der Gattung Aspergillus als Krankheitserreger ... 9
1.1.6 Bedeutung der Gattung Fusarium als Krankheitserreger ... 10
1.1.7 Eingesetzte Verfahren zum Nachweis einer invasiven Pilzinfektion .. 11
1.1.8 Therapie der invasiven Pilzinfektion... 13
1.2 Zielsetzung ... 14
2 Materialien und Methoden ... 15
2.1 Patienten ... 15
2.2 Kontrollgruppe ... 15
2.3 Einteilung in Risikogruppen für invasive fungale Infekte ... 16
2.4 Probenmaterial für Untersuchungen auf Fungämie... 18
2.5 Eingesetztes Labormaterial ... 19
2.5.1 Chemikalien ... 19
2.5.2 Enzyme und Antikörper... 20
2.5.3 Lösungen ... 21
2.5.4 Nährmedien ... 22
2.5.5 Oligonukleotide zur Pilzdetektion ... 23
2.5.6 Oligonukleotide für Fusarien ... 24
2.5.7 Digoxiginierte Oligonukleotide zur DNA-DNA-Hybridisierung ... 24
2.5.8 Geräte ... 25
2.5.9. Pilzkulturen, Pilzlösungen und sonstige Materialen ... 26
2.6 Aufarbeitung der Proben ... 26
2.6.1 Vorbereitung von festen Gewebsproben... 26
2.6.2 Befreiung der Proben von humanem Zellmaterial ... 27
2.6.3 Positivkontrollen ... 27
2.6.4 Wasser als Negativkontrolle... 28
2.6.5 Zerstörung der Pilzzellwände zur DNA-Freisetzung... 28
2.7 Polymerasekettenreaktionen ... 30
2.7.1 Genus- bzw. speziesspezifische Pilz-PCR... 30
2.7.2 Agarosegel-Elektrophorese... 32
2.7.3 Hybridisierung der PCR-Produkte ... 33
2.8 Universelle Pilz-PCR ... 35
2.8.1 Grundlagen ... 35
2.8.2 DNA-Sequenzierung ... 36
3 Ergebnisse... 38
3.1 Verteilung der Proben und Patientenstruktur ... 38
3.2 PCR-Ergebnisse... 41
3.2.1 Candida-PCR ... 41
3.2.2 Aspergillus-PCR... 45
3.3 Low-Level-Kontamination der Aspergillus-PCR... 49
3.3.1 Untersuchung der Lyticase ... 52
3.3.2 Austestung von zellwandabbauenden Enzymen anderer Hersteller .. 54
3.3.3 Aktivität des Yeast-Lytic-Enzyme im Vergleich zur Sigma-Lyticase ... 55
3.3.4 Eliminierung kontaminierender Pilz-DNA in Reagenzien ... 57
3.3.5 Candida-Zellen-Kontrolle ... 60
3.4 Sensitivitätsaustestung... 60
3.4.1 Sensitivitätskontrolle mit Proben der Tübinger Arbeitsgruppe... 60
3.4.2 Herstellen einer Lösung von Aspergillus-Sporen und Quantifizierung 61 3.4.3 Reinheitskontrolle... 62
3.4.4 Sensitivitätstestung der Lyticase-Präparation ... 63
3.5 Fusarien-PCR... 65
3.5.1 Übertragbarkeit der Prinzipien der PCR-Methodik - Fallbeschreibung65 3.5.2 Entwicklung und Testung reverser Fusarien-Primern ... 66
3.5.3 Testung des Primers anhand von Patientenproben ... 71
3.6 Identifizierung und Sequenzierung von Ringversuch-Proben... 74
4 Diskussion ... 77
4.1 Grundlagen und allgemeine Fragestellung... 77
4.2 Candida-PCR ... 78
4.3 Aspergillus-PCR ... 82
4.4 Fusarien-PCR... 85
4.5 Universelle Pilz-PCR und nachfolgende Sequenzierung... 87
4.6 Wertung und Ausblick ... 87
5 Zusammenfassung ... 88
6 Literaturverzeichnis... 90
7 Anhang ... 96
7.1 Abbildungsverzeichnis... 96
7.2 Tabellenverzeichnis... 96
8 Danksagung... 99
9 Lebenslauf ... 100
10 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 ... 102
1 Einführung und Zielsetzung
1.1 Einführung
1.1.1 Allgemeines zu Pilzinfektionen
Invasive Pilzinfektionen spielen in der Allgemeinbevölkerung kaum eine Rolle.
Die Häufigkeit und Schwere fungaler Infektionen ist dagegen bei immunkompro- mittierten Patienten deutlich erhöht. Dabei spielt die Dauer und Ausprägung einer Neutropenie (Neutrophilenzahl < 500/µl) eine wesentliche Rolle1. Ein der- artiges Immundefizit kann durch Krankheiten, im Rahmen aggressiver Thera- pieschemata in der Onko- und Hämatoonkologie oder auch nach Organtrans- plantationen auftreten. In den letzten 10 bis 15 Jahren hat die klinische Rele- vanz von invasiven fungalen Infektionen (IFI) zugenommen2. Hierbei handelt es sich um septikämische Krankheitsbilder, die, von einem lokalen Infekt aus- gehend, aufgrund einer abgeschwächten immunologischen Abwehrlage der Patienten auftreten. Der größte Teil der Infektionen wird durch Pilze der Genera Candida und Aspergillus hervorgerufen, zu einem geringeren Anteil durch Fusarien2-12.
1.1.2 Gefährdete Patientengruppen für invasive fungale Infektionen
Personen mit funktionsfähigem Immunsystem - also einer funktionierenden zellulären und humoralen Körperabwehr - sind regelmäßig nicht von Pilzinfek- tionen betroffen. Haut und Schleimhäute des gesunden, immunkompetenten menschlichen Organismus können mit diversen Pilzspezies besiedelt sein, stellen aber eine wirksame Barriere gegen eine fungale Invasion dar. Da nur
wenige Pilze natürlicherweise eine hohe Pathogenität besitzen, kommt es le- diglich vereinzelt zu lokalen mukokutanen Infektionen. Eine Schwächung der genannten Abwehrmechanismen ist einer der wichtigsten Kofaktoren sowohl für lokale als auch generalisierte fungale Infektionen13. Die Schädigung der normalen Flora durch Antibiotika ermöglicht die Fehlbesiedlung mit fakultativ pathogenen Pilzen, z. B. mit denen in dieser Arbeit beschriebenen Spezies. Der vermehrte Einsatz immusuppressiver Substanzen, zytostatischer Chemotherapeutika sowie Breitspektrumantibiotika und die Verwendung einer zunehmenden Anzahl von Kunststoffprothesen hat die Zahl der für eine IFI anfälligen Personen in den letzten Jahren kontinuierlich erhöht. Auch Fortschritte in der Intensivtherapie haben neben einem verbesserten Überleben der kritisch kranken Patienten zu einer Zunahme von IFI geführt2. Dazu tragen unter anderem die längerfristige parenterale Ernährung und der Einsatz zentralvenöser Zugänge bei14. HIV-infizierte Personen stellen eine weitere Risikogruppe. Den Hauptteil der gefährdeten Patienten bilden jedoch solche mit malignen hämatologischen Erkrankungen (ggf. verstärkt durch myelosuppressive Chemotherapeutika), mit Tumoren solider Organe sowie Patienten nach Transplantation des Knochenmarkes oder solider Organe7, 9, 10,
15.
1.1.3 Bedeutung verschiedener Pilzspezies bei disseminierten Infektionen Von besonderer Relevanz sind invasive Infektionen mit Aspergillus- und Candi- da-Spezies. Sie verursachen mehr als 90 % aller disseminierten Infektionen2, 16. Durch den häufigen prophylaktischen Einsatz von Fluconazol treten Schimmel-
pilzspezies wie Aspergillus als Erreger disseminierter Infektionen zunehmend in den Vordergrund, da sie natürlicherweise Fluconazol-resistent sind2, 17. Auf- grund der bisher hohen Mortalität sind Mukor-Mykosen sehr gefürchtet. Sie können z. B. bei einer Besiedlung der Nasennebenhöhlen in die Weichteile des Auges und in das basale Hirn einbrechen2, 11.
1.1.4 Bedeutung der Gattung Candida als Krankheitserreger
Die Gattung Candida zählt zu den Sprosspilzen und hier zur Untergattung der Hefepilze. Die häufigste lokale klinische Infektion ist der Soor, ein Befall der Schleimhäute. Säuglinge können in der ersten Zeit postnatal unter einer oralen Candidabesiedlung leiden, da sie noch nicht über eine voll entwickelte Immun- abwehr gegen Pilze verfügen. Sonst tritt diese Schleimhaut-Candidose noch gehäuft in Phasen der Neutropenie bei Erwachsenen auf18. Insbesondere bei den oben beschriebenen Risikopatienten kann es zu einer septikämischen Streuung des Erregers mit metastasenartig erscheinenden Absiedlungen von Abzessen in anderen Organsystemen (z. B. Milz, Leber, Haut) kommen. Candi- da albicans macht mehr als 50 % der durch Hefepilze induzierten invasiven Erkrankungen aus. In Studien entfallen auf die meist Fluconazol-resistenten Spezies C. glabrata und C. krusei jeweils maximal 10 % der Infektionen2, 18, 19. 1.1.5 Bedeutung der Gattung Aspergillus als Krankheitserreger
Aspergillus-Sporen kommen ubiquitär - wie schon im Jahre 1729 von Micheli in seinem Buch „Nova plantarum geneva juxta Tournefortii methodum disposita“
beschrieben - vor. Gerade bei feuchtwarmer Witterung im Frühling und Herbst
treten durch die Häufung von Verrottungsprozessen pflanzlicher Substrate in der Natur viele Sporen in der Luft auf20. Als Aspergillose wird eine Vielzahl von Erkrankungen, die durch eine der 55 pathogenen oder allergenen Arten von Aspergillus ausgelöst werden, bezeichnet. Hierzu zählen auch Wirkungen durch Mykotoxine, die durch Verzehr kontaminierter Speisen aufgenommen werden21. Eine septikämische Streuung mit Besiedlung mehrerer Organe geht meist von einer primären pulmonalen Besiedlung, wie von Theodor Sluyter 1847 erstmals beschrieben, aus22-24. Diese Form wird auch als invasive Aspergillose (IA) oder disseminierte Infektion bezeichnet. Eine IA zählt zu den häufigsten Todesur- sachen in hämatoonkologischen Abteilungen und Transplantationszentren. Die durchschnittliche Letalität beträgt 50 %. Bei Knochenmarktransplantierten und nicht therapierten Patienten erreicht sie bis zu 100 %. Bei einzelnen Ausbrü- chen invasiver Aspergillose in hämatoonkologischen Abteilungen waren 10 - 25 % der dort behandelten Leukämiepatienten betroffen, von denen trotz The- rapie 80 - 90 % verstarben6, 25. Von den über 80 unterschiedlichen Spezies, die Thom und Raper 194526 der Gattung Aspergillus zuordneten, ist Aspergil- lus fumigatus für 90 % aller invasiven Aspergillosen verantwortlich25, 27. Andere, jedoch deutlich seltener vorkommende Arten sind A. flavus, A. terreus und A. niger.
1.1.6 Bedeutung der Gattung Fusarium als Krankheitserreger
Neben den bereits beschriebenen Aspergillus-Infektionen werden unter 5 % der Schimmelpilz-Infektionen in Europa und den USA durch Pilze des Genus Fusa- rium hervorgerufen2. Haupterregerreservoir in Europa sind Getreidevorräte.
Auch die Besiedlung von Tomaten kommt in Mitteleuropa gelegentlich vor28. Beim Menschen tritt eine Fusarienbefall fast ausschließlich als kutaner Infekt, begünstigt durch eine Hautläsion, auf29, 30. Bei immunkompromittierten Patienten kann es jedoch neben der kutanen Manifestation zur systemischen Streuung kommen.
1.1.7 Eingesetzte Verfahren zum Nachweis einer invasiven Pilzinfektion
Das einfachste Verfahren zur Diagnostik von lokalen und auch systemischen Infekten mit Candida-Spezies ist die Mikroskopie mit Nachweis der Hyphen.
Auch eine Anzucht auf Selektivmedien ist möglich, allerdings mit einigen Tagen Zeitverzug. Gerade die schnelle und einfachere Anzucht auf Kulturplatten, die sehr sicher funktioniert, ist ein Vorteil des Nachweises von Candida gegenüber dem Nachweis von sporenbildenden Schimmelpilzen.
Zum Nachweis von systemischen Aspergillosen gibt es kein einfaches und dennoch zuverlässiges Verfahren. Die Mikroskopie ist nur für die Myzelform durchführbar und ist nur bei massivem Befall positiv. Spezialfärbungen können Myzelien in Gewebebiopsien zwar sicher nachweisen, häufig kann aber aus dem befallenen Organ chirurgisch kein Material zu Mikroskopie gewonnen werden, zudem handelt es sich dabei um einen invasiven Eingriff beim regel- mäßig kritisch kranken Patienten. Zudem schließt ein negatives Präparat eine Pilzinfektion nicht aus, da die Sensitivität der Mikroskopie sehr gering ist. Das Anzüchten von Pilzkolonien aus Sporen aus dem Blut oder anderen Körper- flüssigkeiten ist ein sehr schwieriges und - bei der Aspergillus-Infektion - sehr unzuverlässiges Verfahren, dessen Sensitivität unter 10 % liegt31. Ein häufig
eingesetztes Verfahren zur Diagnostik speziell einer pulmonalen Besiedlung mit Pilzen stellt die konventionelle sowie auch die CT-gestützte radiologische Dia- gnostik dar. Diese ist jedoch erst im fortgeschrittenen Stadium möglich, da vor- her - z. B. in der HR-CT (hochauflösende Computertomografie) - kein Halo- Zeichen erkennbar ist32-34. Zudem sind die radiologischen Hinweise keineswegs spezifisch für eine pulmonale Pilzinfektion, sondern können auch im Rahmen bakterieller Infektionen auftreten35-39.
Schon aufgrund der Immunsuppression der Patienten spielen im Rahmen der IA Aspergillus-Antikörper-Nachweise keine Rolle. Ein mäßig zuverlässiges Dia- gnostikum ist der Galaktomannan-Test40-45, ein ELISA-gestütztes Verfahren, das mit monoklonalen Antikörpern lösliche Antigene aus der Wand der Aspergil- lus-Zellen nachweist. Das Ergebnis liegt innerhalb von etwa drei Stunden vor, ein deutlicher Vorteil gegenüber der schwierigen Kultivierung46-49. Allerdings können auch die Gabe von mit Galaktomannan verunreinigten Antibiotika wie Tazobactam oder über die Nahrung aufgenommene Galaktomannane falsch positive Ergebnisse bewirken. Nach Angaben des Herstellers kann daher ein Ergebnis nur bei zwei aufeinander folgenden positiven Serumproben als positiv gewertet werden. Ein einfach positives Resultat zählt somit nicht.
Die diagnostischen Möglichkeiten für Infektionen mit anderen Schimmelpilzen, speziell der Spezies Fusarium, liegen in der rein klinischen Beurteilung (z. B.
kutaner Läsionen), den Befunden der Computertomografie, Sonografie und Mikroskopie sowie einem Versuch der Kultivierung aus Probenmaterial.
Die unzureichende Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig verfügbaren dia- gnostischen Verfahren betont die Notwendigkeit der Entwicklung und Evalua- tion von Verfahren zum direkten sicheren Erregernachweis50. Es gilt, ein schnel- les und in der Aussagekraft sicheres diagnostisches Instrument zu finden, um gezielt bei Infektionsbeginn eine antimykotische Therapie einzuleiten. Dann könnte die nebenwirkungsreiche und kostenintensive unspezifische medika- mentöse Prophylaxe invasiver Pilzinfektionen bei den genannten Risikogruppen unterlassen werden und eine zielgerichtete Behandlung erfolgen51.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR), 1983 von Kary Mullis52 entwickelt und 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet, bietet sich geradezu für die Diagnose von Pilzinfektionen an. Insbesondere beim Einsatz von Automa- ten mit kurzen Replikationszyklen steht damit ein sehr schnelles diagnostisches Verfahren zur Verfügung53, 54. Durch die Auswahl definierter Primer können Genloci durch enzymatische Replikation amplifiziert werden. Diese können ent- weder in vielen Pilzspezies (gruppenspezifisch) vorkommen oder direkt spe- ziesspezifisch, z. B. für Aspergillus oder Candida, sein. Eine weitere Identifi- zierung ist mit speziesspezifischen Hybridisierungssonden bzw. durch Sequen- zierung der Amplifikate möglich.
1.1.8 Therapie der invasiven Pilzinfektion
Die am häufigsten eingesetzten Wirkstoffe zur Therapie von Aspergillosen sind Voriconazol, Caspofungin und Amphotericin B. Bei Candida-Infektionen kom- men Fluconazol, Itraconazol und Voriconazol, Amphotericin B und Caspofungin am häufigsten zum Einsatz33, 55-62. Die Echokandine wie Micafungin, Caspofun-
gin und Anidulafungin werden speziell bei den Fluconazol-resistenten C. krusei- und C. glabrata-Infektionen verwendet. Diese Medikamente konnten die Letali- tät der invasiven Pilzinfektionen in den letzten Jahrzehnten deutlich senken, sie liegt aber, insbesondere für die Aspergillosen, teilweise immer noch über 50 %2,
63. Der prophylaktische Einsatz6, 64 muss aufgrund der hepatischen und renalen Toxizität der Präparate begrenzt bleiben. Auch die hohen Tagestherapiekosten für eine medikamentöse antimykotische Prophylaxe limitieren eine sehr breite Anwendung. Damit ist für einen spezifischen, frühzeitigen Einsatz dieser Medikamente eine Verbesserung der diagnostischen Verfahren dringend erfor- derlich.
1.2 Zielsetzung
Die vorgestellte Untersuchung hatte zum Ziel, ein in einer vorausgegangenen Promotionsarbeit65 ausgearbeitetes PCR-Verfahren zur Diagnose invasiver Pilz- infektionen weiter zu evaluieren, dabei insbesondere die nachgewiesene DNA- Menge zu quantifizieren und das Verfahren mit der bisher routinemäßig einge- setzten Labordiagnostik zu vergleichen. Insgesamt sollte damit eine Aussage zur Sensitivität dieser molekulargenetischen Methode und zum routinemäßigen Einsatz getroffen werden.
Mit der Etablierung eines raschen, spezifischen Diagnoseverfahrens könnte, wie oben dargestellt, die Häufigkeit einer prophylaktischen Therapie bei neutro- penischen Patienten inklusive der daraus erwachsenden Nebenwirkungen reduziert und durch die frühe speziesgezielte Therapie eventuell das Überleben der Patienten verbessert werden.
2 Materialien und Methoden
2.1 Patienten
In die prospektive Beobachtungsstudie wurden Patienten jeglichen Alters (auch Kin- der), die aufgrund einer Knochenmarkerkrankung stationär in die Medizinische Hoch- schule Hannover (MHH) aufgenommen wurden, eingeschlossen. Diesen wurde un- mittelbar nach Aufnahme venöses EDTA-Blut (4 - 8 ml, Kinder teilweise 1,5 ml) ent- nommen. Entwickelte ein Patient im Verlauf Fieber, wurde vor Aufnahme einer evtl.
antimykotischen Therapie erneut Blut sowie ggf. im Rahmen der Fokussuche gewon- nenes Material untersucht. Weiter eingeschlossen wurden Patienten, die sich auf- grund anderer Grunderkrankungen (siehe Tab. 15) in stationärer Behandlung der MHH befanden und die während des Aufenthaltes Fieber bei einem Infekt unklarer Genese entwickelten. Außerdem wurden Patienten, bei denen klinisch eine Pilzinfek- tion vermutet wurde, eingeschlossen. Diesen wurde ebenfalls EDTA-Blut entnommen und ggf. weiteres Material gewonnen.
Die Untersuchungen erfolgten aus routinemäßig im Verlauf der Behandlung gewon- nenen und von den vorab informierten betreuenden Ärzten entnommenen Laborblut- und Materialproben. Studienbedingte Labor- oder Materialentnahmen sind nicht er- folgt.
2.2 Kontrollgruppe
Zum Zwecke der Negativkontrolle wurde außerdem EDTA-Blut (4 - 8 ml) von an der Studie beteiligten gesunden, wissenschaftlichen Mitarbeitern gewonnen.
2.3 Einteilung in Risikogruppen für invasive fungale Infekte
Die Patienten wurden in Anlehnung an die EORTC Mycosis Study Group66 in Grup- pen nach der Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer invasiven Pilzinfektion ein- geteilt (Tab. 1 - 4).
Mikrobiologischer Nachweis von Candida spp. aus primär sterilen Körperflüssigkeiten/ Geweben
und Gesicherte invasive Candida-
Infektion
entsprechende Krankheitszeichen oder
histologischer Nachweis von Hefen oder Pseudohyphen aus einer Biopsie eines primär sterilen Gewebes
oder
eindeutiger histologischer Befund einer Candida-Infektion mit Pseudohyphen aus Lunge, Leber, Herz, Milz Niere oder Gehirn.
Wahrscheinliche invasive Candida-Infektion
Serologischer Nachweis einer Candida-Infektion oder
Mikroskopischer Nachweis aus BAL und jeweils
a) neu darstellbare, nicht anders einzuordnende Infiltrate in Lunge oder anderen Organen und
b) Fieber trotz Breitspektrumantibiose oder Rückgang des Infektes unter antimykotischer Therapie.
Mögliche invasive Candida- Infektion
Erfüllung der Kriterien a) und b) ohne histologischen oder mikrobiologisch positiven Nachweis von Candida spp.
Unwahrscheinliche Candida- Infektion
Keine mikrobiologischen, serologischen oder histologischen positive Befunde und keine typischen klinischen Zeichen.
Tab. 1: Einteilung der Patientengruppen in Wahrscheinlichkeiten für eine Candida-Infektion in Anlehnung an die EORTC-Einteilung66. BAL= Bronchoalveoläre Lavage.
Gesicherte invasive Aspergillose Histologischer Nachweis von Hypheninvasion im Gewebe in Verbindung mit positivem Befund von Aspergillusspezies in Kulturen.
Gesicherte invasive Aspergillose mit disseminierter Infektion
Nachweis der Erreger in zwei oder mehr nicht miteinander in direktem Kontakt stehenden Organen oder Organsystemen.
Positiver mikrobiologischer Nachweis in der Kultur von Aspergillus spp. aus Sputum oder bronchoalveolärer Lavage oder mikroskopischer Hyphennachweis.
Wahrscheinliche invasive Aspergillose
Nachweis von Aspergillus-Antigen in Blut/ Serum und mind. 1 Major- oder 2 von 3 Minor-Zeichen (siehe Tab. 3 und 4).
Mögliche invasive Aspergillose Positiver mikrobiologischer Befund bei bewiesenem unterem Atemwegsinfekt oder klinische Zeichen wie o.g.
Unwahrscheinliche invasive Aspergillose Weder serologischer oder mikrobieller positiver Befund noch ein typisches klinisches Zeichen.
Tab. 2: Einteilung der Patientengruppen in Wahrscheinlichkeiten für eine Aspergillus- Infektion in Anlehnung an die EORTC-Einteilung66.
Halo-Zeichen in Computertomografie (CT) oder hochauflösender Computertomografie (HRCT) des Thorax
Air-Crescent-Zeichen mit Spaltbildung zwischen vitalem und nekrotischem Gewebe in CT oder HRCT des Thorax
Kavitation (mit zentraler Konsolidierung/ Lufteinschluss) in CT oder HRCT Tab. 3: Major-Zeichen einer invasiven Aspergillose.
Husten, Pleuraschmerzen, Hämoptysen, Dyspnoe Pleurareiben
Pulmonale Infiltrate die nicht anders zu erklären sind und die die Major-Zeichen nicht erfüllen
Tab. 4: Minor-Zeichen einer invasiven Aspergillose.
Die für die Gattung Aspergillus angewendeten Prinzipien wurden analog für eine Infektion mit Fusarien-Spezies benutzt.
2.4 Probenmaterial für Untersuchungen auf Fungämie
In Tab. 5 sind die Probenmaterialien mit Mengenangaben, Häufigkeit und Referen- zen dargestellt.
Probenmaterial Mengenangaben Häufigkeit Vergleichbarer Einsatz in Literatur EDTA-Blut 1,4 ml Bluthütchen aus
Kinderklinik
bis 9 ml Monovette
269 Loeffler et al. 200067
Bronchoalveoläre Lavage
3 - 7 ml 15 x Bretagne et al. 199568 Skladny et al. 199969 Buchheidt et al.
200170
Hayette et al. 200171 Raad et al. 200272 Vandewoude et al.
200673 Pleuraerguss 2 - 5 ml 1 x
Perikarderguss 1 - 2 ml 1 x Hautbiopsie 2 x 1,5 mm 2 x Perikard ca. 0,5 x 0,5 x 0,2 mm 1 x
Tab. 5: Untersuchtes Patientenmaterial.
2.5 Eingesetztes Labormaterial
2.5.1 Chemikalien
Chemikalie Hersteller
Acrylamid 40 % Biomol, Hamburg
Agarose, ultrarein BRL, Eggenstein
Aqua ad injectabilia Pfrimmer & Co, Erlangen Chloroform, p. A. (pro analysis) Merck, Darmstadt
2-Desoxynukleosid-5`-Triphosphat dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 100 mM
Pharmacia, Freiburg
Dynabeads M-280 Streptavidin Dynal, Hamburg
Ethanol, p. A. Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Sigma, München
Glassbeads 100 µm Sigma, München
Glycerol Merck, Darmstadt
Glykogen 20 mg/ml Boehringer, Mannheim
Harnstoff Merck, Darmstadt
Isopropanol, p. A. Merck, Darmstadt Isoamylalkohol, p. A. Merck, Darmstadt SDS (Natriumdodecylsulfat) Gibco/BRL, Eggenstein
Nujol-Öl Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA
Oligonukleotide Pharmacia, Freiburg
Orange G Gibco/BRL, Eggenstein
Phenol Roth, Darmstadt
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Merck, Darmstadt
Triton X 100 Merck, Darmstadt
t-RNA Boehringer, Mannheim
Tween 20 Applichem, Darmstadt
Tween 80 Serva, Heidelberg
Wasser, steril Boehringer, Mannheim
Tab. 6: Eingesetzte Chemikalien.
2.5.2 Enzyme und Antikörper
Enzym/Antikörper Hersteller Ampli Taq DNA Polymerase (5 U/µl) Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA Anti-Digixigenin-Antikörper, Nr. 1093274 Boehringer, Mannheim
Lyticase from Arthrobacter Luteus L5763 Sigma, München Lyticase, Nr. 1372467 Boehringer, Mannheim
Sau3AI Ammersham-Pharmacia-Biotech Yeast-Lytic-Enzyme, Nr. 152870 ICN (Eschwege)
Yeast-Lytic-Enzyme, Nr. 190123 ICN (Eschwege) Yeast-Lytic-Enzyme, recombinant, Nr. 153529 ICN (Eschwege)
Tab. 7: Eingesetzte Enzyme und Antikörper.
2.5.3 Lösungen
Lösung Zusammensetzung Antikörper-Reagenz für Hybridisierung PBS 1% (w/v) BSA (Rinderserumalbumin) -
Anti-Digoxigenin-Antikörper 1 : 5.000 - Boehringer (1093274)
B+W-Puffer (Binding- and Washing-Buffer) für nicht-radioaktive Hybridisierungen
5 mM Tris pH 7,5 -, 0,5 mM EDTA - 1 M NaCl
Ethidiumbromid 1 mg/ml Aqua bidest
Lyticase-Puffer 10 x 0,5 M Tris-HCl pH 7,5- 0,1 M EDTA - 10 % Triton-X-100
Orange G Ladepuffer zur Elektrophorese Orange G - 30 % Glycerol - 10 mM Tris-HCl pH 8,3 - 1 mM EDTA
PBS (Maniatis) für nicht-radioaktive Hybridisierungen
2 g KCl - 2 g KH2PO4 - 80 g NaCl - 21,6 g Na2HPO47H2O - auf 1 l Aqua bidest.
PCR-Puffer 10 x GeneAmp Perkin Elmer 0,1 M Tris-HCl pH 8,3 - 0,5 M KCl - 15 mM MgCl2 - 0,01 % (w/v) Gelatine
10 x Puffer für Zellyse 50 mM Tris-HCl pH 7,5 - 10 mM EDTA - 1 % Triton-X-100
10 x Puffer H für Sau3AI-Verdau 500 mM Tris-HCl pH 7,5 - 100 mM MgCl2 - 10 mM Dithiothreitol - 1.000 mM NaCl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol für
Nukleinsäureextraktionsverfahren
24,5 ml Phenol - 24,5 ml Chloroform - 1 ml Isoamylalkohol
SSC 10 x für Slot-Blot 1,5 M NaCl - 0,15 M NaCitrat
Sequenzierladelösung 5 Teile Formamid - 1 Teil 25 mM EDTA - Detranblau 50 mg/ml
Substrat-Puffer für Hybridisierung 4-Methyl-Umbelliferylphosphat 1 mg/25 ml - 0,1 M Tris-HCl pH 9,6 - 50 mM MgCl2 - 0,1 M NaCl
TBE 10 x für Elektrophorese 108 g Tris - 55 g Borsäure - 7,4 g EDTA - Aqua bidest. ad 1 l
Tab. 8: Eingesetzte Lösungen.
2.5.4 Nährmedien
Nährmedium Hersteller
Sabourand-Agar MHH Mikrobiologie
Maisstärke-Agar MHH Mikrobiologie
Kochblutagar MHH Mikrobiologie
Bierwürzagar Gilde-Brauerei Hannover
DMBM-Pilznährlösung MHH Mikrobiologie
YMPG-Medium für Pilze (Hefeextrakt 0,3 %, Malzextrakt 0,3 %, Pepton 0,5 %, Glucose 1 %)
MHH Mikrobiologie
Tab. 9: Eingesetzte Nährmedien.
2.5.5 Oligonukleotide zur Pilzdetektion
Name Sequenz Position Tm taxon Ebene Orientierung
F 2 CTY GTA ATT GGA ATG AGT ACA 517 56/58 u P forw
F 3 GAA GAC IAA CTA CTG CGA AA 979 56 u P forw
F 4a GAA CGA ARG TTA GGG GAT C 1032 56 u P forw
F 4b ATC RTC TTC GAT CCC CTA AC 1040 58/60 u S rev
F 8 GIA TTC CTC GTT GAA GAG C 1647 56 u P rev
F 10 GST GCT AGC WTT TGC TGC T 1422 58 g S forw
F 15 TCT CGG CCA AGG TGA TGT 1571 56 g P rev
F 16 CTC TCG GCC AAG GYT TAT 1572 54/56 g P rev
F 19 AGA TTC TCC GCT CTG AAG T 1793 56 s P rev
F 21 CGC GGC GCC AAT CTT GA 1762 56 s P rev
F 22 GAA GACCAC GCG AGC AGA 1436 58 s S rev
F 26 AAG AAG TGG ACA ACC AGC AA 1360 58 s S rev
F 27 TAT TGC CGC GCA CTT CCA T 1500 58 g S rev
Tab. 10: Zur Pilzdetektion eingesetzte Oligonukleotide. Die Buchstaben in der Sequenz- Spalte stellen die einzelnen Basen der DNA dar: A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin. Andere Buchstaben stellen wechselnde Basen stellvertretend dar: Y = T oder C; R =
A oder G; M = A oder C; K = T oder G; W = T oder A; S= C oder G; I = Inosin. Weitere Abkürzungen: Position = erstes Nukleotid am 5’-Ende des Oligonukleotids bei Forward-
Orientierung bzw. erstes Nukleotid am 3’-Ende bei Reverse-Orientierung; Tm = Schmelztemperatur des Primers in °C; u = universell; g = genusgruppenspezifisch; s = speziesspezifisch; P = PCR-Primer; S = Hybridisierungssonde; rev = Reverse-Orientierung;
forw = Forward-Orientierung.
2.5.6 Oligonukleotide für Fusarien
Name Sequenz Tm taxon Ebene Orientierung
Fus 1b CCC TGG AGC CCA AGC 54 g P rev Fus 2b CAG CGT ACT GCC AAA GCA 54 g P rev Fus 2c ACG GTA CTG CCA AAG CAA 54 g P rev
Tab. 11: Zur Detektion von Fusarien eingesetzte Oligonukleotide. Die Buchstaben in der Sequenz-Spalte stellen die einzelnen Basen der DNA dar. A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin. Weitere Abkürzungen: Tm = Schmelztemperatur des Primers in °C; g =
genusgruppenspezifisch, P = PCR-Primer, rev = Reverse-Orientierung.
2.5.7 Digoxiginierte Oligonukleotide zur DNA-DNA-Hybridisierung
Oligonukleotid Sequenz Position Tm Orientierung
F 4b ATC RTC TTC GAT CCC CTA AC 1040 58°C forw
F 10 GST GCT AGC WTT TGC TGG T 1422 58°C forw
F 22 GAA GAG CAC CCG AGC AGA 1436 58°C rev
F 26 AAG AAG TGG ACA ACC AGC AA 1360 58°C rev
F 27 TAT TGC CGC GCA CTT CCA T 1500 58°C rev
Tab. 12: Im Rahmen der DNA-DNA-Hybridisierung eingesetzte Sonden. Die Buchstaben in der Sequenz-Spalte stellen die einzelnen Basen der DNA dar: A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin. Andere Buchstaben stellen wechselnde Basen stellvertretend dar: R= A
oder G; W = T oder A. Weitere Abkürzungen: Position = erstes Nukleotid am 5`-Ende bei Forward-Orientierung bzw. erstes Nukletid am 3`-Ende bei Reverse-Orientierung; Tm =
Schmelztemperatur des Primers in °C; rev = Reverse-Orientierung; forw = Forward- Orientierung.
2.5.8 Geräte
Gerät Hersteller Brutschrank Hereaus Sepatech, Göttingen
CCD-Kamera CS 1 Cybertech, Berlin Dynal MPC-E magnetic separator Dynal, Hamburg
Fluoroscan II Titertek Flow Laboratories, Meckenheim GeneAmp PCR tubes Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA GeneTouch (PCR-Machine) Techne, Mineapolis, USA
Hochfrequenzrüttler Mickle Laboratory, Gomshall, UK Hybridisierungsröhren MHH Werkstätten, Hannover
Hybridisierungsofen Bachofer, Reutlingen
Minifold II Slotblotgerät Schleicher und Schuell, Dassel Microshaker, Dynatech Dynal, Hamburg
Nitrocellulosemembran BA 85 Schleicher und Schuell, Dassel NucTrap Probe Purification Columns Stratagene, Cambridge, UK
Photometer Pharmacia, Freiburg
Schüttler New Brunswick Scientific, Edison, USA
Spannungsgeräte Biorad, München
Thermocycler GeneAmp 9600 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, USA Thermocycler Twinblock System Ericomp Inc., San Diego, USA
Thermoschüttler Eppendorf, Hamburg
Vakuumzentrifuge Speedvac SVC 100 Savant, Farmingdale, New York, USA Whatman 3M Saugpapier Schleicher und Schuell, Dassel Zentrifuge: Omnifuge 2.0 RS Heraeus Sepatech, Göttingen Zentrifuge: Biofuge 15 Heraeus Sepatech, Göttingen
Tab. 13: Eingesetzte Geräte.
2.5.9. Pilzkulturen, Pilzlösungen und sonstige Materialen
Die Pilzkulturen, aus denen Lösungen zur Analyse erstellt wurden, sowie die bereits vorliegenden DNA-Lösungen von A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata und C. krusei entstammten der Sammlung des Instituts. Die Ringversuch-Proben verschiedener Pilze stammten aus der Ringversuch-Reihe von 2001.
Weiter kamen DNA-Molekulargewichtsmarker (Gibco/BRL, Eggenstein) mit einer Größe der Fragmente in Basenpaaren: 12216, 11198, 10180, 9162, 8144, 7126, 6108, 5090, 4072, 3054, 2036, 1635, 1018, 516/506, 394, 344, 298, 220/201, 154, 75 zum Einsatz. Außerdem wurden Eppendorf-Gefäße und 5 ml-Einmal-Kunststoff- pipetten (beides Eppendorf) sowie Falcon-Röhrchen und eine Neubauer-Zählkam- mer verwendet. Abklatschpräparate wurde mittels transparentem Klebestreifen gewonnen.
2.6 Aufarbeitung der Proben
2.6.1 Vorbereitung von festen Gewebsproben
Punktate und Blut konnten ohne Vorbehandlung in den nachfolgenden Schritten ein- gesetzt werden74. Feste Gewebsproben mussten zuvor zerkleinert werden: Die Ge- websbiopsate wurden steril in einer Petrischale mit einem Einmalskalpell zerkleinert.
Zur Resuspension wurden Wasser, das zu Transportzwecken als Medium gedient hatte, oder 250 µl reines Wasser verwendet. Zu der so entstandenen wässrigen Lösung wurden 50 µl Glassbeads-Pulver zugefügt. Nach fünfminütiger Hochfre- quenz-Rüttelung wurde die Lösung kurz zentrifugiert (5 s mit 8.000 RPM; rounds per minute). In die weitere Analyse gingen sowohl der Überstand als auch die getrennte untere Phase mit Zellschutt- und Glassbeads-Bestandteilen ein.
Alle weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgten identisch für festes und flüssiges Ma- terial.
2.6.2 Befreiung der Proben von humanem Zellmaterial
Die flüssigen Patientenproben bzw. Negativkontroll-Proben wurden in 50 ml Falcon- Röhrchen umgefüllt. Zur Zerstörung humaner Zellenbestandteile wurden 15 ml 2 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)-Lösung zugesetzt. Probenflüssigkeit und SDS-Lösung wurden durch dreimaliges Schwenken vermischt und 10 min bei Raumtemperatur aufbewahrt. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation mit 6.000 G bei 15 °C für 30 min. Die wässrige Lösung über dem infolge der Zentrifugation abgesetzten Pellet wurde abgegossen. Das Pellet wurde mit 1 ml reinstem Wasser von der Gefäßwand aufgespült, resuspendiert und in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach erneuter Zentrifugation dieser Lösung über 10 min bei Raumtemperatur mit 9.000 RPM wurde der wässrige Überstand abpipettiert und das Pellet aus diesem Zentrifugationsschritt erneut in 1 ml reinem Wasser gelöst, nochmals bei 9.000 RPM für 10 min zentrifu- giert und der Überstand mit einer Pipette abgenommen. Nach der so erreichten Befreiung der eingesandten Proben von humanen Zellen wurde das Pellet des dritten Zentrifugationsschrittes entweder sofort mittels Pilzlyse weiter für die PCR vorbereitet oder bei - 80 °C gelagert.
2.6.3 Positivkontrollen
Bei den weiteren Arbeitsschritten nach Entfernung von humanen Zellbestandteilen wurden neben Negativkontrollen von Gesunden auch Positivkontrollen zur Testung der Funktion der einzelnen Arbeitsschritte mitgeführt. Die Positivkontrollen mit Pilz- DNA wurden der Stammsammlung des Instituts entnommen. Bis auf den verein- zelten Einsatz von mit Candida-Zellen versehenen Blutproben wurden im Regelfall
erst in den unten geschilderten Lyse-Schritten durch Auszählung in der Neugebauer- Zählkammer definierte Mengen an Candida-Zellen (2.000 bis minimal 4 Zellen) eingesetzt. Diese dienten zur Qualitätstestung der Lyse-Schritte. In der jeweiligen PCR wurde eine Verdünnungsreihe von DNA-Lösungen der nachzuweisenden Pilz- spezies eingesetzt. Bei der Aspergillus-PCR wurde A. fumigatus-DNA mit der kleins- ten Menge von ca. 50 fg (Femtogramm) verwendet. C. albicans-DNA wurde in einer Verdünnungsreihe mit minimal 10 fg und zur Probe der spezifischen Primer F 21 und F 26 höher konzentrierte Lösungen der jeweiligen DNA von C. krusei und glabrata eingesetzt. Bei Einsatz der universellen PCR konnten wahlweise entweder Aspergil- lus- oder Candida-DNA oder beide eingesetzt werden.
2.6.4 Wasser als Negativkontrolle
Ebenfalls nach dem Arbeitsschritt des Entfernens humaner Blutbestandteile und vor Beginn der Lyse-Schritte wurde jede vierte Probe mit reinem Wasser als Negativkon- trolle mitgeführt. Auch in der folgenden PCR wurden diese als Negativkontrollen eingesetzt und mitgeführt. In der sich daran anschließenden PCR wurden zu den bereits verwendeten Negativkontrollen noch alle vier Proben weitere aus reinem Wasser bestehenden Proben mitgeführt. Sie dienten als reine PCR-Kontrollen, denn ihre Kontamination konnte nur im Rahmen der PCR erfolgen.
2.6.5 Zerstörung der Pilzzellwände zur DNA-Freisetzung Allgemeines
Folgende Prinzipien der Pilzlyse wurden nacheinander eingesetzt: Enzymatische Lyse (Lyticase und Yeast-Lytic-Enzymes mit beta-1,3-Glucanase-Aktivität) und che-
mische Lyse mittels SDS sowie mechanische Lyse (Rütteln mit Glassbeads) und erneute chemische Lyse (Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol, NaOH)75.
Lyticase-Präparation und chemische Lyse mittels SDS
Auf das Pellet mit den möglicherweise isolierten Pilzzellen wurden 89 µl Wasser, 1 µl des Enzyms Lyticase (25.000 U/l) und 10 µl des entsprechenden Puffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 % Triton-X-100) gegeben. Unter Katalyse des Enzyms, das eine -1,3-Glucanase Aktivität besitzt, wurden die Zellwandglucane in einem Gesamtvolumen von 100 µl während 45 min bei 37 °C im Schüttler hydrolytisch gespalten. Anschließend erfolgte im Schüttler bei 65 °C ein 45-minütiger Zellmembran-Lyseschritt mit SDS in einer Konzentration von 1,5 %.
Mechanische Lyse und Phenol-Extraktion und Alkohol-Präzipitation von DNA
Zu den 100 µl wässriger Lösung wurden 30 µl Glassbeads gelöst in Wasser, 270 µl Wasser, 1 µl Glykogenlösung als Präzipitationshilfe und 30 µl des bereits im ersten Lyseschritt eingesetzten 10 x Puffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 % Triton-X-100) beigefügt. Anschließend wurde dieser Mischung 400 µl Phenol/Chloro- form/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) hinzugefügt. Das Gemisch wurde 3 min geschüttelt und die wässrige Phase von der Phenolphase durch 5-minütige Zentrifugation mit 15.000 G bei 18 °C wieder getrennt. Die Phenol-Phase wurde verworfen. Die wässrige Phase wurde mit 3 M Natriumacetat pH 5,2 auf eine Salzkonzentration von 0,15 M gebracht und mit einem gleichen Volumen Isopropanol versetzt und geschüt- telt. Nach einer Präzipitationsphase von mindestens zwei Stunden bei - 20 °C er- folgte eine erneute 20-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 15.000 G. Das aus diesem Schritt entstandene Pellet wurde zweimal mit - 20 °C kaltem 70 % Ethanol gewaschen, wobei jeweils 10 min bei 4 °C mit 15.000 G zentrifugiert wurde. Der
Überstand wurde jedes Mal verworfen und das Pellet abschließend 20 min in der Vakuumzentrifuge (Speedvac) getrocknet. Die gereinigte Nukleinsäure wurde in 75 µl Aqua bidest. resuspendiert und entweder direkt mittels PCR weiter analysiert oder bei - 20 °C bis zur späteren Amplifikation gelagert.
2.7 Polymerasekettenreaktionen
2.7.1 Genus- bzw. speziesspezifische Pilz-PCR
Je nach Fragestellung wurden verschiedene PCR-Verfahren eingesetzt: Genus- bzw.
speziesspezifische PCR-Verfahren oder eine universelle Pilz-PCR zum Pilznachweis. Zu 60 µl des jeweiligen „Master-Mix“ (s. u.) wurden 15 µl der in den oben genannten Schritten der Pilzlyse hergestellten, fraglich Pilz-DNA enthaltenden Lösung hinzugefügt.
Bei allen genus- bzw. speziesspezifischen PCR-Untersuchungen wurde der univer- selle Forward-Primer F 3b eingesetzt und um die genus- oder speziesspezifische Revers-Primer ergänzt. Diese waren für Aspergillus der Primer F 1523, 74, 76-79
, für Fu- sarium die Primer Fus 2b oder Fus 2c und für Candida die Primer F 16 (C. albicans- Gruppe), F 19 (C. glabrata) und F 21 (C. krusei).
Ansatz pro Probe:
- H2O 37, 5 µl,
- dNTP (desoxy-Nucleotid-Triphosphat) 12 µl, - 10 x Puffer 7, 5 µl,
- Taq-Polymerase 0,35 µl, - Forward-Primer F 3b 1, 5 µl
und
- Revers-Primer F 15 (Aspergillus) 1,5 µl oder
- Fus 2b oder Fus 2c (Fusarium) 1,5 µl oder
- 0,5 µl F 16, F 19 und F 21 (Candida) 1,5 µl.
Die zunächst sowohl für die universelle als auch für die spezifische PCR verwendete Taq-Polymerase war eine hitzeaktivierte Taq - das Enzym wird durch eine länger an- haltende Temperaturerhöhung auf 72 °C aktiviert. Der folgende Amplifikationszyklus wurde dann insgesamt 46-mal durchlaufen. Zunächst erfolgte eine Erhitzung auf 96 °C, im ersten Durchgang für 120 s, in allen weiteren für 10 s. Dieser Arbeitsschritt diente der Denaturierung der Pilz-DNA, d. h. der Teilung der Doppelstrang-DNA in Einzelstränge. Der zweite Schritt war das Annealing des Primers, d. h. die Anlage- rung des Primers an die einzelsträngige DNA bei 54 °C für 120 s. Durch die Taq- Polymerase erfolgte nun im Schritt der Extension bei 72 °C für 120 s die Verlänge- rung des Primers. Als letzter Schritt nach komplettem Durchlaufen des Amplifika- tionszyklus kommt es zum vollständigen Abschluss der Doppelstrangsynthese.
Im Verlauf der Untersuchung wurde das Verfahren modifiziert und die letzten 142 Proben wurden mit einer Hot-Start-Taq-Polymerase amplifiziert. Wie beim ersten Verfahren wurden 15 µl des aus der Lyse gewonnenen DNA-Materials mit 60 µl PCR-Ansatz vermischt, dieses allerdings bei Raumtemperatur. Die erste Erhitzung erfolgte ebenfalls auf 96 °C, jedoch nicht für 120 s, sondern nur für 20 s. Der weitere Amplifikationszyklus war identisch.
2.7.2 Agarosegel-Elektrophorese
Nach der Vervielfachung der möglichen DNA-Bestandteile aus den jeweiligen Proben wurden die Fragmente mit Hilfe von 0,7 - 1 %igen Agarosegelen aufgetrennt. Hierfür wurden zwischen 1,05 bis 1,5 g Agarosepulver in 150 ml 10 x TAE-Elektrophorese- puffer (108 g Tris, 55 g Borsäure, 7,4 g EDTA, Aqua bidest ad 1 l) gelöst, für kurze Zeit in der Mikrowelle aufgekocht und anschließend nach Abkühlung kurz oberhalb des Verfestigungspunktes des Gels in eine Agaroseflachgel-Apparatur gegossen.
Zwecks Aussparung der Geltaschen zur PCR-Produkt-Bestückung wurden vorher Kämme mit 30 oder 60 Zähnen eingehängt. Nach Erhärtung des Gels wurde in jede Tasche ein Gemisch aus PCR-Produkt und Orange-G-Ladepuffer pipetiert und an- schließend eine ca. 30-minütige Auftrennung bei einer elektrischen Spannung von 7,5 V/cm durchgeführt. Danach wurde das Gel in einem Bad mit dem interkalierend wirkenden Ethidiumbromid für 10 min angefärbt und im Anschluss für 20 min in Was- ser gewaschen. Durch UV-Bestrahlung mit 254 nm wurden mögliche DNA-Banden zur Fluoreszenz angeregt und fotografiert oder digital gespeichert (siehe Abb. 1).
Das Darstellen der Banden nach Durchwanderung des Agarosegels diente der qua- litativen Kontrolle der PCR. Die zugesetzten definierten DNA-Mengen der gesuchten Pilzspezies waren als Positivkontrollen als sichere Bande sichtbar. Kleinere Mengen von DNA können nicht als Bande sichtbar gemacht werden, sondern nur im noch folgenden Schritt der Hybridisierung nachgewiesen werden.
Abb. 1: Beispiel des Ergebnisses einer Agarosegel-Elektrophorese. KB = Kontrollbande; NK
= Negativkontrolle (Wasser); A = Aspergillus-DNA (1 = 10-3; 2 = 10-4; 3= 10-5; 4 = 10-6); C = Candida 1 - 5 C. albicans-DNA (1 = 10-2; 2 = 10-3; 3 = 10-4; 4 = 10-5; 5 = 10-6); C7 = C. krusei-
DNA.
2.7.3 Hybridisierung der PCR-Produkte
Sehr geringe Mengen von fungaler DNA als Input bei einer PCR bedingen auch ge- ringere Mengen an nachweisbarem PCR-Produkt. Häufig reichte diese Menge nicht aus, eine Bande nach oben beschriebener Auftrennung mittels Gelelektrophorese zu erreichen. Zum genaueren Nachweis von möglichen positiven Proben wurde an- schließend eine DNA-DNA-Hybridisierung durchgeführt65, 80. Hierzu wurden in eine Mulde einer Mikrotiterplatte 10 µl des PCR-Produktes und 50 µl einer Dynabeads- Lösung der Konzentration 2 µg/µl, die vorher zweimal mit einem Binding-Washing- Puffer gewaschen worden war, gegeben. Es folgte eine 20-minütige Durchmischung auf einem Rüttler (Microshaker). Die Dynabeads waren mit Streptavidin markiert und banden sich an das Biotin des biotinierten Forward-Primers F 3 der PCR-Produkte.
Streptavidin ist ein Eiweiß, das aus vier identischen Untereinheiten aufgebaut ist und von Streptomyces avidinii synthetisiert wird. Es geht eine der stärksten nicht kovalen- ten Bindungen mit dem Vitamin Biotin ein.
Zur Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden DNA wurde die Lösung aus PCR-Produkt und Dynabeads mit 100 µl einer 0,1-molaren NaOH-Lösung versetzt
und erneut 10 min gerüttelt. Dann wurden die mit den Dynabeads verbundenen, nun einsträngigen PCR-Produkte mit 100 µl TE-Puffer auf einer Magnetunterlage ge- waschen. Durch die magnetische Unterlage wurden die metallischen Dynabeads mit der gebundenen DNA nach unten in der Mulde gezogen, so dass die darüber be- findliche Flüssigkeit abpipettiert werden konnte.
Die eigentliche Hybridisierung erfolgte mit dem Verbund aus PCR-Amplifikat und Streptavidin-markierten Dynabeads. Der jeweiligen Probe wurden 50 µl Hybridisie- rungslösung mit 6 pmol der entsprechenden digoxigenierten Sonde zugefügt. Digoxi- genin, ein Desoxyuridintriphosphat (dUTP) gebunden. Im Anschluss folgte für 50 min die Hybri- disierung in einem Brutschrank knapp unterhalb des Schmelzpunktes des jeweils verwendeten Oligonukleotids. Nachfolgend wurde der Überstand der Dynabeads ern- eut über einer Magnetplatte entfernt und mit 100 µl 4 x SSC Tween 20 bei Raumtem- peratur gewaschen. Das Waschen wurde zweimal im Wasserbad bei der Schmelz- temperatur der Oligonukleotide mit vorgewärmter 4 x SSC wiederholt. Der Überstand wurde jeweils mit Hilfe der magnetischen Unterlage aufgenommen. Dabei musste ein Abkühlen der Proben durch rasches Arbeiten verhindert werden.
Der nächste Schritt war die Antikörpermarkierung mit 50 µl Antidigoxigenin-Antikör- perreagenz (1 % BSA, bovines Serumalbumin, in PBS, phosphate buffered saline/phosphatgepufferte Salzlösung) mit anschließendem Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur. Vor der abschließenden Substratumsetzung wurden mittels dreifacher Waschung mit PBS 0,05 Tween bei Raumtemperatur alle nicht gebundenen Antikörper entfernt. Abschließend wurde der jeweiligen Probe 50 µl Substrat mit 4-Methyl-Umbiliferylphosphat der Konzentration 40 µg/ml zugefügt. In
lichtgeschützter Umgebung wurde dieses Gemisch für 90 min unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert und nach 30, 60 und 90 min flourometrische Messungen bei 355 nm/460 nm (Anregung/Emission) im Titertek Flouroscan II durchgeführt. Als positiver Nachweis von Pilz-DNA galt ein Fluoreszensergebnis oberhalb der doppelten Standardabweichung (Cut-off) aller Negativkontrollen.
2.8 Universelle Pilz-PCR
2.8.1 Grundlagen
Für eine universelle Pilz-PCR wurden die Primer F 2 oder F 3b und F 8 verwendet.
Mit ihnen ist die DNA einer großen Menge von unterschiedlichen Pilzspezies repli- zierbar81, 82.
Ansatz pro Probe:
- H2O 37, 5 µl, - dNTP 12 µl, - 10 x Puffer 7,5 µl,
- Taq-Polymerase 0,35 µl,
- Forward-Primer F 2 oder F 3b 1,5 µl, - Revers-Primer F 8 1,5 µl.
Bei der Durchführung der universellen Pilz-PCR wurde die Ericomp-Maschine be- nutzt. Statt der üblichen 46 Replikationszyklen wurden wegen der großen DNA- Menge nur 32 durchgeführt, da mit diesem Protokoll Kulturisolate amplifiziert wurden.
Dann erfolgte wie oben beschrieben eine Agarosegel-Elektrophorese zur Qualitäts- kontrolle. Statt der Hybridisierung, die zur Quantifizierung replizierter DNA bei be- kannter Spezies dient, erfolgte eine DNA-Sequenzierung zur Speziesbestimmung.
2.8.2 DNA-Sequenzierung
Für die Sequenzierung wurde ein nichtradioaktives Verfahren, modifiziert nach San- ger83, verwendet. Zur Sequenzierung wurde ein „Taq-Cycle-Sequencing“ durchge- führt, bei dem Didesoxynukleotide, die an unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe ge- koppelt sind, zu einem Abbruch der Elongation führen. Durch Elektrophorese wurden die durch Fluorochrome markierte DNA aufgetrennt, die Fluoreszenzfarbstoffe mit Hilfe eines Lasers angeregt und deren Absorptionsmaxima gemessen.
Es wurden 100-250 ng PCR-Produkt eingesetzt, 5 - 10 pmol Oligonukleotid- und 4 µl Dye-Terminator-Mix zugefügt und mit Aqua dest. auf 10 µl Gesamtvolumen aufge- füllt. Das „Taq-Cycle-Sequencing“ beinhaltete 25 Zyklen, die jeweils wie folgt ablie- fen: Initial bei 96 °C die 10-sekündige DNA-Denaturierung, anschließend das Primer- Anealing bei 56 °C für 5 s und danach die vierminütige Elongation bei 60 °C. Im An- schluss wurden die Reaktionsansätze in neue Eppendorf-Gefäße überführt. Zur Auf- reinigung wurden je 2 µl Na-Acetat-Lösung (3 M, pH 5,2) und 50 µl absolutes Ethanol hinzugefügt und für 10 min bei 0 °C inkubiert. Nach Zentrifugation mit 13.000 G für 25 min wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 250 µl 70 % Ethanol ge- waschen. Nach Trocknung in der Speed-Vac wurde dann in 4 µl Sequenzier-Lade- lösung (5 Teile Formamid; 1 Teil 25 mM EDTA; Dextranblau 50 mg/ml) resuspen- diert. Vor dem Auftragen auf das Sequenzgel wurden die Proben für 2 min auf 95 °C erhitzt und im Anschluss auf Eis gelagert. Die Verwendung des Gels wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
Die Sequenzierplatten wurden vor dem Zusammenbau mit Alkonox und entminerali- siertem Wasser gereinigt und mit Isopropanol nachbehandelt sowie getrocknet. Es wurden 30 g Harnstoff und 7,5 ml Acrylamid (40 %) in 23,5 ml Aqua dest. bei 37 °C
unter leichtem Rühren für die Herstellung des Sequenzierungsgels gelöst. Nach Zu- gabe von 6 ml 10 x TBE Puffer (890 mM Tris-HCl; 890 mM Borsäure; 20 mM EDTA, pH 8) erfolgte die sterile Filtration der gesamten Lösung.
Zuletzt wurden 350 µl 10 % APS (Ammoniumpersulfat) und 15 µl TEMED (Tetramethylethylendiamin) zugeben, vermischt und vorsichtig ohne Luftblasen das Gel gegossen. Nach 60 - 120 min wurde das Gel nach Polymerisation der Matrix in das Sequenzierungsgerät eingebaut. 1 x TBE-Puffer wurde in die Laufpufferkammern gefüllt und die elektrophoretische Auftrennung mit Laser- Scannung nach Beladung der Kammern gestartet. Nach einem ungefähr 15 Stunden dauernden Sequenzierungslauf erfolgte die Auswertung der gewonnen Daten mit der Hilfe der 373A Strech-ABI-Originalsoftware (Applied Biosystems), die durch Genom- Abgleich die vorliegende Pilzspezies identifizieren kann.
3 Ergebnisse
3.1 Verteilung der Proben und Patientenstruktur
Es wurden 315 Proben von 136 unterschiedlichen Patienten untersucht, die im Zeit- raum von April 2000 bis September 2001 zur Untersuchung auf eine invasive Pilzin- fektion eingesandt worden waren. In 293 Fällen handelte es sich um EDTA-Blut und 15 entfielen auf Proben aus bronchoalveolären Lavagen (BAL); je einmal wurde Bronchialsekret bzw. Material aus einer Bronchialabsaugung eingesandt. Bei einem Patienten wurden jeweils eine Probe eines Pleura- und eines Perikardergusses so- wie eine Perikardbiopsie entnommen. Zweimal wurde eine Hautbiopsie eingeschickt.
Aufgrund zu geringer Blutmengen wurden in vier Fällen je zwei und einmal drei zeit- gleich gewonnene EDTA-Blutproben eines Patienten gepoolt. Insgesamt lagen damit 309 Proben zur Untersuchung vor. Elf dieser Proben, darunter die beiden Hautbiop- sien, wurden ausschließlich auf eine Fusarien-Infektion hin untersucht. In sechs Fäl- len wurde aufgrund von Fehlern während der Analyse kein verwertbares Ergebnis erzielt. Es handelte sich um Proben von drei verschiedenen Patienten, in zwei Fällen konnten weitere Proben korrekt ausgewertet werden. Die Untersuchung des Peri- kardgewebes sowie des Pleura- und Perikardergusses ergab wegen Inhibition der PCR durch zu hohen Anteil humaner DNA kein valides Ergebnis. Von den verblei- benden 289 Proben wurden alle auf eine Candida-Infektion und 272 zusätzlich auf Aspergillus-DNA hin untersucht.
In den Tab. 14 und 15 sind Alter und Grunderkrankungen der Patienten dargestellt.
Durchschnittlich wurden 2,3 Proben je Patient untersucht (siehe Tab. 16).
Lebensalter n =
0 - 1 Jahr 6
2 - 5 Jahre 10 6 - 10 Jahre 9 11 - 20 Jahre 17 21 - 30 Jahre 15 31 - 40 Jahre 21 41 - 50 Jahre 18 51 - 60 Jahre 26 61 - 70 Jahre 8 71 - 80 Jahre 5
> 80 Jahre 1
Tab. 14: Altersverteilung der Patienten.
Diagnose Anzahl
Akute myeloische Leukämie 29
Akute lymphatische Leukämie 21
Chronisch myeloische Leukämie 10
Andere hämatologische Erkrankungen 8
Morbus Hodgkin 1
Non-Hodgkin-Lymphom 3
Plasmozytom 4
Solider Tumor 10
Kardiologische Erkrankung (davon herztransplantiert) 9 (2)
Neurologische Erkrankung 4
Nierentransplantation 3 Lebererkrankung (davon lebertransplantiert) 8 (4)
Lungen-Erkrankung (davon lungentransplantiert) 12 (7)
HIV 3
Andere Erkrankungen 7
Grunderkrankung unbekannt 4
Davon insgesamt knochenmarktransplantiert 52
Tab. 15: Hauptdiagnosen der Patienten.
Probenanzahl Häufigkeit
Einzelprobe 58 x
2 Proben 38 x
3 Proben 19 x
4 Proben 6 x
5 Proben 6 x
6 Proben 3 x
7 Proben 4 x
10 Proben 1 x
14 Proben 1 x
Tab. 16: Verteilung der Probenanzahl je Patient.
3.2 PCR-Ergebnisse
3.2.1 Candida-PCR
Das molekulargenetische Nachweisverfahren für die drei Candidaspezies C. albi- cans, C. glabrata und C. krusei war am zuverlässigsten zu evaluieren. Eine Konta- mination trat nicht auf. Es wurden insgesamt 289 Proben von 136 Patienten auf Can- didämie untersucht. Bei fünf Proben eines Patienten war das Ergebnis nach regel- rechter Probenaufarbeitung und -reinigung bei Vorliegen einer Inhibition wegen zu hoher humaner DNA-Anteile in Punktatflüssigkeiten nicht verwertbar, zwei weitere Proben desselben Patienten konnten analysiert werden. Bei 20 der 136 Patienten bestand nach den EORTC-Kriterien eine mögliche oder gesicherte Candida-Infek- tion, in 14 dieser Fälle war auch die PCR für C. albicans positiv. Bei 6 der 20 Patien- ten gelang ein PCR-Candida-Nachweis trotz klinisch möglicher oder gesicherter In- fektion nicht. Von 116 untersuchten Patienten mit unwahrscheinlicher Candida-Infek- tion hatten 114 ein negatives Ergebnis, in zwei Fällen war das PCR Ergebnis positiv.
C. krusei und glabrata-DNA konnten in den eingesandten Proben nicht nachgewie- sen werden.
Damit ergibt sich eine patientenbezogene Sensitivität der Candida-PCR von 70 %.
Die Spezifität betrug 98,3 %, der positive Vorhersagewert 87,5 %. Der negative Vor- hersagewert wurde nicht berechnet, da unterschiedlich viele Proben (siehe Tab. 16) pro Patient untersucht wurden und auch bei den Patienten mit disseminierter Candida-Infektion nicht alle untersuchten Blutproben in der PCR positiv waren.
PCR-Ergebnis aus Probe ID Alter
[Jahre]
Grunderkrankung Klinik EORTC-Einteilung
EDTA BAL
Bemerkung
BC 28 Non-Hodgkin-
Lymphom, Z. n. KMT
Fieber unwahrscheinlich 1 falsch pos. Weitere Proben vor und nach pos.
Probe neg.
BK 70 Schlaganfall Candida-Sepsis gesichert 2 neg. Unter Therapie
BM 64 Unbekannt Fieber möglich 1 pos. ZVK-Spitze Candida-infiziert
BO 77 Pneumonie Pneumonie möglich 1 pos. Weitere Probe neg.
Beide BAL pos. auf Aspergillus BR 55 Akut myeloische
Leukämie, Z. n. KMT
Nekrot. Ösophagitis gesichert 1 pos. Zwei Tage zuvor entnommene Probe neg.
FM 2 Kongenitaler Herzfehler Candida-Sepsis gesichert 2 neg.
GM 4 Aplastische Anämie Fieber unwahrscheinlich 1 falsch pos. Probe zwei Monate später neg.
HD 10 Septische
Granulomatose
Pneumonie gesichert 1 pos. Unter Therapie nach Resektion neg.
BAL und neg. Blutprobe HK 33 Akut lymphatische
Leukämie
Fieber gesichert 2 pos. Kontrolle nach einem Monat neg.
Aus einer Probe deutlich pos.
Aspergillus-Befund KH 32 Z. n. Re-Doppel-
Lungen-Transplantation
V. a. Pneumonie möglich 1 pos.
MM 21 Akut lympathische Leukämie, Z. n. KMT
Fieber möglich 1 pos. Unter Therapie weitere 6 Proben neg.
MN 1 Solider Tumor Fieber möglich 1 pos.
RH 16 Morbus Hodgkin Sepsis möglich 2 pos.
PCR-Ergebnis aus Probe ID Alter
[Jahre]
Grunderkrankung Klinik EORTC-Einteilung
EDTA BAL
Bemerkung
SC 46 Aspergillus-Pneumonie Pneumonie möglich 1 pos. Am gleichen Tag pos. Aspergillus-
Befund. Proben zwei Monate zuvor und drei Monate danach neg.
SD 21 Akute T-Zell-lympha- tische Leukämie, Z. n.
KMT
Sepsis gesichert 2 neg. 5 x PCR aus technischen Gründen nicht
auswertbar
SD 40 Akut myeloische Leukämie, Z. n. KMT
Fieber möglich 1 pos.
SS 24 M. Kostmann, Z. n.
KMT
Fieber möglich 1 pos.
TA 57 B-Zell lymphatische Leukämie
Fieber möglich 1 pos. Gepoolte Probe
WG 64 Mechanischer
Aortenklappenersatz
Fieber gesichert 1 pos. Kontrollen unter Therapie neg.
VE 59 Unbekannt Soor-Ösophagitis gesichert 1 neg.
VR 46 AIDS Soor-Ösophagitis gesichert 2 neg.
BS 25 Z. n. Leber- Transplantation
Candida- Endokarditis
gesichert 2 neg. 2. Probe unter Therapie
Tab. 17: Auflistung der Patienten mit klinisch möglicher oder gesicherter Candida-Infektion nach EORTC-Kriterien sowie der Patienten mit positivem PCR-Ergebnis trotz unwahrscheinlicher Infektion. ID = Identifkationskürzel; KMT = Knochenmarktransplantation;
BAL = Bronchoalveoläre Lavage; pos. = positiv; neg. = negativ.
Zahl der Pat. nach EORTC-Einstufung
Positives PCR- Ergebnis
Negatives PCR- Ergebnis
gesichert 10 4 6
wahrscheinlich 0 0 0
möglich 10 10 0
unwahrscheinlich 116 2 114
Tab. 18: Häufigkeit der Übereinstimmung von EORTC-Einteilung und Candida-PCR- Ergebnis (Auswertung auf einzelne Patienten bezogen).
3.2.2 Aspergillus-PCR
Es wurden 272 Proben von 132 Patienten auf Aspergillus-DNA untersucht. Wegen des weiter unten geschilderten Problems der Kontamination des Aspergillus-PCR- Nachweises konnten nicht wie ursprünglich geplant alle Proben auf Aspergillus-DNA hin ausgewertet werden. Von den untersuchten Proben konnte bei 10 Proben das Ergebnis aufgrund einer positiven Negativkontrolle nicht verwertet werden. Auswert- bare positive PCR-Ergebnisse wurden aus 28 Proben von 23 Patienten erhoben (siehe Tab. 19). In zwei Fällen war aus derselben Probe das Ergebnis der Candida- PCR ebenfalls positiv (Identifkationskürzel/ID: BO, SC). In sieben Fällen gab es kli- nisch keine Hinweise auf eine invasive Pilzinfektion. Fälle mit nach EORTC-Eintei- lung möglicher, wahrscheinlicher oder gesicherter IA ohne positive PCR gab es nicht.
In der Mehrzahl der Fälle lag eine Panzytopenie nach stattgehabter Knochenmark- transplantation (autolog: 2; allogen: 8, davon allo-familiär: 3) aufgrund unterschied- licher maligner hämatopoetischer Systemerkrankungen vor.
Hieraus ergibt sich eine patientenbezogene Sensitivität von 100 % für mögliche, wahrscheinliche und gesicherte Fälle von IA. Die Spezifität für die 122 auswertbaren Patienten betrug 92,9 % bei einem positiven Vorhersagewert von 76,7 %. Der ne-
