Mit der vorgestellten Untersuchung konnte die PCR als schnelles und zuverlässiges Verfahren zum Nachweis von invasiven Candida- und Aspergillus-Infektionen bestä-tigt und weiter evaluiert werden. Sensitivität (Candida-PCR 70 %, Aspergillus-PCR 100 %) und Spezifität (Candida-PCR 98,3 %; Aspergillus-PCR 92,9 %) der PCR sind hoch, der positive Vorhersagewert (Candida-PCR 87,5 %; Aspergillus-PCR 76,7 %) variiert dagegen deutlich. Die PCR-Methode für Aspergillus konnte durch Einfügen eines Dekontaminationsschrittes weiter verbessert werden, ohne dass die Sensitivität der Methode darunter litt. Die Sensitivität von 1 Spore/µl ist vergleichbar oder besser als die von einschlägigen deutschen und europäischen Laboren übermittelten Werte.
Darüber hinaus war das benutzte Verfahren durch geringfügige Modifikation - Aus-tausch des reversen Primers - auch zum Nachweis anderer Spezies, hier von Fusa-rien, mit Erfolg einzusetzen. Darüber hinaus bietet das mituntersuchte universelle PCR-Verfahren mit nachfolgender Sequenzierung des PCR-Amplifikates bei Ver-dacht auf fungale Infektion zukünftig die Möglichkeit einer relativ raschen spezies-spezifischen Diagnostik.
5 Zusammenfassung
Antimykotika werden oft schon bei geringem Verdacht auf eine systemische Pilzin-fektion oder auch prophylaktisch bei Risikopatienten eingesetzt. Dies ist mit nicht un-erheblichen potentiellen Nebenwirkungen verbunden und stellt darüber hinaus einen erheblichen Kostenfaktor dar. Die freizügige Indikationsstellung gründet unter anderem auf der unzureichenden Sensitivität und Spezifität der verfügbaren Diagno-severfahren sowie dem Zeitverlust bis zur Diagnosesicherung.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob eine zuvor entwickelte65 An-reicherung von Pilzzellen aus dem Blut und eine PCR mit anschließender Hybridisie-rung zur sicheren und raschen Diagnostik bestimmter Pilzinfektionen - insbesondere mit Candida- und Aspergillus-Spezies - aus dem peripheren Blut sowie aus anderem Probenmaterial geeignet ist.
Dazu wurden 315 Blut- und andere Proben von 136 Patienten evaluiert. Die Proben wurden zunächst von humanem Zellmaterial befreit und anschließend die Pilzzell-wände enzymatisch, chemisch und mechanisch zerstört. Die so gewonnene DNA wurde mittels genus- bzw. speziesspezifischen Primern in der PCR amplifiziert und die replizierte Pilz-DNA durch Agarosegel-Elektrophorese und Hybridisierung qualita-tiv und quantitaqualita-tiv bestimmt.
Die Diagnose einer Candida-Infektion gelang bei 136 Patienten mit einer guten Sensitivität (70 %) und Spezifität (93,8 %); der positive Vorhersagewert betrug 87,5 %. Für Aspergillus wurde eine patientenbezogene (n = 122) Sensitivität von 100 %, bei einer Spezifität von 92,9 % bestimmt; der positive Vorhersagewert betrug hier nur 76,7 %.
Wie schon bei anderen Arbeitsgruppen trat auch im Rahmen dieser Untersuchung das Problem der Kontamination durch ubiquitär verbreitete Aspergillus-DNA auf, hier konkret durch eine Low-Level-Kontamination einer zur DNA-Freisetzung und -Auf-reinigung verwendeten Chemikalie. Es gelang durch Zerstörung von DNA-Material mit Hilfe des Restriktionsenzyms Sau3AI in einem Dekontaminationsschritt evtl.
laborbedingte DNA-Verunreinigungen zu beseitigen.
Im weiteren Verlauf der Untersuchung konnte das geschilderte PCR-Verfahren durch geringfügige Modifikation mit Austausch einzelner reverser Primer erfolgreich zum Nachweis anderer Pilzspezies eingesetzt werden. Darüber wurde eine universelle PCR mit nachfolgender Sequenzierung zur Identifikation unbekannter Pilzspezies eingesetzt und deren labortechnische Verwendbarkeit im Ringversuch bestätigt.
Die PCR ist grundsätzlich zum sicheren und raschen Nachweis einer Pilzinfektion geeignet. Bei hoher Sensitivität und Spezifität ist das Verfahren aber sehr empfind-lich auf eine Kontamination, was die praktische Einsetzbarkeit limitiert. Durch geeig-netes Vorgehen kann jedoch eine Dekontamination laborbedingter Verunreinigungen ohne Verminderung der Sensitivität erzielt werden.
6 Literaturverzeichnis
1. Gerson SL, Talbot GH, Hurwitz S, Strom BL, Lusk EJ, Cassileth PA. Prolonged
granulocytopenia: the major risk factor for invasive pulmonary aspergillosis in patients with acute leukemia. Ann Intern Med 1984;100:345-51.
2. Lass-Florl C. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe.
Mycoses 2009;52:197-205.
3. Samonis G, Bafaloukos D. Fungal infections in cancer patients: an escalating problem. In Vivo 1992;6:183-93.
4. Fridkin SK, Jarvis WR. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin Microbiol Rev 1996;9:499-511.
5. Singer C, Kaplan MH, Armstrong D. Bacteremia and fungemia complicating neoplastic disease. A study of 364 cases. Am J Med 1977;62:731-42.
6. Denning DW. Invasive aspergillosis. Clin Infect Dis 1998;26:781-803; quiz 4-5.
7. Grossi P, Farina C, Fiocchi R, Dalla Gasperina D. Prevalence and outcome of invasive fungal infections in 1,963 thoracic organ transplant recipients: a multicenter retrospective study. Italian Study Group of Fungal Infections in Thoracic Organ Transplant Recipients. Transplantation 2000;70:112-6.
8. Garber G. An overview of fungal infections. Drugs 2001;61 Suppl 1:1-12.
9. Karthaus M, Carratala J. Wandel der Epidemiologie von Infektionen bei Patienten mit febriler Neutropenie. Wien Med Wochenschr 2001;151:47-52.
10. Oner-Eyuboglu F, Karacan O, Akcay S, Arslan H, Demirhan B, Haberal M. Invasive pulmonary fungal infections in solid organ transplant recipients: a four-year review. Transplant Proc
2003;35:2689-91.
11. Arendrup MC. Invasive fungal infections: past achievements and challenges ahead. Clin Microbiol Infect 2009;15:599-601.
12. Klinkhammer F. Mykologie: Erkrankungen durch Pilze nehmen zu. Deutsches Ärzteblatt 2003;100:A376-7.
13. Jones ME, Fox AJ, Barnes AJ, et al. PCR-ELISA for the early diagnosis of invasive pulmonary aspergillus infection in neutropenic patients. J Clin Pathol 1998;51:652-6.
14. O'Grady N P, Alexander M, Dellinger EP, et al. Guidelines for the prevention of intravascular catheter-related infections. Am J Infect Control 2002;30:476-89.
15. Patel R, Paya CV. Infections in solid-organ transplant recipients. Clin Microbiol Rev 1997;10:86-124.
16. Kwon-Chung KJ, Bennett JE. Medical mycology. Philadelphia: Lea & Febiger; 1992.
17. Kontoyiannis DP, Bodey GP. Invasive aspergillosis in 2002: an update. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002;21:161-72.
18. de Pauw BE, Meunier F. The challenge of invasive fungal infection. Chemotherapy 1999;45 Suppl 1:1-14.
19. Dornbusch HJ, Manzoni P, Roilides E, Walsh TJ, Groll AH. Invasive fungal infections in children. Pediatr Infect Dis J 2009;28:734-7.
20. Leenders AC, van Belkum A, Behrendt M, Luijendijk A, Verbrugh HA. Density and molecular epidemiology of Aspergillus in air and relationship to outbreaks of Aspergillus infection. J Clin Microbiol 1999;37:1752-7.
21. Hedayati MT, Pasqualotto AC, Warn PA, Bowyer P, Denning DW. Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer. Microbiology 2007;153:1677-92.
22. Knoke M, Bernhardt H, Schwesinger G. Frühe Beschreibung einer pulmonalen Aspergillose 1847 aus Greifswald. Mycoses 2003;46 Suppl 1:37-41.
23. Loeffler J, Kloepfer K, Hebart H, et al. Polymerase chain reaction detection of aspergillus DNA in experimental models of invasive aspergillosis. J Infect Dis 2002;185:1203-6.
24. Perea S, Patterson TF. Invasive Aspergillus infections in hematologic malignancy patients.
Semin Respir Infect 2002;17:99-105.
25. Latge JP. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev 1999;12:310-50.
26. Thom C, Raper KB. A manual of the Aspergilli. Baltimore,: The Williams & Wilkins Company;
1945.
27. Klont RR, Mennink-Kersten MA, Verweij PE. Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum specimens. Clin Infect Dis 2004;39:1467-74.
28. Bouakline A, Lacroix C, Roux N, Gangneux JP, Derouin F. Fungal contamination of food in hematology units. J Clin Microbiol 2000;38:4272-3.
29. Musa MO, Al Eisa A, Halim M, et al. The spectrum of Fusarium infection in
immunocompromised patients with haematological malignancies and in non-immunocompromised patients: a single institution experience over 10 years. Br J Haematol 2000;108:544-8.
30. Nucci M, Anaissie E. Cutaneous infection by Fusarium species in healthy and
immunocompromised hosts: implications for diagnosis and management. Clin Infect Dis 2002;35:909-20.
31. Soubani AO, Khanchandani G, Ahmed HP. Clinical significance of lower respiratory tract Aspergillus culture in elderly hospitalized patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004;23:491-4.
32. Pasmans HL, Loosveld OJ, Schouten HC, Thunnissen F, van Engelshoven JM. Invasive aspergillosis in immunocompromised patients: findings on plain film and (HR)CT. Eur J Radiol 1992;14:37-40.
33. Stevens DA, Kan VL, Judson MA, et al. Practice guidelines for diseases caused by Aspergillus. Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2000;30:696-709.
34. Pinto PS. The CT Halo Sign. Radiology 2004;230:109-10.
35. Logan PM, Primack SL, Staples C, Miller RR, Muller NL. Acute lung disease in the immunocompromised host. Diagnostic accuracy of the chest radiograph. Chest 1995;108:1283-7.
36. Caillot D, Couaillier JF, Bernard A, et al. Increasing volume and changing characteristics of invasive pulmonary aspergillosis on sequential thoracic computed tomography scans in patients with neutropenia. J Clin Oncol 2001;19:253-9.
37. Kim MJ, Lee KS, Kim J, Jung KJ, Lee HG, Kim TS. Crescent sign in invasive pulmonary aspergillosis: frequency and related CT and clinical factors. J Comput Assist Tomogr 2001;25:305-10.
38. Kami M, Kishi Y, Hamaki T, et al. The value of the chest computed tomography halo sign in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. An autopsy-based retrospective study of 48 patients. Mycoses 2002;45:287-94.
39. Kuhlmann J, Fishman, EK, Burch, PA, Karp, JE, Zerhouni, EA, Siegelmann, SS. Invasive pulmonary aspergillosis in acute leukemia. The contribution of CT to early diagnosis and aggressive management. Chest 1987;92:95-9.
40. Verweij PE, Rijs AJ, De Pauw BE, Horrevorts AM, Hoogkamp-Korstanje JA, Meis JF. Clinical evaluation and reproducibility of the Pastorex Aspergillus antigen latex agglutination test for
diagnosing invasive aspergillosis. J Clin Pathol 1995;48:474-6.
41. Maertens J, Verhaegen J, Demuynck H, et al. Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J Clin Microbiol 1999;37:3223-8.
42. Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, Van Eldere J, Boogaerts M. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001;97:1604-10.
43. Becker MJ, Lugtenburg EJ, Cornelissen JJ, Van Der Schee C, Hoogsteden HC, De Marie S.
Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haematological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br J Haematol 2003;121:448-57.
44. Becker MJ, de Marie S, Willemse D, Verbrugh HA, Bakker-Woudenberg IA. Quantitative galactomannan detection is superior to PCR in diagnosing and monitoring invasive pulmonary aspergillosis in an experimental rat model. J Clin Microbiol 2000;38:1434-8.
45. Aquino VR, Goldani LZ, Pasqualotto AC. Update on the contribution of galactomannan for the diagnosis of invasive aspergillosis. Mycopathologia 2007;163:191-202.
46. Kappe R, Schulze-Berge A. New cause for false-positive results with the Pastorex Aspergillus antigen latex agglutination test. J Clin Microbiol 1993;31:2489-90.
47. Stynen D, Sarfati J, Goris A, et al. Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect Immun 1992;60:2237-45.
48. Verweij PE, Masson, C., Klont, R., Heinen, C., Crepin, B., Maertens, J. Optimisation of the cut-off value of the Platelia Aspergillus ELISA. In: 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID). Nizza, Fankreich; 2006:s277.
49. Loeffler J, Hebart H, Bialek R, et al. Contaminations occurring in fungal PCR assays. J Clin Microbiol 1999;37:1200-2.
50. Reiss E, Obayashi T, Orle K, Yoshida M, Zancope-Oliveira RM. Non-culture based diagnostic tests for mycotic infections. Med Mycol 2000;38 Suppl 1:147-59.
51. Ferns RB. Evaluation of the role of real-time PCR in the diagnosis of invasive aspergillosis.
Leuk Lymphoma 2006;47:15-20.
52. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986;51 Pt 1:263-73.
53. Einsele H, Hebart H, Roller G, et al. Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes. J Clin Microbiol 1997;35:1353-60.
54. White PL, Linton CJ, Perry MD, Johnson EM, Barnes RA. The evolution and evaluation of a whole blood polymerase chain reaction assay for the detection of invasive aspergillosis in hematology patients in a routine clinical setting. Clin Infect Dis 2006;42:479-86.
55. Sobel JD. Practice guidelines for the treatment of fungal infections. For the Mycoses Study Group. Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2000;30:652.
56. Bohme A, Ruhnke M, Buchheidt D, et al. Treatment of fungal infections in hematology and oncology--guidelines of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Ann Hematol 2003;82 Suppl 2:S133-40.
57. Diekema DJ, Messer SA, Hollis RJ, Jones RN, Pfaller MA. Activities of caspofungin, itraconazole, posaconazole, ravuconazole, voriconazole, and amphotericin B against 448 recent clinical isolates of filamentous fungi. J Clin Microbiol 2003;41:3623-6.
58. Donnelly JP, De Pauw BE. Voriconazole-a new therapeutic agent with an extended spectrum of antifungal activity. Clin Microbiol Infect 2004;10 Suppl 1:107-17.
59. Walsh TJ, Adamson PC, Seibel NL, et al. Pharmacokinetics, safety, and tolerability of caspofungin in children and adolescents. Antimicrob Agents Chemother 2005;49:4536-45.
60. Karthaus M, Cornely OA. Treatment options in candidaemia. Mycoses 2007;50 Suppl 1:44-9.
61. Maschmeyer G. Therapeutische Möglichkeiten bei Pilzinfektionen. Chemotherapie Journal 1998;7:53-9.
62. Hof H. Antimykotische Therapie von invasiven Mykosen. Deutsche Zeitschrift für klinische Forschung (DZKF) 2006;1/2:58-65.
63. Bohme A, Ruhnke M, Karthaus M, et al. [Treatment of fungal infections in hematology and oncology. Guidelines of the Working Party on Infections in Hematology and Oncology (AGIHO) of the German Society for Hematology and Oncology (DGHO)]. Dtsch Med Wochenschr 2001;126:1440-7.
64. Ferns RB, Fletcher H, Bradley S, Mackinnon S, Hunt C, Tedder RS. The prospective
evaluation of a nested polymerase chain reaction assay for the early detection of Aspergillus infection in patients with leukaemia or undergoing allograft treatment. Br J Haematol 2002;119:720-5.
65. Jack T. Weiterentwicklung und Evaluation eines molekulargenetischen Nachweisverfahrens zur Diagnostik invasiver Pilzinfektionen [Dissertation]. Hannover: Medizinsche Hochschule Hannover;
2003.
66. Ascioglu S, Rex JH, de Pauw B, et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin Infect Dis 2002;34:7-14.
67. Loeffler J, Hebart H, Brauchle U, Schumacher U, Einsele H. Comparison between plasma and whole blood specimens for detection of Aspergillus DNA by PCR. J Clin Microbiol 2000;38:3830-3.
68. Bretagne S, Costa JM, Marmorat-Khuong A, et al. Detection of Aspergillus species DNA in bronchoalveolar lavage samples by competitive PCR. J Clin Microbiol 1995;33:1164-8.
69. Skladny H, Buchheidt D, Baust C, et al. Specific detection of Aspergillus species in blood and bronchoalveolar lavage samples of immunocompromised patients by two-step PCR. J Clin Microbiol 1999;37:3865-71.
70. Buchheidt D, Baust C, Skladny H, et al. Detection of Aspergillus species in blood and bronchoalveolar lavage samples from immunocompromised patients by means of 2-step polymerase chain reaction: clinical results. Clin Infect Dis 2001;33:428-35.
71. Hayette MP, Vaira D, Susin F, et al. Detection of Aspergillus species DNA by PCR in bronchoalveolar lavage fluid. J Clin Microbiol 2001;39:2338-40.
72. Raad I, Hanna H, Huaringa A, Sumoza D, Hachem R, Albitar M. Diagnosis of invasive
pulmonary aspergillosis using polymerase chain reaction-based detection of aspergillus in BAL. Chest 2002;121:1171-6.
73. Vandewoude KH, Blot SI, Depuydt P, et al. Clinical relevance of Aspergillus isolation from respiratory tract samples in critically ill patients. Crit Care 2006;10:R31.
74. Hebart H, Loffler J, Meisner C, et al. Early detection of aspergillus infection after allogeneic stem cell transplantation by polymerase chain reaction screening. J Infect Dis 2000;181:1713-9.
75. Loeffler J, Hebart, H, Schumacher, U, Reitze, H, Einsele, H. Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood. Journal of Clinical Microbiology 1997;35:3311-2.
76. Yamakami Y, Hashimoto A, Yamagata E, et al. Evaluation of PCR for detection of DNA specific for Aspergillus species in sera of patients with various forms of pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 1998;36:3619-23.
77. Golbang N, Burnie JP, Matthews RC. A polymerase chain reaction enzyme immunoassay for diagnosing infection caused by Aspergillus fumigatus. J Clin Pathol 1999;52:419-23.
78. Loeffler J, Hebart H, Cox P, Flues N, Schumacher U, Einsele H. Nucleic acid sequence-based amplification of Aspergillus RNA in blood samples. J Clin Microbiol 2001;39:1626-9.
79. Buchheidt D, Baust C, Skladny H, Baldus M, Brauninger S, Hehlmann R. Clinical evaluation of a polymerase chain reaction assay to detect Aspergillus species in bronchoalveolar lavage samples of neutropenic patients. Br J Haematol 2002;116:803-11.
80. Hendolin PH, Paulin L, Koukila-Kahkola P, et al. Panfungal PCR and multiplex liquid hybridization for detection of fungi in tissue specimens. J Clin Microbiol 2000;38:4186-92.
81. Martin C, Roberts D, van Der Weide M, et al. Development of a PCR-based line probe assay for identification of fungal pathogens. J Clin Microbiol 2000;38:3735-42.
82. Melchers WJ, Verweij PE, van den Hurk P, et al. General primer-mediated PCR for detection of Aspergillus species. J Clin Microbiol 1994;32:1710-7.
83. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 1977;74:5463-7.
84. Carroll NM, Adamson P, Okhravi N. Elimination of bacterial DNA from Taq DNA polymerases by restriction endonuclease digestion. J Clin Microbiol 1999;37:3402-4.
85. Meier A, Persing DH, Finken M, Bottger EC. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens. J Clin Microbiol 1993;31:646-52.
86. Bakan B, Giraud-Delville C, Pinson L, Richard-Molard D, Fournier E, Brygoo Y. Identification by PCR of Fusarium culmorum strains producing large and small amounts of deoxynivalenol. Appl Environ Microbiol 2002;68:5472-9.
87. Habib G, Hoen B, Tornos P, et al. Guidelines on the prevention, diagnosis, and treatment of infective endocarditis (new version 2009): the Task Force on the Prevention, Diagnosis, and
Treatment of Infective Endocarditis of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J 2009;30:2369-413.
88. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski EB, Fox AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR. J Clin Microbiol 2000;38:1747-52.
89. Rimek D, Garg AP, Haas WH, Kappe R. Identification of contaminating fungal DNA sequences in Zymolyase. J Clin Microbiol 1999;37:830-1.
90. White PL, Bretagne S, Klingspor L, et al. Aspergillus PCR: one step closer to standardization.
J Clin Microbiol;48:1231-40.
91. Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis 2005;5:609-22.
92. Pfeiffer CD, Fine JP, Safdar N. Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay: a meta-analysis. Clin Infect Dis 2006;42:1417-27.
93. Leeflang MM, Debets-Ossenkopp YJ, Visser CE, et al. Galactomannan detection for invasive aspergillosis in immunocompromized patients. Cochrane Database Syst Rev 2008:CD007394.
94. Everett JE, Busick NP, Sielaff T, Wahoff DC, Dunn DL. A deeply invasive Phoma species infection in a renal transplant recipient. Transplant Proc 2003;35:1387-9.
95. Fincher RM, Fisher JF, Lovell RD, Newman CL, Espinel-Ingroff A, Shadomy HJ. Infection due to the fungus Acremonium (cephalosporium). Medicine (Baltimore) 1991;70:398-409.
96. Schell WA, Perfect JR. Fatal, disseminated Acremonium strictum infection in a neutropenic host. J Clin Microbiol 1996;34:1333-6.
97. Hue FX, Huerre M, Rouffault MA, de Bievre C. Specific detection of fusarium species in blood and tissues by a PCR technique. J Clin Microbiol 1999;37:2434-8.
7 Anhang