Quantitativer Nachweis von
Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen.
Kerstin Holthaus
Außenstelle für Epidemiologie Tierärztliche Hochschule Hannover
2008
Quantitativer Nachweis von
Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen.
INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Kerstin Holthaus
aus Ankum
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. E. große Beilage
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. E. große Beilage
2. Gutachter: Prof. Dr. V. Moennig
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Firma Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, finanziell gefördert.
Meinen Eltern
Meinen Eltern Meinen Eltern
Meinen Eltern
und Michael und Michael und Michael und Michael
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht... 2
2.1 Vorkommen und Bedeutung von Lawsonia intracellularis ... 2
2.2 Lawsonia intracellularis ... 4
2.3 Porzine proliferative Enteropathie ... 7
2.3.1 Pathogenese ... 8
2.3.2 Verlaufsformen der Infektion ... 10
2.3.3 Immunreaktion auf L. intracellularis... 12
2.3.4 Kontroll- und Präventionsmaßnahmen ... 14
2.3.5 Differentialdiagnosen ... 17
2.4 Diagnostik ... 19
2.4.1 Direkter Erregernachweis... 19
2.4.2 Indirekter Erregernachweis ... 22
2.4.3 Weitere Nachweismethoden für L. intracellularis ... 23
2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 25
2.5.1 template ... 27
2.5.2 Primer... 27
2.5.3 Polymerase ... 28
2.5.4 weitere Reagenzien ... 29
2.6 Probenaufbereitung, Probenlagerung und Inhibitoren... 31
2.6.1 Probenaufbereitung... 31
2.6.2 Probenlagerung... 33
2.7.1 Detektion und Sondentechnik ... 35
2.7.2 Ergebnisauswertung ... 40
2.7.3 Quantifizierung ... 42
2.8 Validierung von diagnostischen Tests ... 45
3 Material und Methoden... 46
3.1 Guidelines ... 47
3.2 Etablierung und Validierung ... 49
3.2.1 Primer- und Sondendesign... 49
3.2.2 Referenzmaterial... 53
3.2.3 DNA-Isolierung... 55
3.2.4 PCR-Systeme und Ergebnisauswertung ... 57
3.2.5 Optimierung der Primer-Konzentrationen... 60
3.2.6 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer... 63
3.2.7 Optimierung der Sonden-Konzentration ... 65
3.2.8 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde ... 66
3.2.9 real-time PCR... 67
3.2.10 Sequenzierung ... 70
3.2.11 Klonierung ... 72
3.2.12 Verdünnungsreihe und Standard ... 76
3.2.13 Quantifizierung ... 78
3.2.14 Interne Positivkontrolle ... 79
3.2.15 Vergleichspräzision ... 81
3.2.16 Diagnostische Sensitivität und Spezifität... 83
3.2.17 Wiederholpräzision... 84
3.2.19 Robustheit ... 87
3.3 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis von ... L. intracellularis ... 89
3.4 Einfluss der Lagerung von Kotproben auf den Gehalt von ... L. intracellularis ... 91
3.5 Statistik... 93
4 Ergebnisse ... 94
4.1 Etablierung und Validierung ... 94
4.1.1 Primer- und Sondendesign... 94
4.1.2 Optimierung der Primer-Konzentrationen... 94
4.1.3 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer... 95
4.1.4 Optimierung der Sonden-Konzentration ... 96
4.1.5 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde ... 97
4.1.6 Sequenzierung ... 98
4.1.7 Klonierung ... 98
4.1.8 Verdünnungsreihe und Standard ... 101
4.1.9 Interne Positivkontrolle ... 104
4.1.10 Vergleichspräzision ... 106
4.1.11 Wiederholpräzision... 108
4.1.12 Diagnostische Sensitivität und Spezifität... 109
4.1.13 Wiederfindungsrate ... 111
4.1.14 Robustheit ... 113
4.1.15 Messunsicherheit ... 114
L. intracellularis ... 115
4.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in Kotproben 117 5 Diskussion ... 120
5.1 Etablierung und Validierung ... 120
5.1.1 Testsystem... 120
5.1.2 Analytische Spezifität von Primer und Sonde... 121
5.1.3 Quantifizierungsmethode ... 123
5.1.4 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen sowie Effizienz ... 125
5.1.5 Präzision ... 128
5.1.6 Interne Positivkontrolle und Inhibitoren ... 129
5.1.7 Wiederfindung ... 131
5.1.8 Diagnostische Sensitivität und Spezifität... 131
5.1.9 Robustheit ... 132
5.1.10 Anwendung des Testverfahrens in der Diagnostik ... 133
5.2 Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ... 134
5.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in Kotproben 135 5.4 Schlussfolgerungen... 136
6 Zusammenfassung ... 137
7 Summary ... 139
8 Literaturverzeichnis ... 141
9 Anhang ... 169
µg Mikrogramm (x 10-6) µl Mikroliter (x 10-6) µm Mikrometer (x 10-6) µM mikromolar (x 10-6)
A Adenosin
Abb. Abbildung
AKS Staatliche Akkreditierungsstelle Hannover
B. Brachyspira
BDC buoyant density centrifugation BLMP Bund/Länder-Messprogramm
bp Basenpaare
bspw. beispielsweise
C Cytidin
ca. circa
CCD charge-coupled-device technology CFR Code of Federal Regulations CLO campylobacter like organism
Ct threshold cycle
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP Desoxyribonucleotidtriphosphat
ds-DNA double stranded desoxyribonucleic acid
E. Escherichia
EC 1.5 Eppendorf Cup 1,5 ml EC 2.0 Eppendorf Cup 2,0 ml
ELISA enzyme-linked immunsorbent assay ELISPOT enzyme-linked immuno spot technique
EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products ETEC enterotoxische Escherichia coli
e-value equality value
FRET flouorescence resonance energy transfer
GE genome eqiuvalent
h Stunde(n)
H.E. Haematoxylin Eosin
IAC internal amplification control ICO internal control oligonucleotide IEC-18 intestinal epithelium cells 18
IFT Immunfluoreszenztest
IgA Immunglobulin A
IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
IMS immunomagnetic separation INF γ Interferon gamma
IPC internal positive control
IPMA immunoperoxidase monolayer assay
L. Lawsonia
LB Luria-Bertani
LPS Lipopolysaccharide LSA Lawsonia surface antigen LUX light upon extension
M mol / Liter
mAb monoclonal antibody MGB minor groove binder
MIC minimal inhibitory concentration
ml Milliliter
n Anzahl
nM nanomolar
NaOH Natriumhydroxid
NE nekrotisierende Enteritis
ng Nanogramm
nm Nanometer
NTC non template control
OIE Office International des Épizooties OMP outer membrane protein
PCR-ELOSA polymerase chain reaction-enzyme-linked oligosorbent assay PHE porzine hämorrhagische Enteritis
PIA porzine intestinale Adenomatose pmol pikomol (x 10-9)
PNA peptide nucleic acid
PPE porcine proliferative Enteropathie resp. respektive
RI regionale Ileitis
Rn normalized reporter
ROI regions of interest
S. Salmonella
s Sekunden
s.o. siehe oben
SDS Sodiumdodecylsulfat SPF spezifisch pathogenfrei
ss-DNA single stranded desoxyribonucleic acid
ssp. Subspezies
T Thymidin
Tab. Tabelle
u.a. unter anderen(m)
UV Ultraviolett
VNTR variable number tandem repeat
www world wide web
∆Ct delta threshold cycle
∆Rn delta normalized reporter
∆∆Ct delta delta threshold cycle
1 Einleitung
Lawsonia intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim Schwein (LAWSON u. GEBHART 2000). Die Krankheit kann klinisch apparent als akute oder chronische Form auftreten; häufiger ist jedoch eine subklinische Erkrankung, deren Bedeutung nicht selten unterschätzt wird (MCORIST u. GEBHART 1999a, KROLL et al. 2005a). Zum Nachweis der Infektion stehen serologische Untersuchungsmethoden und der direkte Erregernachweis in Kot und/oder Proben der Darmschleimhaut zur Verfügung. Der direkte Nachweis wird derzeit mittels Immunoassays oder der polymerase chain reaction (PCR) durchgeführt (MCORIST et al. 1987, JONES et al. 1993), da der kulturelle Nachweis des Bakteriums aufgrund anspruchsvoller Wachstumsbedingungen in Zellkulturen für die Routinediagnostik ungeeignet ist (MCORIST et al. 1995a). Die Eignung direkter Nachweisverfahren für die Diagnostik wird in der Literatur kontrovers diskutiert, da alle Methoden bis dato lediglich eine qualtitative resp. semiquantitative aber keine absolut quantitative Aussage über den Erregergehalt in einer Probe ermöglichen. Außerdem ist eine Unterscheidung zwischen dem Wildtyp von Lawsonia intracellularis und dem Impfstamm, der zur aktiven Immunisierung von Schweinen verwendet wird, ebenfalls nicht möglich (GUEDES u. GEBHART 2003a). Andere Autoren diskutieren eine Inhibition der PCR an Kotproben als Grund für die geringe Sensitivität, die in früheren Studien für die PCR beobachtet wurde (KNITTEL et al. 1997). Zudem soll es bei der Lagerung von Kotproben zu einer Degradation von Nukleinsäuren kommen, so dass keine spezifischen Genomfragmente mehr nachzuweisen sind (DEUTER et al. 1995).
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine hochsensitive und spezifische Methode für für den Nachweis von Genomfragmenten von Lawsonia intracellularis zu entwickeln, die gleichzeitig eine Quantifizierung des Gehaltes von spezifischen Genomäquivalenten in einer Kotprobe erlaubt. Die anschließende Validierung der Methode erfolgte in Anlehnung an nationale und internationale Vorgaben. Außerdem wurde der Einfluss verschiedener Verfahren zur Homogenisierung des Probenmaterials auf die Verteilung von Lawsonia intracellularis in Kotproben untersucht. Abschließend wurde der Einfluss von Temperatur und Dauer der Probenlagerung auf den quantitativen Nachweis geprüft.
2 Literaturübersicht
2.1 Vorkommen und Bedeutung von Lawsonia intracellularis
Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der porzinen proliferativen Enteropathie (PPE) (LAWSON u. GEBHART 2000). Der Begriff „Ileitis“ wird in der Literatur zunehmend synonym für die PPE verwendet, wenngleich dieser Name, der eigentlich eine akute entzündliche Veränderung suggeriert, die Komplexität und die verschiedenen Verlaufsformen der Erkrankung nicht ausdrücken kann. Die klinischen Symptome und pathologischen Veränderungen der proliferativen Enteropathie des Schweines wurden erstmals 1931 als „intestinal adenoma“ beschrieben (BIESTER u.
SCHWARTE 1931). Es wurde vermutet, dass eine Infektion die Ursache der Erkrankung ist. Die infektiöse Ätiologie konnte aber erst 1993 mit Erfüllung der Koch`schen Postulate nach Isolierung des Erregers und experimenteller Reproduktion der Erkrankung abschließend geklärt werden (LAWSON et al. 1993).
Die Infektion mit L. intracellularis tritt weltweit bei Schweinen auf. Die Prävalenz serologisch positiver Bestände beträgt 96 % in den USA, 95 % in Kanada, 97 % in Mexiko, 100 % in Taiwan und Thailand, 77 % in Frankreich, 95 % in Groß Britannien, 94 % in Dänemark, 65 % in Polen und 67 % in Spanien (MCORIST et al. 2003).
In Deutschland ist die Infektion von Schweinen mit L. intracellularis ebenfalls weit verbreitet. Bundesweit sind mehr als 81 % der Schweinebestände serologisch positiv.
Sauenhaltende Bestände und Mastbestände sind häufiger positiv als andere Bestände, die beispielsweise (bspw.) nur Absetzferkel halten (WENDT et al. 2006).
In Herden ist die Infektion mit L. intracellularis endemisch, jedoch verläuft sie nicht immer klinisch apparent (MCORIST et al. 2003). Die schlechtere Futterverwertung in infizierten Beständen führt, ebenso wie das geringere Schlachtgewicht bei gleicher Mastdauer und die erhöhte Mortalität zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Der Mindererlös wird, abhängig vom Verkaufspreis pro Schwein respektive (resp.) Kilogramm Lebendgewicht und den aktuellen Futterkosten, auf etwa 0,5 bis 1 Euro pro betroffenem Mastschwein geschätzt (VEENHUIZEN et al. 2002, MCORIST 2005).
Verluste durch Minderzunahmen und ein erhöhter Futterverbrauch führen auch im Zusammenhang mit einer subklinischen Ileitis zu wirtschaftlichen Verlusten (7,60 € pro Schwein werden angenommen) (SCHOLZ et al. 2008). Der mögliche wirtschaftliche Verlust durch die PPE wird in Beständen, die Zuchtsauen halten, auf über 100 € pro erkrankter Sau und Jahr geschätzt (MCORIST 2005).
2.2 Lawsonia intracellularis
L. intracellularis gehört zur Familie der Desulfovibrionaceae und ist ein obligat intrazellulär vermehrendes, stäbchenförmiges gramnegatives Bakterium. Es ist zwischen 1,25 und 1,75 µm lang und zwischen 0,5 und 1,5 µm breit. Der Bakterienkörper ist unterschiedlich stark gebogen, die Zellenden sind verjüngt. Es bildet keine Sporen, ist unpigmentiert und nicht von einer Kapsel umgeben. Die Bakterienwand wird von einer äußeren dreiblättrigen welligen Membran umhüllt. Das Bakterium besitzt, im Gegensatz zu den unipolar begeißelten Desulfovibrio desulfuricans, keine Pili oder Fimbrien und zeigt keine Motilität. Isolate aus Zellkulturen besitzen ein unipolares Flagellum. Die Zellwand ist in der modifizierten Ziehl-Neelsen Färbung säurefest (MCORIST et al. 1995a, LAWSON u. GEBHART 2000). Morphologisch ist L. intracellularis den Desulfovibrionaceae ähnlich, jedoch kann L. intracellularis kein Sulfat reduzieren (MCORIST et al. 1995a).
Das Genom von L. intracellularis wurde an der University Minnesota durch KAUR et al. vollständig sequenziert (Accession NC_008011) (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/
entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=NC_008011). Es besteht aus einem ring- förmigen Chromosom, dass ca. 1,46 Megabasen lang ist, 1231 Gene enthält und für 1180 Proteine kodiert. Zusätzlich zu dem ringförmigen Chromosom gibt es 3 zirkuläre Plasmide. Diese sind zwischen 27 und 194 Kilobasen lang und kodieren für 29, 24 resp. 104 Proteine. In einer vergleichenden Untersuchung konnte anhand von Wachstumsbedingungen, Antigeneigenschaften sowie der PCR und Sequenzierung eines 319 Basenpaare (bp) langen desoxyribonucleic acid-(DNA)-Abschnittes keine Variation zwischen europäischen und amerikanischen Isolaten von L. intracellularis festgestellt werden (KNITTEL et al. 1996). Japanische Isolate, die aus Proben vom Schwein isoliert wurden, zeigten in der DNA-Sequenz von vier Genen eine Homologie von 99,6 % bis 100 % zum Typstamm aus Dänemark (KOYAMA et al.
2006). Das Genom von L. intracellularis ist stark konserviert. Durch Untersuchungen an vier variable number tandem repeat (VNTR)-regions konnten dennoch verschiedene VNTR-Profile erstellt werden, die für L. intracellularis aus Proben natürlich infizierter Schweine und für den attenuierten Stamm, der in einem Impfstoff verwendet wird (Enterisol® Ileitis, Boehringer Ingelheim) charakteristisch waren (BECKLER et al. 2005).
Der Erreger, L. intracellularis, wurde zunächst aufgrund seiner morphologischen Ähnlichkeit im Fluoreszenzlicht zu den Bakterien der Spezies Campylobacter als Campylobacter sputorum subspecies (ssp.) mucosalis bezeichnet (LAWSON u.
ROWLAND 1974). Nachdem festgestellt wurde, dass der Erreger der proliferativen Enteropathie des Schweines sich antigenetisch von Campylobacter ssp.
unterscheidet und nur dieser Erreger in affektierten Darmzellen nachgewiesen werden konnte, wurde mit der Bezeichnung campylobacter-like organism (CLO) die Differenz zu den derzeit bekannten Campylobacter ssp. deutlich gemacht (MCORIST et al. 1987). Die Zugehörigkeit des Erregers zu den Desulfovibrionaceae und der heute offiziell geführte Name Lawsonia intracellularis wurde 1995 veröffentlicht (MCORIST et al. 1995a).
Die kulturelle Anzucht von L. intracellularis ist sehr anspruchsvoll. Da der Erreger obligat intrazellulär wächst, ist eine Vermehrung nur in zellhaltigen Medien möglich.
Es wird eine mikroaerophile Atmosphäre (8 – 15 % Sauerstoff) empfohlen, wobei 8 % Sauerstoff als optimal erachtet werden (MCORIST et al. 1995a). Die Anzucht von L. intracellularis aus infizierter Darmmukosa ist auf verschiedenen Zelllinien möglich, von denen sich Dünndarmzellen von Ratten (intestinal epithelium cells 18, IEC-18) als Monolayer besonders gut eignen (LAWSON et al. 1993).
L. intracellularis kommt nicht nur in den Enterozyten beim Schwein vor. Der Erreger konnte mittels PCR und Immunfluoreszenztest (IFT) auch in Tonsillen von Schweinen nachgewiesen werden. Fehlende Anzeichen einer Bakterienproliferation in den Tonsillen ließen die Autoren vermuten, dass es sich um eine lokale Retention des Erregers mit folgender Inaktivierung durch Makrophagen handelt (JENSEN et al.
2000).
Die Tenazität von L. intracellularis in der Umwelt ist relativ groß. Eine Vermehrungsfähigkeit konnte noch nach ein bis zwei Wochen außerhalb des Wirtes bei 5 °C Umgebungstemperatur festgestellt werden (M CORIST u. GEBHART 1999a).
Die Fähigkeit von L. intracellularis den Darm zu besiedeln bleibt im Kot bis zu zwei Wochen bei einer Lagertemperatur zwischen 5 °C und 15 °C erhalten. Mit erregerhaltigem Kot, der über fünf Wochen gelagert wurde, konnte nach Inokulation
Desinfektionsmittel mit Komponenten auf der Basis von quartären Ammoniumgruppen oder Jod haben eine bakterizide Wirkung auf L. intracellularis (COLLINS et al. 2000).
2.3 Porzine proliferative Enteropathie
Die PPE ist eine Darmerkrankung des Schweins, die in verschiedenen Verlaufsformen auftritt, die anhand ihrer pathologischen Veränderungen an der Darmschleimhaut unterteilt werden. Eine proliferative Enteropathie des Schweins kann akut als porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE) auftreten. Die porzine intestinale Adenomatose (PIA), die nekrotisierende Enteritis (NE) und die regionale Ileitis (RI) sind Verlaufsformen, die in der Regel einen chronischen Charakter haben.
Betroffene Darmabschnitte sind das Ileum und in selteneren Fällen das Kolon und/oder Zäkum (MCORIST u. GEBHART 1999a). Es ist eine klinisch inapparente Form beschrieben, die als subklinische Ileitis bezeichnet wird (KROLL et al. 2005a).
Der Übertragungsweg der Infektion ist fäkal-oral (KROLL et al. 2005a). Die wichtigste Infektionsquelle ist der Kot infizierter Tiere. Die Ausscheidung wird bei infizierten Tieren mit bis zu 7x108 Erreger pro Gramm Kot angegeben; dies entspricht einer Vielzahl infektiöser Einheiten (SMITH u. MCORIST 1997). Die minimale Infektionsdosis für L. intracellularis ist derzeit nicht bekannt; allerdings konnte eine positive Korrelation zwischen Infektionsdosis und der klinischen resp. pathologischen Ausprägung der Erkrankung nachgewiesen werden. Die Infektion von Schweinen mit 1010, 109 resp. 108 Erregern pro Tier führte relativ zur eingesetzten Erregermenge zu deutlichen Unterschieden in Mortaliltät, tägliche Körpermassezunahme und Länge der pathologisch veränderten Darmabschnitte. Diarrhoe trat in der Gruppe mit geringer Erregermenge (108) eine Woche später auf als in der Gruppe mit hoher Erregermenge (1010) (GUEDES et al. 2003b). Nach experimenteller Infektion mit einem pathogenen Isolat von L. intracellularis wurde in der ersten Untersuchung von Proben eine Woche post infectionem (p.i.) die Erregerausscheidung im Kot nachgewiesen. Die maximale Ausscheidung wurde zwei Wochen p.i. beobachtet. Die Ausscheidung des Erregers erfolgt intermittierend und kann bis zu 12 Wochen nach einer Infektion anhalten. Auch der Impfstamm wird intermittierend über einen Zeitraum von zwei bis neun Wochen nach Impfung ausgeschieden (GUEDES u.
GEBHART 2003a).
In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte nach experimenteller Infektion
Altersgruppe den Erreger über einen Zeitraum von zwei bis 10 Wochen p. i.
ausscheiden (SMITH u. MCORIST 1997).
In einer Studie an fünf infizierten Beständen (geschlossene Systeme) wurde mittels real-time PCR gezeigt, dass L. intracellularis von infizierten Tieren zwischen der achten und 18. Lebenswoche mit dem Kot ausgeschieden werden kann. Die höchste Ausscheidungsrate wurde in der 12. Lebenswoche festgestellt. Die Ausscheidungs- dauer bei einzelnen Schweinen betrug in der Regel vier bis sechs Wochen (STEGE et al. 2004). Ein ähnliches Ausscheidungsverhalten wurde auch in einem Bestand nach einem Ausbruch von PHE nachgewiesen. Hier wurde der Erreger bei Tieren im Alter von sieben bis 19 Wochen im Kot nachgewiesen (GUEDES et al. 2002a). Die Infektion von Saugferkeln wurde durch den Nachweis von L. intracellularis im Kot von zwei Wochen alten Tieren belegt (JENSEN et al. 2005).
Die lang anhaltende Ausscheidung und die hohe Tenazität von L. intracellularis begünstigen die endemische Ausbreitung einer Infektion in infizierten Beständen. Es wird vermutet, dass serologisch positive, aber klinisch gesunde Sauen zwar infiziert sind, jedoch keine Darmläsionen zeigen. Diese Tiere können als carrier betrachtet werden. Bei Mastschweinen konnte eine Infektion ohne Darmläsionen nicht nachgewiesen werden (MCORIST et al. 2003).
Zwischen Herden stellen latent infizierte Schweine den Hauptübertragungsweg dar (JORDAN et al. 2004). Innerhalb von Herden tragen vermutlich vor allem Tier- kontakte, sowie unbelebte und belebte Vektoren zur Ausbreitung des Erregers bei (GUEDES 2004). Die Kontamination nicht infizierter Betriebsbereiche erfolgt wahrscheinlich passiv durch Verschleppung erregerhaltigen Kotes (CHOUET et al.
2003).
2.3.1 Pathogenese
Die Besiedlung des Darms mit L. intracellularis nach oraler Aufnahme ist wenig untersucht. Pathogenesemechanismen, wie bspw. Chemotaxis, werden zwar vermutet, sind aber bis heute nicht vollständig analysiert (SMITH u. LAWSON 2001).
Auch der Vorgang des Anheftens von L. intracellularis an Enterozyten ist weitgehend
unbekannt. Vermutlich sind spezifische Moleküle während der Adhäsion von Bakterien an die Wirtszelle bedeutsam (MCORIST et al. 1996a).
Das Eindringen von L. intracellularis in Rattenenterozyten IEC-18 konnte unabhängig von der Vermehrungsfähigkeit des Erregers festgestellt werden. Die Wirtszellpenetration der Erreger wird allein von den vitalen Enterozyten vermittelt.
Darüber hinaus scheint die Penetration auch von einer Aktin-Polymerisation abhängig zu sein. Der wichtigste Faktor für das bakterielle Wachstum ist die Teilungsfähigkeit der Enterozyten (LAWSON et al. 1995). Mitotische Zellen unterstützen die bakterielle Vermehrung und sorgen durch die eigene Replikation für eine Verteilung der Bakterien im Darmepithel (SMITH u. LAWSON 2001). Das intrazelluläre Habitat bietet dem Erreger einen Schutz vor körpereigenen Immunmechanismen und sorgt so für die lange Persistenz des Erregers in der Darmschleimhaut (SMITH u. LAWSON 2001). In den Enterozyten bleibt L.
intracellularis nach der Aufnahme zunächst mit der Zellmembran in Verbindung.
Innerhalb von drei Stunden nach der Infektion lösen sich diese Vakuolen auf und entlassen so die Erreger ins Zytoplasma (MCORIST et al. 1995b). Der Mechanismus, mit dem die Bakterien die Vakuolen zerstören, ist bis heute noch nicht beschrieben (SMITH u. LAWSON 2001). Im Zytoplasma vermehrt sich L. intracellularis durch äquatoriale Zweiteilung (MCORIST et al. 1995a). Nach circa (ca.) sechs Tagen werden die Bakterien aus zytoplasmatischen Protrusionen ausgeschleust und können im Anschluss in neue Zellen eindringen (MCORIST et al. 1995b).
Die PPE ist durch eine Hyperproliferation der infizierten unreifen Enterozyten gekennzeichnet. Etwa 10 Tage nach Inokulation der Erreger haben sie die Krypten des Ileums und den Dickdarm besiedelt und vermehren sich. Nach 20 Tagen können erste proliferative Prozesse nachgewiesen werden (MCORIST u. LAWSON 1989).
Die Proliferation beginnt in den infizierten Zellen der Darmkrypten, die sich allmählich Richtung Schleimhautoberfläche vorschieben. Mögliche Ursachen für die Hyperproliferation sind die Regulation von Differenzierungs- und/oder Apoptosegenen durch die Bakterien, Bildung von mitogenen Stoffen durch die Erreger, eine Art Wundheilung des geschädigten Epithels oder ein Einfluss auf rezeptorgebundene Wachstumsfaktoren. Das Fehlen der Becherzellen in der Darmschleimhaut ist typisch (MCORIST et al. 1996a). Durch die starke Vermehrung
Darmschleimhaut zu Mikrovilliverlust und Funktionsstörungen, die sich in Malabsorption mit Diarrhoe und auch in Maldigestion von Proteinen und Fetten äußern (POHLENZ 2005).
Die Hyperproliferation kommt trotz der bestehenden Infektion nach einiger Zeit zum Stillstand. Infizierte Zellen werden in das Darmlumen abgestoßen oder degenerieren innerhalb der Darmmukosa (MCORIST et al. 1996a). Die gesunden Zellen teilen sich und regenerieren; es entsteht wieder ein normales, differenziertes Darmepithel. Wie diese Ausheilung initialisiert wird und welche Faktoren eine Rolle haben, ist nicht hinreichend bekannt (SMITH u. LAWSON 2001).
2.3.2 Verlaufsformen der Infektion
Akuter Verlauf:
Diese Form der akuten hämorrhagischen Enteropathie tritt üblicherweise bei Schweinen im Alter von vier bis 12 Monaten auf (MCORIST u. GEBHART 1999a).
Betroffen Tiere stammen häufig aus Beständen, die ein konsequentes Rein-Raus- Verfahren anwenden und Schweine nach dem Alter getrennt aufstallen (MCORIST et al. 2003, CHOUET et al. 2003). Erste Hinweise auf das Vorliegen einer PHE sind schwarzer, teerartiger Kot und Symptome einer hämorrhagischen Anämie. Die Krankheitssymptome können auf die anämische Blässe beschränkt sein, ohne dass der Kot verändert ist. Die Mortalität beträgt bis zu 50 %. Tiere, die überleben, genesen innerhalb kurzer Zeit. Tragende Sauen können aufgrund der Erkrankung abortieren (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die pathologischen Veränderungen der PHE beschränken sich in der Regel auf das terminale Ileum und das Kolon. Die Darmwand ist verdickt, die Darmserosa ist ödematös. Im Lumen des Ileums befindet sich eine „Blutsäule“. Makroskopisch ist die Mukosa mit Ausnahme der Verdickung unverändert, im histologischen Schnittbild zeigen sich jedoch degenerierte Zellen und Blutungen in der Schleimhaut. Auf der Mukosa befinden sich zahlreiche Erreger und Zelldetritus (MCORIST u. GEBHART 1999a).
Chronischer Verlauf:
Diese Verlaufsform tritt typischerweise nach einer Infektion im Ferkelalter auf (MCORIST et al. 2003). Sie äußert sich am häufigsten als porzine intestinale Adenomatose (PIA). Es sind in der Regel Tiere im Alter von sechs bis 12 Wochen betroffen (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die PIA tritt vor allem in geschlossenen Beständen auf, die keine räumliche Trennung von Produktionsstufen vornehmen.
Subklinisch infizierte Sauen sind als Erregerreservoir anzusehen (MCORIST et al.
2003, CHOUET et al. 2003). Die klinischen Symptome sind wenig spezifisch. Es kommt zu verminderten Zunahmen bei erhaltener Futteraufnahme. Etwa die Hälfte der erkrankten Tiere zeigt Diarrhoe mit Kot von normaler Farbe. In schwereren Fällen kann es zum sichtbaren Konditionsverlust in Verbindung mit Anorexie und Diarrhoe kommen. Die Tiere genesen bei komplikationslosem Verlauf etwa vier bis 10 Wochen nach dem ersten Auftreten klinischer Symptome. Die Körpermassezunahme normalisiert sich, jedoch wird das Schlachtgewicht meist nicht mehr in der sonst üblichen Zeit erreicht (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die Läsionen, die durch die Infektion entstehen, treten im Bereich des Ileums und des vorderen Kolons auf, wenigstens jedoch im Bereich der Ileozäkalklappe. Die Darmwand ist in diesem Bereich unterschiedlich stark verdickt, die Schleimhautoberfläche ist feucht. Die Schleimhaut selbst ist in tiefe Längs- und Querfalten gelegt. Mukosa und Submukosa sind ödematös und in fortgeschrittenen Fällen mononuklear infiltriert. Es sind vergrößerte, aus mehreren Zellschichten bestehende Krypten nachzuweisen. Das Epithel besteht vor allem aus unreifen Enterozyten, Becherzellen fehlen (MCORIST u.
GEBHART 1999a).
Die NE und die RI kommen weitaus seltener vor als die PIA. Sie äußern sich in einem gestörten Allgemeinzustand und Gewichtsverlust. Nicht selten kommt es bei der RI zum Tod durch eine generalisierte Peritonitis nach Darmperforation. Im Verlauf der NE überlagern Zeichen einer Entzündung die bereits bestehende Schleimhautproliferation. Grau-gelbe käsige Massen aus Fibrin und Zelldetritus haften dabei der Mukosa an (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die RI ist durch eine Hypertrophie der äußeren Darmmuskelschicht gekennzeichnet. Die Schleimhaut weist sowohl streifig ulzerierte, wie auch daneben liegende gesunde Areale auf.
Markant ist auch die Bildung von Granulationsgewebe (MCORIST u. GEBHART 1999a).
Subklinischer Verlauf:
Es wird vermutet, dass die subklinische Ileitis weitaus häufiger vorkommt, als bislang angenommen wird, und somit von allen Verlaufsformen die am weitesten verbreitete Form darstellt. Sie ist definiert als L. intracellularis-Infektion, bei der keine klinischen Symptome der PPE sichtbar sind, sehr wohl aber spezifische makroskopische und/
oder mikroskopische Veränderungen im Darm im Zusammenhang mit verminderten täglichen Zunahmen vorkommen (KROLL et al. 2005a). In einer Studie an 16 mit L.
intracellularis infizierten spezifisch pathogenfreien (SPF)-Schweinen, die nach der Infektion keine klinischen Symptome zeigten, konnten sowohl makroskopische als auch mikroskopische Läsionen der PPE nachgewiesen werden (MCORIST et al.
1993).
In einem serologischen screening an 694 schweinehaltenden Betrieben aus Deutschland konnten mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFT) Antikörper gegen L. intracellularis in 94,1 % aller klinisch unauffälligen Bestände und in 76,3 % solcher Herden nachgewiesen werden, in denen Diarrhoe und/oder Kümmern festgestellt wurde. Der hohe Anteil seropositiver Bestände ohne Anzeichen einer Darmerkrankung lässt auf eine weite Verbreitung latenter Infektionen mit L.
intracellularis schließen (WENDT et al. 2006).
2.3.3 Immunreaktion auf L. intracellularis
Die Infektion mit L. intracellularis führt zu einer humoralen und zu einer zellvermittelten Reaktion des Immunsystems. Daneben kann auch zwischen systemischen und einer mukosalen Reaktionen unterschieden werden.
In einer vergleichenden Untersuchung an Schweinen, die entweder über das Trinkwasser vakziniert oder mit einem pathogenen Isolat von L. intracellularis infiziert wurden, konnten Immunglobuline der Klasse G (IgG) bei geimpften Tieren mittels immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) erst fünf Wochen nach der Impfung festgestellt werden. Die IgG-Titer der Tiere, die mit dem pathogenen Isolat infiziert worden waren, stiegen bereits nach zwei Wochen an, waren deutlich höher und bis 13 Wochen p.i. nachweisbar. Die Protektivität der nachgewiesenen Serumantikörper gegenüber dem intrazellulären Erreger wurde jedoch angezweifelt (GUEDES u.
berücksichtigt werden, dass der Versuch mit dem zur damaligen Zeit hauptsächlich in den USA vertriebenen Produkt Enterisol® Ileitis FF (FF= tiefgefrorenes Produkt) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung können daher nicht uneingeschränkt auf europäische Verhältnisse übertragen werden, da hier ausschließlich die lyophilisierte Form von Enterisol® Ileitis vertrieben wird (pers.
Mitteilung: Dr. Ricarda Deitmer, Boehringer Ingelheim; 24.09.2008). Die nicht- humoralen Reaktionen des Immunsystems haben wahrscheinlich eine größere Bedeutung für die Immunität gegen L. intracellularis (KROLL et al. 2004).
An Tieren aus infizierten Beständen konnte eine Serokonversion erst ab einem Alter von 10 Wochen festgestellt werden (STEGE et al. 2004). Sauen entwickeln nach einer akuten PHE hohe IgG-Antikörpertiter. Nach maximal drei Monaten sind diese Antikörper nicht mehr nachweisbar (GUEDES et al. 2002a). Maternal übertragene Antikörper können bei Ferkeln über einen Zeitraum von zwei bis sechs Wochen nach der Geburt detektiert werden (HOLYOAKE et al. 1994, GUEDES et al. 2002a, JENSEN et al. 2005).
Die zelluläre Immunantwort auf eine Infektion resp. auf eine Exposition zum Impfstamm wurde mittels enzyme-linked immuno spot technique (ELISPOT)-Assay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Sekretion von Interferon Gamma (INFγ) durch immunkompetente Zellen mit der Menge des präsentierten Antigens positiv korreliert ist. Eine zelluläre Reaktion konnte bei Exposition gegenüber dem Wildtyp erstmals neun bis 14 Tage p.i. gezeigt werden und war bis zur 13. Wochen p.i. nachweisbar. Im Vergleich dazu war die zellvermittelte Immunreaktion der Tiere, die mit dem Impfstamm vakziniert wurden, erst später nachzuweisen (ab Tag 28) und fiel deutlich schwächer aus (GUEDES u. GEBHART 2003a).
Im Zytoplasma infizierter Enterozyten kommt es zur Konzentration von Immun- globulinen der Klasse A (IgA) (LAWSON et al. 1979, MCORIST et al. 1992) Diese Konzentration könnte einerseits auf einer Sekretionsstörung der Enterozyten beruhen oder aber Folge einer Überproduktion spezifischer Antikörper sein. Es wurde vermutet, dass diese Antikörperproduktion der Beginn der Immunantwort ist, die vom Einwandern von T-Zellen in die erkrankte Mukosa begleitet wird (MCORIST et al. 1992). Für den Verlauf der Infektion wird den Makrophagen eine gewisse Bedeutung zugeschrieben, die allerdings nicht spezifiziert werden konnte. Die Makrophagen begünstigen vermutlich das Auftreten der akuten hämorrhagischen
Schweine, die mit L. intracellularis infiziert wurden und eine belastbare Immunität entwickeln konnten, zeigen bei erneuter Infektion mit L. intracellularis eine geringere Besiedlung des Darmes als bei Erstinfektion. Klinische Erkrankungen treten in der Regel nicht mehr auf (COLLINS u. LOVE 2007).
2.3.4 Kontroll- und Präventionsmaßnahmen
Die PPE stellt trotz des heute üblichen Hygienemanagements weiterhin ein großes Problem in der Schweineproduktion dar. Im Schweinebestand sind das Absetzen der Ferkel und der Infektionsstatus der Zuchtsauen die wichtigsten Risikofaktoren für eine Infektion mit L. intracellularis. Darüber hinaus haben die Größe des Bestandes und die Organisation der Betriebswege eine Bedeutung (MCORIST et al. 2003). Um eine Erregerausbreitung zu minimieren, ist eine Reinigung und wirksame Desinfektion der Stallungen vor jeder Einstallung notwendig (COLLINS et al. 2000).
Der Nachweis von L. intracellularis und Brachyspira (B.) pilosicoli gelingt häufiger in Beständen mit geringer Herdenleistung (Alter der Tiere beim Erreichen von 25 kg Körpergewicht). In Herden mit vergleichbar guter Leistung (s.o.) konnte L.
intracellularis nicht nachgewiesen werden (JACOBSON et al. 2003a).
Klinisch manifeste Infektionen mit L. intracellularis werden üblicherweise antibiotisch behandelt. In einer in vitro-Studie wurden 19 antimikrobielle Wirkstoffe an drei verschiedenen Isolaten von L. intracellularis auf ihre Wirksamkeit untersucht.
Penicillin, Erythromycin, Difloxacin, Virginiamycin und Chlortetracyclin zeigten die beste Wirksamkeit (minimal inhibitory concentration (MIC) < 1 µg/ml). Die MIC für Tiamulin und Tilmicosin betrug 4 µg/ml. Lincomycin und Tylosin wiesen eine MIC von 32 resp. 64 µg/ml auf (MCORIST et al. 1995c). Auch eine vergleichende in vitro- Untersuchung an amerikanischen und europäischen Isolaten von L. intracellularis kam zu dem Ergebnis, dass Tiamulin, Tylosin und Valnemulin sowie, mit Einschränkungen, auch Lincomycin und Chlortetracyclin eine gute Wirksamkeit gegen den Erreger besitzen (WATTANAPHANSAK et al. 2007). Tiamulin ist in vivo gut wirksam. Sowohl nach präventivem als auch nach therapeutischem Einsatz von Tiamulin wurden bei infizierten Tieren keine Darmläsionen festgestellt (MCORIST et
Spectinomycin-Pulver führt zu einem schnelleren Rückgang der klinischen Symptomatik sowie zu höheren täglichen Gewichtszunahmen bei infizierten und behandelten Tieren im Vergleich zu nicht behandelten Tieren einer Kontrollgruppe (MCORIST et al. 2000). Die Verabreichung von Chlortetracyclin kann das Auftreten von makroskopischen und mikroskopischen Läsionen im Darm im Zusammenhang mit einer L. intracellularis-Infektion verhindern und die täglichen Körpermassezunahmen fördern (MCORIST et al. 1999b). Einen ähnlichen Effekt erzielt man durch die Behandlung infizierter Schweine mit Tylosin, wie bspw. Tylan® 200. Klinische Symptomatik und die tägliche Körpermassezunahme konnten im Gegensatz zur nicht behandelten aber infizierten Gruppe verbessert werden (MARSTELLER et al. 2000).
In Fütterungsversuchen konnte gezeigt werden, dass ein fermentiertes Futtermittel zu einer verringerten Erregerausscheidung führt. Läsionen im Darm infizierter Schweine waren vier Wochen nach der Exposition signifikant geringer ausgeprägt, wenn dem Futter 2,4 % Milchsäure zugesetzt wurde (BOESEN et al. 2004).
Die spezifische Immunität gegenüber intrazellulären Pathogenen, wie auch L.
intracellularis, beinhaltet in der Regel eine zellvermittelte Immunantwort. Diese Immunreaktion kann durch eine natürliche Infektion mit L. intracellularis oder durch Applikation des attenuierten Impfstammes hervorgerufen werden (KROLL et al.
2005a).
Seit 2004 ist in Deutschland der Impfstoff Enterisol® Ileitis (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) verfügbar. Er beinhaltet ein vermehrungsfähiges, attenuiertes Isolat von Lawsonia intracellularis (MS B3903) in lyophilisierter Form. Der Impfstoff kann gemäß Zulassung bei Schweinen ab einem Alter von drei Wochen angewendet werden. Die Dauer des Impfschutzes beträgt mindestens 22 Wochen (ANON. 2004b).
Zur Prüfung der Protektivität einer avirulenten Lebendvakzine von L. intracellularis wurden Tiere oral geimpft (Tag 0) und nach 21 Tagen mit einem virulenten heterologen Isolat inokuliert. Ab Tag 21 des Versuches schieden sowohl geimpfte wie auch nicht geimpfte Tiere den Erreger aus, wobei die Prävalenz der Ausscheidung bei den nicht geimpften inokulierten Tieren höher war. Ab Tag 28 nach der Inokulation konnte mittels indirektem IFT eine Serokonversion festgestellt werden.
Die geimpfte Gruppe zeigte einen höheren Anstieg der Zahl seropositiver Tiere.
Makroskopische und mikroskopische Läsionen fielen bei den geimpften Tieren signifikant milder aus als bei den nicht geimpften (KROLL et al. 2004).
Der Versuch, Schweine über das Futter mit in Hühnereiern hergestellten Antikörpern passiv zu immunisieren, führte zu dem Ergebnis, dass sowohl die tägliche Futteraufnahme als auch die täglichen Körpermassezunahmen signifikant höher waren als bei den Tieren, die keine Antikörper erhalten hatten (WINKELMAN et al.
2004).
In einer vergleichenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz des Impfstoffes in einer infizierten Herde die Ausscheidungsrate von L.
intracellularis nicht reduziert wird. Dagegen führte eine Behandlung mit Tylosin zu einer signifikanten Reduktion der Ausscheidungsrate. Zwischen geimpften, nicht geimpften und mit Tylosin behandelten Schweinen konnte kein Unterschied in der Serokonversion festgestellt werden (NATHUES 2007). In einer anderen Untersuchung zur Wirksamkeit der Impfung gegen L. intracellularis konnte zwar ein geringere Auscheidungsrate des Erregers bei geimpften Schweinen im Vergleich zu ungeimpften Schweinen beobachtet werden (GUEDES u. GEBHART 2003a), allerdings muss auch hier bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden, dass der Versuch mit dem zur damaligen Zeit hauptsächlich in den USA vertriebenen Produkt Enterisol® Ileitis FF (FF= tiefgefrorenes Produkt) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung können daher ebenfalls nicht uneingeschränkt auf europäische Verhältnisse übertragen werden (pers. Mitteilung:
Dr. Ricarda Deitmer, Boehringer Ingelheim; 24.09.2008). Auch Kroll et al. (2004) finden in ihren Untersuchungen Anhaltspunkte für die Annahme, dass mit Enterisol® Ileitis geimpfte Schweine weniger Erreger ausscheiden als ungeimpfte Schweine.
Das Ausscheiden von Wildtyp und/oder Impfstamm kann derzeit weder mittels PCR noch mit anderen zur Verfügung stehenden Methoden diskriminiert werden (GUEDES u. GEBHART 2003a).
2.3.5 Differentialdiagnosen
Diarrhoe ist das Leitsymptom der PPE, jedoch ist dieses Symptom wenig spezifisch, sodass verschiedene Differentialdiagnosen berücksichtigt werden müssen. Neben Intoxikationen und diätetisch bedingten Ursachen sollten vor allem andere Infektionskrankheiten ausgeschlossen werden.
Dysenterie
Die Dysenterie des Schweins wird durch eine Infektion mit B. hyodysenteriae verursacht. Die Erkrankung beginnt zunächst mit Ausscheidung weichen, später wässrigen, grau-gelben Kotes, dem sich nach einiger Zeit Schleim, Blut und Fibrin beimengen. Läsionen treten ausschließlich im Dickdarm auf. Es kommt zu Ödemen in Darmwand und Mesenterium, die Schleimhaut ist nekrotisch und mit Fibrinauflagerungen bedeckt. Für die Diagnose ist der direkte Nachweis von B.
hyodysenteriae notwendig (HARRIS et al. 1999).
Spirochaetendiarrhoe
Die Spirochaetendiarrhoe kann Folge einer Infektion mit B. pilosicoli sein. Diese Erkrankung kann bei Tieren verschiedener Altersstufen auftreten. Erste Anzeichen sind das Absetzen von klebrigem Kot, der zementartig bis breiig ist. Jüngere Tiere zeigen oft wässrigen und grün-braunen Kot. Der Blinddarm ist schlaff und flüssigkeitsgefüllt. Im Dickdarm befindet sich eine wässrig-grüne oder schaumig- gelbe Ingesta. Je nach Schwere der Erkrankung sind mehr oder weniger ulzerierte und nekrotische Bereiche in der hyperämischen Schleimhaut von Kolon und Zaekum sichtbar. Die ätiologische Diagnose erfordert den direkten Erregernachweis (HAMPSON u. TROTT 1999).
Salmonellose
Die Infektion von Schweinen mit Salmonellen ist weit verbreitet. Einige Serovare können klinisch manifeste Infektionen auslösen, die dann zu einer Septikämie und/oder einer Enterocolitis führen. Die Enterocolitis wird häufig durch eine Infektion mit Salmonella (S.) typhimurium oder S. choleraesuis ausgelöst, es kommen jedoch
wässrigem, gelbem Kot, dem gelegentlich Blut beigemengt ist. In Dünndarm, Dickdarm und Blinddarm sind auf der teils nekrotischen Schleimhaut grau-gelbe, anhaftende Beläge sichtbar. Der Inhalt von Kolon und Zäkum ist grün-gelb gefärbt.
Für eine ätiologische Diagnose sollte der Erreger in entsprechendem Probenmaterial nachgewiesen werden (SCHWARTZ 1999).
Colidiarrhoe
Einige Serovare von Eschericha (E.) coli sind, neben vielen apathogenen Serovaren, beim Schwein fakultativ oder obligat pathogen und verursachen Septikämien, Enterotoxämien und/oder Diarrhoe. Die Gruppe der enterotoxinbildenden E. coli (ETEC) löst häufig eine Diarrhoe aus, die mit wässrigem Kot und einer verminderten Futteraufnahme einhergeht. Diese Erkrankung tritt in der Regel etwa zwei Tage nach dem Absetzen auf. Der Dünndarm ist dilatiert und geringgradig ödematös. Die Magenschleimhaut und die Dünndarmwand sind häufig hyperämisch. Der Inhalt des Dünndarms ist flüssig bis schleimig und hat einen typischen Geruch. Für eine ätiologische Diagnose sollte ein direkter Erregernachweis erfolgen, dem sich eine Charakterisierung von Virulenzfaktoren, mindestens jedoch eine Serotypisierung anschließt (BERTSCHINGER u. FAIRBROTHER 1999).
Transmissible Gastroenteritis
Die transmissible Gastroenteritis wird durch die Infektion mit einem Coronavirus verursacht. Die Tiere zeigen vorübergehend Erbrechen und gleichzeitg oder zeitversetzt einen stinkenden, wässrigen, gelblichen Kot, der oft mit unverdauter Nahrung durchsetzt ist. Die Erkrankung betrifft in der Regel Saugferkel in den ersten beiden Lebenswochen. Die Wand des Dünndarms ist extrem dünn, der Inhalt ist gelb und schaumig-flüssig. Die ätiologische Diagnose erfordert einen direkten Erregernachweis (SAIF u. WESLEY 1999).
2.4 Diagnostik
2.4.1 Direkter Erregernachweis
Die ersten Nachweise der PPE waren rein deskriptiv und basierten auf einer Beschreibung von proliferativen Prozessen im Ileum. Die Prozesse konnten nach einer Hämatoxilin-Eosin (HE)-Färbung histologischer Präparate detaillierter dargestellt werden, allerdings blieb die Ätiologie ungeklärt (ROWLAND u.
HUTCHINGS 1978). Intrazelluläre Erreger konnten erstmalig mit einer Silberfärbung nachgewiesen werden. Nach einer modifizerten Ziehl-Neelsen Färbung konnten diese Erreger als säurefeste intrazelluläre Bakterien angesprochen werden (ROWLAND u. LAWSON 1986). Beide Färbemethoden sind nicht spezifisch für L.
intracellularis.
Die Kombination aus HE-Färbung, Silberfärbung sowie alcian blue-Färbung zum Nachweis von apikal in den Enterozyten gelegenen Bakterien erlaubt, zusammen mit dem Nachweis histopathologischer Veränderungen, eine relativ sichere Diagnose (DRIEMEIER et al. 2002). Die beschriebene Methode ist allerdings nur für eine Diagnostik post mortem geeignet.
Mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern (monoclonal antibody (mAb)) gegen ausgewählte Proteine der äußeren Zellmembran von L. intracellularis (MCORIST et al. 1987) konnten erstmalig spezifische Immunoassays zur Diagnostik etabliert werden. Zahlreiche Arbeitsgruppen entwickelten Antikörper gegen diverse antigene Strukturen von L. intracellularis. Heute sind mAb´s gegen ein Proteinase K- resistentes Antigen (BOESEN et al. 2005a), gegen das Lawsonia surface antigen (LSA) (MCCLUSKEY et al. 2002) und gegen Lipopolysaccharide (LPS) (KROLL et al.
2005b) verfügbar. Andere Arbeitsgruppen haben monoklonale und polyklonale Antikörper charakterisiert, die gegen spezifische outer membrane proteins (OMPs) von L. intracellularis gerichtet sind (GUEDES u. GEBHART 2003c). Die verschiedenen Antikörper werden zur Detektion von Antigen in histologischen Präparaten post mortem oder zum Nachweis von L. intracellularis intra vitam an Kotproben genutzt (MCORIST et al. 1987). Zur späteren Visualisierung müssen die
(KROLL et al. 2005a). Sensitivität und Spezifität der Methode werden im Allgemeinen als hoch eingeschätzt. In einer vergleichenden Untersuchung konnte für den indirekten IFT an Darmgewebe eine hohe Sensitivität (89 %) und eine hohe Spezifität (97 %) im Vergleich zur PCR festgestellt werden. Die Übereinstimmung der Ergebnisse von IFT und PCR wurde mit almost perfect beurteilt (kappa 0,82) (HUERTA et al. 2003). In einer anderen Untersuchung zum Vergleich von IFT an Kotausstrichen und PCR an Kotproben derselben Tiere wurden mittels PCR 8 % mehr Tiere als positiv erkannt. Die Sensitivität wurde mit 56,5 % angegeben. Darüber hinaus wurde vom Autor die hohe Belastung des Untersuchers bei der Auswertung von IFTs als Nachteil der Methode angeführt (BONITZ 2001).
Die PCR ist eine sensitive, sehr spezifische und schnelle molekularbiologische Nachweismethode. Sie ist besonders für Erreger geeignet, die nur schwer anzuzüchten sind. In 1993 wurde eine nested-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis entwickelt. Die untere Nachweisgrenze betrug 10 Erregern aus gereinigter Mukosa und 1000 Erregern pro Gramm Kot. Die Aufreinigung der DNA erfolgte durch einfache Waschschritte (JONES et al. 1993). Es wurden weitere PCR-Assays etabliert, bei denen durch zusätzliche Schritte in der DNA-Aufreinigung, Kochen und Verdünnen, der Einfluss von Inhibitoren aus Gewebe und Kot reduziert werden sollte (MCORIST et al. 1994). Die Sensitivität der PCR wurde zunächst von vielen Autoren als relativ niedrig eingeschätzt, weil diese Inhibitoren zu falsch negativen Ergebnissen führen können. In einer Studie mit PCR- Untersuchungen an Kotproben waren nur 38 % der experimentell infizierten Tiere bis 24 Tage p.i. positiv; im Gegensatz dazu erzielte eine PCR an Ileumgewebe zu 100 % positive Ergebnisse. Das Vorkommen von Inhibitoren im Kot und die intermittierende Ausscheidung des Erregers wurden als Grund für diese Diskrepanz diskutiert (KNITTEL et al. 1997). Durch die Entwicklung von Substanzen, die Inhibitoren aus Kot während der DNA-Extraktion weitestgehend durch Bindung entfernen können, und weiterentwickelte Extraktionsprotokolle ist die Sensitivität der PCR deutlich gestiegen. Die Sensitivität der PCR aus Schleimhautproben und Kot betrug in neueren Untersuchungen 94,1 % und 88,2 % (SUH et al. 2000). Vorteile der PCR sind die hohe Sensitivität und die sichere Durchführbarkeit, die auch bei hohem Probendurchsatz gewährleistet ist. Darüber hinaus ist der Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kot eine Methode, die eine intra vitam Diagnostik ermöglicht (SUH et al. 2000). In den vergangenen Jahren wurde die PCR
von zahlreichen Autoren in verschiedenen Studien zur Untersuchung der Epidemiologie der L. intracellularis-Infektion sowie zur Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika und Impfstoffen eingesetzt (DÜNSER et al. 2003, NASCIMENTO CHIRIBOGA et al. 1999, JACOBSON et al. 2005, JENSEN et al. 2000, JENSEN et al.
2005, KOYAMA et al. 2006 und weitere).
L. Intracellularis kann auch mittels multiplex-PCR, die Genomfragmente unter- schiedlicher Erreger gleichzeitig detektiert, nachgewiesen werden. Es wurden verschiedene multiplex-PCRs entwickelt, die einen schnellen Ausschluss von Differentialdiagnosen zulassen. Eine triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und Salmonella ssp. aus Kot und Darmmukosa konnte als spezifisch beurteilt werden, jedoch war die Sensitivität für S. typhimurium zehnmal niedriger als in der entsprechenden uniplex-PCR (SUH u. SONG 2005). Eine weitere triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, Serpulina hyodysenteriae und Salmonella ssp. zeigte, mit Ausnahme einer einzigen Probe, eine 100 %ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen klassisch kultureller Nachweisverfahren resp.
der histopathologischen Untersuchung (ELDER et al. 1997). In einer anderen Studie wurde die untere Nachweisgrenze bei der simultanen Detektion von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B. pilosicoli in Kotproben von Schweinen mit 102 bis 103 Zellen pro Gramm Kot angegeben. Vergleicht man diese Ergebnisse mit dem kulturellen Nachweis von B. hyodysenteriae und B. pilosicoli resp. der uniplex-PCR von L. intracellularis ergibt sich eine Sensitivität von 97,3 % für die multiplex-PCR (LA et al. 2006). In einer duplex-PCR können L. intracellularis und Salmonella ssp parallel nachgewiesen werden. Die Sensitivität ist genau so hoch wie bei beschriebenen uniplex-PCR-Methoden (BACCARO et al. 2003). In 2002 wurde ein 5´-nuclease assay zur Detektion von L. intracellularis etabliert und mit immunhistochemischen Untersuchungsverfahren verglichen (LINDECRONA et al.
2002). Das Zielgen dieser real-time PCR war die 16S ribosomale DNA, die auch schon von anderen Autoren als Zielgen gewählt wurde (u.a. KNITTEL et al. 1998, JONES et al. 1993, ZMUDZKI et al. 2004). Mit dieser PCR-Methode ist neben dem sehr schnellen, hochspezifischen Nachweis auch eine Quantifizierung des Gehalts spezifischer Genomfragmenten möglich. Die Nachweisgrenze beträgt ein genome eqiuvalent (GE) von L. intracellularis pro PCR-tube bei einem threshold cycle (Ct)- Wert von 35,7; das entspricht 4 x 104 GE L. intracellularis pro Gramm Kot. Die
war 91 %, wobei in der real-time PCR 6 % mehr Proben als positiv identifiziert wurden (LINDECRONA et al. 2002).
2.4.2 Indirekter Erregernachweis
Der erste serologische Test zum Nachweis von Lawsonia-spezifischen Antikörpern der Klassen IgM und IgA wurde 1988 entwickelt (LAWSON et al. 1988). Es wurde ein indirekter IFT benutzt, um im Serum von natürlich und experimentell infizierten Schweinen Immunglobuline nachzuweisen. Die IgM-Antikörper waren in den ersten acht Wochen p. i. dominant nachweisbar. Für epidemiologische Studien wurde anschließend ein indirekter IFT zum Nachweis von spezifischen Immunglobulinen der Klasse IgG entwickelt, da diese Antikörper-Klasse ist im Serum über einen längeren Zeitraum nach der Infektion nachweisbar ist als IgM. Erste Antikörper sind mit dieser Methode ab dem Tag 14 p. i. detektierbar. Ab Tag 21 nach der experimentellen Infektion konnten 90 % der infizierten Schweine positiv auf Antikörper der Klasse IgG getestet werden. Dieser spezifische und schnelle Test besitzt eine Nachweisgrenze bei einem Titer von 1:1000. In dieser Studie war die Sensitivität des IFT deutlich höher (90 % der infizierten Tiere positiv) als die der ebenfalls an der Versuchsgruppe durchgeführte PCR an Kot (39 % der infizierten Tiere positiv) (KNITTEL et al. 1998). Der IPMA ist ein weiteres serologisches Nachweisverfahren für L. intracellularis-spezifische Antikörper der Klasse IgG. Die Spezifität dieses Tests ist nur in Serumverdünnungen sehr hoch (100 %), da bei Verwendung von unverdünntem Serum die hohe Hintergrundfärbung eine Auswertung des Tests stark erschwert (Spezifität 5 %). Die Sensitivität nimmt allerdings mit dem Verdünnungsgrad des Serums ab; sie beträgt bei einer Verdünnung von 1:30 nur noch 89 % (GUEDES et al. 2002b).
In einer vergleichenden Untersuchung konnten deutliche Differenzen zwischen den Ergebnissen von IFT und IPMA festgestellt werden. Die Übereinstimmung zwischen den beiden Tests betrug auf Einzeltierniveau nur 28 %. Diese Diskrepanz ist durch die unterschiedliche Sensitivität zu erklären, wobei der IFT mehr falsch positive Ergebnisse liefert, der IPMA hingegen mehr falsch negative. Beide Tests sind dadurch charakterisiert, dass eine subjektive mikroskopische Auswertung vorgenommen wird. Trotz der verbesserten Übereinstimmung der Testergebnisse auf Herdenniveau (55 %) muss die Einstufung der Herden in positiv und negativ
aufgrund der Diskrepanzen in 45 % aller Fälle mit entsprechender Vorsicht erfolgen (CORZO et al. 2005). Andere serologische Vergleichsuntersuchungen von IFT und IPMA haben eine Übereinstimmung von 98,6 % gezeigt, jedoch wurde keine Differenzierung in Herden- oder Einzeltierniveau vorgenommen (GUEDES et al.
2002c).
Ein enzyme linked immunsorbent assay (ELISA) wurde auf der Basis des LSA- Antigens entwickelt (WATARAI et al. 2004a), das von L. intracellularis auf der Oberfläche exprimiert wird und vermutlich der Anheftung und dem Eindringen in die Enterozyten dient (MCCLUSKEY et al. 2002). Mit einem synthetisierten Epitop des LSA-Antigens konnte im ELISA eine starke Reaktion von Serum infizierter Kaninchen nachgewiesen werden (WATARAI et al. 2004a).
Lipopolysaccharide (LPS) von L. intracellularis wurden ebenfalls als Zielstruktur im indirekten ELISA zum Nachweis von IgG eingesetzt. Die hohe Spezifität (100 %) und Sensitivität (99,5 %) des Tests konnte an Seren solcher Tiere gezeigt werden, die experimentell infiziert wurden. In einer vergleichenden Untersuchung konnten mittels indirektem LPS-ELISA signifikant mehr Tiere nach Impfung oder experimenteller Infektion als positiv befundet werden als mit einem IFT. Dieser Test kann darüber hinaus die L. intracellularis-Infektionen in einem früheren Stadium nachweisen als der IFT (KROLL et al. 2005b).
Ein anderer indirekter ELISA zeigte eine durchschnittliche Sensitivität von 98 % und eine durchschnittliche Spezifität von 99,3 %. Der ELISA ist in beiden Parametern dem IFT und dem IPMA überlegen (BOESEN et al. 2005b).
In Deutschland ist ein vom Friedrich-Löffler-Institut zugelassener blocking ELISA zum Nachweis von Antikörper gegen Lawsonia intracellularis unter dem Warennamen Enterisol® Ileitis ELISA kommerziell erhältlich. Sensitivität und Spezifität dieses Tests werden mit 97 % resp. 98 % angegeben (KELLER et al. 2004)
2.4.3 Weitere Nachweismethoden für L. intracellularis
Andere Verfahren zum Nachweis von L. intracellularis werden überwiegend für wissenschaftliche Untersuchungen und nur selten in der Routinediagnostik eingesetzt.
Antikörpern aus Kaninchenserum beschichtet sind, L. intracellularis aus Kot zu isolieren und mittels Biolumineszenz sichtbar zu machen (WATARAI et al. 2004b). Im hochspezifischen polymerase chain reaction-enzyme-linked oligosorbent assay (PCR-ELOSA) werden markierte PCR-Produkte in eine Mikrotiterplatte hybridisiert und mittels eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes sichtbar gemacht. Die Auswertung erfolgt automatisiert über die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm (ZHANG et al. 2000).
2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine in vitro Technik, die es ermöglicht ausgewählte DNA-Sequenzen gezielt zu vervielfältigen. Dieser DNA-Abschnitt kann separat oder auch als Teil eines komplexen DNA-Moleküles zur Verfügung stehen. Es ist nicht zwingend notwendig, die Zielsequenz selbst zu kennen. Es ist ausreichend, wenn ca. 15 bis 20 Basenpaare zweier flankierender DNA-Sequenzen bekannt sind. Komplementär zu diesen flankierenden DNA-Sequenzen können kurze gegenläufig orientierte Oligonukleotide synthetisiert werden, die dann in der folgenden zyklischen Reaktion als Startermoleküle (Primer) verwendet werden (MULLIS u. FALOONA 1987):
Im ersten Schritt wird der zu amplifizierende DNA-Abschnitt (template, Matrize) zu einzelsträngiger DNA (ss-DNA) denaturiert. Um sicherzustellen, dass komplex strukturierte genomische DNA vollständig denaturiert, wird häufig vor dem ersten Zyklus eine initiale Denaturierung (first denaturation) bei ca. 95 °C durchgeführt, die in der Regel drei bis fünf Minuten dauert. Im Zyklus wird das Reaktionsgemisch zur Denaturierung für 30 bis 60 Sekunden auf etwa 90 °C bis 94 °C erhitzt. Danach folgt der Schritt des annealing, der ebenfalls 30 bis 60 Sekunden dauert. Die annealing- Temperatur ist abhängig von der Sequenz der eingesetzten Primer. Hier hybridisieren die Primer mit der einzelsträngigen template-DNA, so dass der dritte Schritt, die Amplifikation (extension), beginnen kann. In diesem Reaktionsschritt synthetisiert eine DNA-Polymerase vom 3´-Ende der Primer aus den neuen komplementären DNA-Strang aus Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTP´s).
Diese Amplifikation findet, abhängig von der verwendeten Polymerase, bei Temperaturen von etwa 72 °C statt und benötigt in d er Regel etwa 60 Sekunden für 500 bp (ARNHEIM u. ERLICH 1992).
Diese drei Schritte werden als ein Zyklus zusammengefasst. Die in jedem Zyklus entstehenden DNA-Fragmente stehen im folgenden Zyklus wiederum als template- DNA zur Verfügung (MULLIS u. FALOONA 1987). Es sind auch einfachere Protokolle mit einer Phase der Denaturierung bei 95 °C und einer Phase des annealing sowie der extension bei 60 °C beschrieben, die zu guten Ergebnissen führen (ARNHEIM u. ERLICH 1992). In der Regel werden 20 bis 30 Zyklen der PCR durchgeführt (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Nach dem letzten Zyklus wird
synthetisierten DNA-Stränge zu vervollständigen. Diese Phase sollte etwa fünf bis 10 Minuten dauern (BANGSOW et al. 2007).
Theoretisch kommt es nach jedem Zyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA.
Dieses ist jedoch nur zu Beginn einer PCR der Fall. Mit zunehmender Zykluszahl erfolgt die Vermehrung von DNA-Strängen nicht mehr exponentiell zur Basis 2 sondern linear, bis sie in eine Plateauphase übergeht; dann werden nur noch wenig neue PCR-Produkte gebildet (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Für diese Kinetik sind mehrere Faktoren ursächlich. Der wichtigste Faktor ist die Anreicherung von PCR-Produkten. Durch die unspezifische Bindung der DNA-Polymerase an die bereits synthetisierte doppelsträngige DNA wird die weitere Amplifikation gehemmt (KAINZ 2000). Zusätzlich wird durch diese Anreicherung ein reannealing der komplementären PCR-Produkte wahrscheinlicher als ein annealing der Primer an die Matrize (ARNHEIM u. ERLICH 1992). Im Verlauf der PCR werden außerdem Primer und dNTP´s verbraucht. Durch das zyklische Erwärmen und Abkühlen kommt es zur Schädigung der Polymerase. Während der PCR können auch Verbindungen entstehen, die inhibitorische Eigenschaften besitzen. Mit dem Einbau der Desoxyribonukleotide kommt es zur Freisetzung von Pyrophosphaten, die einen negativen Einfluss auf die Reaktionskinetik haben (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).
Die Detektion von PCR-Produkten kann mittels Gelelektrophorese erfolgen. Die Amplifikate werden zusammen mit einem Längenstandard auf ein Agarosegel aufgetragen und im elektrischen Feld unter einer Gleichspannung von ca. einem Volt pro Zentimeter Länge des Gels der Größe nach aufgetrennt. Anschließend werden die DNA-Fragmente mit einem unspezifisch in doppelsträngige (ds)-DNA inter- kalierenden Farbstoff, bspw. Ethidiumbromid, gefärbt und abschließend mittels ultraviolettem (UV-) Licht sichtbar gemacht. Diese Technik erlaubt die visuelle Detektion von etwa 1 ng DNA (TIEMANN 2006, HIGUCHI et al. 1992). Weitere Verfahren zur Visualisierung von PCR-Produkten beruhen auf dem Prinzip des ELISA oder auf der reversen Hybridisierung (TIEMANN 2006, KEMP et al. 1989).
2.5.1 template
Als template für die PCR dient immer DNA. Diese DNA kann genomischen Ursprungs sein, es kann aber auch rekombinante DNA in verschiedenen Vektoren eingesetzt werden (BANGSOW et al. 2007). Die empfohlene Ausgangsmenge für genomische DNA beträgt etwa 1 bis 100 ng (MÜLLER 2001).
Soll indirekt RNA nachgewiesen werden, muss diese für die PCR zunächst durch ein Enzym (Reverse Transkriptase) in komplementäre DNA transkribiert werden (BANGSOW et al. 2007). Auch Amplifikate einer PCR können als template für eine zweite PCR eingesetzt werden; diese Methode wird dann als nested-PCR bezeichnet (DIEFFENBACH et al. 1993).
Für einen korrekten Ablauf der PCR ist die Qualität des template wichtig. In der template-Matrix dürfen keine Inhibitoren der Polymerase vorhanden sein (DIEFFENBACH et al. 1993).
Die optimale Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes beträgt zwischen 0,1 und 1 Kilobasen und wird von der Prozessivität der Polymerase bestimmt. In einer long range PCR können mittels geeigneter Enzyme und PCR-Protokolle auch längere DNA-Fragmente amplifiziert werden (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).
2.5.2 Primer
Die Auswahl der Primer bestimmt neben der Qualität des template den Erfolg einer PCR. Für ein Design der Primer sollten einige wichtige Regeln beachtet werden:
Primer sollten eine Länge von 18 bis 24 bp besitzen. Diese Grenzen sollten nur bei speziellen Fragestellungen unterschritten werden. Der Gehalt von Guanin (G)- und Cytosin-(C)-basen sollte etwa 50 % betragen (DIEFFENBACH et al. 1993). Die Anzahl der Basen bestimmt die Schmelztemperatur der Primer von der Matrize. Die annealing-Temperatur der Primer ist etwa 5 °C niedriger als der Schmelzpunkt. Die genaue annealing-Temperatur sollte immer im Versuch bestimmt werden (BANGSOW et al. 2007), da sie die Ausbeute resp. Effizienz des PCR-Ansatzes beeinflusst (RYCHLIK et al. 1990). Daneben sollten forward- und reverse-Primer dieselbe Schmelztemperatur besitzen. Um Primer-Dimere zu vermeiden, sollen
