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Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer Lawsonia-intracellularis-Infektion bei Schweinen

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(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für kleine Klauentiere

und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik und Institut für Pathologie

______________________________________________________

Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer Lawsonia-intracellularis-Infektion bei Schweinen

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von Daniel Brandt

aus Soltau

Hannover 2008

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Wendt

Univ.-Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D.

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Wendt 2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage

Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008

(3)

Meiner Familie

(4)
(5)

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung...1

2 Literaturübersicht...2

2.1 Lawsonia intracellularis...3

2.1.1 Morphologie...3

2.1.2 Übertragungswege...6

2.1.3 Epidemiologie...7

2.1.4 Pathogenese...9

2.1.5 Eindringen in die Wirtszelle...11

2.1.6 Intrazelluläre Vermehrung...11

2.1.7 Zellproliferation...12

2.2 Krankheitsbilder...13

2.2.1 Porzine intestinale Adenomatose...13

2.2.2 Subklinische Ileitis...15

2.2.3 Nekrotisierende Enteritis...15

2.2.4 Regionale Ileitis...15

2.2.5 Porzine hämorrhagische Enteropathie...16

2.3 Immunität...19

2.4 Diagnostik...22

2.4.1 Klinik...22

2.4.2 Pathologie...22

2.4.2.1 Makroskopische Untersuchung 23

2.4.3 Labordiagnostische Verfahren...23

2.4.3.1 Indirect Immunoflourescent Antibody Test (IFAT) und Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA)

23

2.4.3.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 24

2.4.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR) 24

2.4.3.4 Histologie 25

2.4.3.5 Immunomagnetic beads und ATP Biolumineszenz 26

2.5 Kontroll- und Prophylaxe-Maßnahmen...28

2.5.1 Desinfektion...28

2.5.2 Fütterung...28

2.5.3 Antibiotische Behandlung...30

(6)

Inhaltsverzeichnis

2.5.4 Vakzine...31

3 Material und Methoden...33

3.1 Bestand und Versuchsgruppe...33

3.2 Klinische Untersuchung...35

3.2.1 Probenentnahme...36

3.3 PCR...37

3.3.1 DNA-Extraktion aus Kotproben...37

3.3.2 Protokoll...37

3.3.3 Replikation der DNA mittels PCR...38

3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese...39

3.3.5 Auswertung der Gele...39

3.4 Serologie...40

3.4.1 Kompetitiver Enzyme Linked Immunsorbent Assay...40

3.5 Pathomorphologische Untersuchungen...41

3.5.1 Sektion...41

3.5.2 Gewebeproben für die lichtmikroskopische Untersuchung...43

3.5.3 Mikroskopische Beurteilung der HE-gefärbten Schnitte...44

3.6 Immunhistologische Untersuchung...47

3.6.1 Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) für Paraffinschnitte..47

3.7 Sonstige Untersuchungen und Behandlungen der Versuchstiere...51

3.7.1 Diagnostische Untersuchungen zum Ausschluss weiterer Erreger von Darmerkrankungen...51

3.8 Verdaulichkeitsanalyse...55

3.8.1 Chymusgewinnung...55

3.8.2 Chemische Analysen...55

3.8.2.1 Weender Rohnährstoffe 55

3.8.2.2 Mineralstoffanalytik 56

3.8.2.3 Brennwert 56

3.8.3 Berechnungen...56

3.9 Statistische Auswertung...57

4 Ergebnisse...58

4.1 Nachweis der Lawsonia-intracellularis-Infektion...58

4.2 Pathomorphologische Untersuchungen...72

4.3 Immunhistologische Untersuchungen auf Lawsonia-intracellularis 94

(7)

Inhaltsverzeichnis

4.4 Verdaulichkeitsanalyse...102

5 Diskussion...104

5.1 Klinische Befunde...104

5.2 Erregerausscheidung und Serologie...105

5.3 Makroskopische Untersuchungen...109

5.4 Histologische Befunde...110

5.5 Immunhistologische Untersuchung...114

5.6 Mastleistung und präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen...115

5.7 Schlussfolgerungen 117

6 Zusammenfassung...120

7 Summary 123

8 Schrifttumsverzeichnis...125

9 Anhang...149

9.1 Ergebnisse für die einzelnen Versuchstiere 149

9.2 Bezugsquellen von Geräten und Verbrauchsmaterialien...156

9.3 Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper...159

9.4 Lösungen und Puffer...161

9.4.1 Immunhistologie 161

9.4.2 Histologie... 162

9.4.3 Sektion...162

9.4.4 PCR...163

(8)

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Tabelle 1: Nachweis von LI bei verschiedenen Tierspezies mit proliferativer

Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000)...5 Tabelle 2: Vergleich der makroskopischen und histologischen Veränderungen bei Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b)....18 Tabelle 3: Übersicht zu den diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis von LI und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al. 2005b)...27 Tabelle 4: Wirkung verschiedener Desinfektionsmittel gegen LI (COLLINS et al.

2000a). ...28 Tabelle 5: Minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen für LI

(WATTANAPHANSAK et al. 2007)...31 Tabelle 6: Zeitplan für die Untersuchung und Probenentnahme...35 Tabelle 7: Probenplan für die Sektion...43 Tabelle 8: Scoring-System für die histologische Beurteilung des Darmes in einer HE-Färbung. ...45 Tabelle 9: Scores zur immunhistologischen Beurteilung einzelner Darmabschnitte und Lymphknoten...50 Tabelle 10: Ergebnisse kultureller Untersuchungen von Kotproben auf bakterielle Durchfallerreger während des Versuchsverlaufes...53 Tabelle 11: Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen auf Brachyspira (B.) hyodysenteriae und B. pilosicoli (PCR) während des Versuchsverlaufes....54 Tabelle 12: Ergebnisse der parasitologischen Kotuntersuchungen von sechs

Versuchstieren...54 Tabelle 13: Kotkonsistenz während der Untersuchungsperiode (n=60 Schweine) 61 Tabelle 14: Vergleich zwischen PCR- und ELISA-Ergebnissen (n=60 Schweine, +

= positiv, - = negativ, ? = fraglich)...61 Tabelle 15: Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung von Tieren (n=21), bei denen mittels PCR keine LI-Ausscheidung im Kot nachgewiesen werden konnte, im Vergleich zur Serologie (+ = positiv, - = negativ, ? = fraglich)...62 Tabelle 16: Ergebnisse der Kotuntersuchung auf LI mittels PCR zu den

festgelegten Untersuchungszeitpunkten...66 Tabelle 17: Ergebnisse der serologischen Untersuchungen auf Antikörper gegen LI mittels Blocking-ELISA zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten....70

(9)

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Tabelle 18: Durchschnittliches Körpergewicht zum Absetzen (4 Wo) und mittlere tägliche Gewichtszunahme bis zur 8. Lebenswoche bei LI infizierten und LI-negativen Tieren (unterschiedliche Buchstaben: p<0,05)...72 Tabelle 19: Korrelation zwischen den Score-Werten für histologische Läsionen am Darm an metrisch zuvor festgelegten und an frei wählbaren Lokalisationen

(Korrelationskoeffizient r, Signifikanz p)...74 Tabelle 20: Ergebnisse der histologischen Beurteilung bei Versuchs- (n=51) und Kontrolltieren (K, n=5). Neben der pathologischen Diagnose wird der Gesamtscore für 9 untersuchte Darmlokalisationen angegeben...78 Tabelle 21: Ergebnis der immunhistologischen Untersuchungen von Darm und Lymphknoten auf LI in Abhängigkeit vom Sektionszeitpunkt....98 Tabelle 22: Durchschnittliche IH-Scores (x±s) für die untersuchten Darmabschnitte in Gruppe 2 unter Berücksichtigung des zeitlichen Abstands zwischen erstem

Infektionsnachweis (PCR / ELISA) und Sektion (unterschiedliche Buchstaben

p<0,05). 101 Tabelle 23: Korrelationen zwischen Histologie-Score und Immunhistologie-Score für die 4 untersuchten Darmabschnitte innerhalb der Gruppen 1-3 (r= Spearman´s Rang Korrelationskoeffizient, Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n=22, Caecum, Colon ascendens n=21. 102 Tabelle 24: Präzäkale Verdaulichkeiten für verschiedene Futterparameter bei einem LI-negativen Tier sowie Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) und Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo vor Sektion) im Vergleich (unterschiedliche Buchstaben p<0,05)...103 Tabelle 25: Übersicht der Einzeltierbefunde (Körpermasse, Kotkosistenz, PCR, ELISA, Histo-Score und Immunhisto-Score). 149

Abbildung 1: Serologischer Nachweis von Antikörpern gegen LI in Schweinebetrieben (Herden=400, Proben=13520) aus Spanien (Herdenprävalenz und durchschnittliche Prävalenz innerhalb der Schweineherden) (LAPUENTE et al.

2006). 8

Abbildung 2: Serologische Untersuchung auf Antikörper gegen LI (Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b). 9

(10)

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Abbildung 3: Differenzierung der verschiedenen Formen der durch LI ausgelösten porzinen proliferativen Enteropathie (nach SIMS u. GLASTONBURY

1996; POHLENZ 2005). 19

Abbildung 4: Belegungsplan im Flatdeckabteil des Versuchsbetriebes. 34 Abbildung 5: Verteilung der erstmalig positiven Nachweise einer LI-Infektion (PCR, ELISA oder Immunhistologie) zwischen der 6. und 10. Lebenswoche (LW) der Versuchstiere innerhalb der einzelnen Boxen (1-6) im Flatdeck (p>0,05). 59 Abbildung 6: Anteil der bis zur jeweiligen Lebenswoche mittels PCR, ELISA oder Immunhistologie als LI-infiziert erkannten Tiere pro Flatdeckbox (6. bis 10.

Lebenswoche). 60

Abbildung 7: Zeitpunkte des erstmalig positiven PCR Nachweises im Kot mittels PCR (n=39 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist

aus Tab. 17 zu entnehmen. 62

Abbildung 8: Dauer der LI-Ausscheidung (n=39). 63 Abbildung 9: Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere innerhalb der

Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 16 zu entnehmen. 64 Abbildung 10: Anteil der insgesamt per PCR als LI-Ausscheider erkannten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60) zur jeweiligen Lebenswoche. 65 Abbildung 11: Zeitpunkte der mittels ELISA festgestellten Serokonversion (n=49 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 18 zu

entnehmen. 67

Abbildung 12: Anteil serologisch positiver Schweine innerhalb der Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. 68 Abbildung 13: Anteil der insgesamt gegen LI serokonvertierten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60, vgl. Tab. 17) zur jeweiligen Lebenswoche. 68 Abbildung 14: Vergleich zwischen dem Zeitpunkt der ersten feststellbaren Erregerausscheidung mittels PCR und dem der Serokonversion (n=39). 69 Abbildung 15: Gesamtanteil aller als LI-infiziert erkannten Schweine unter Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA, Immunhistologie) zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. 71 Abbildung 16: Ileozäkaler Übergang mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 63). 75

(11)

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Abbildung 17: Ileummit geringgradigen Hyperämien und geringgradig

verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 45). 76

Abbildung 18: Caecum, gering- bis mittelgradig proliferierte Krypten (Tier 7). 80 Abbildung 19: Ileum, hochgradig proliferative Ileitis (Tier 17). 81 Abbildung 20: Ileum, hochgradig proliferierte Krypten mit Zelldetritus (Tier 19).

82 Abbildung 21: Ileum, hochgradig proliferierte Krypte (Tier 19). 83

Abbildung 22: Caecum, hochgradige fibrinös-ulzerative und proliferative

Veränderungen (Tier 49). 84

Abbildung 23: Caecum, normales Krypepithel mit vermehrten Becherzellen und

apoptotischen Körperchen (Tier 50). 85

Abbildung 24: Ileum, stark vermehrte Becherzellen und deutlich in der Länge

reduzierte Darmzotten (Tier 23). 86

Abbildung 25: Caecum, immunhistologische Darstellung von LI spezifischem Antigen in Krypten und Rundzellen (Tier 19). 87 Abbildung 26: Caecum, immunhistologischer Nachweis von LI spezifischem

Antigen in einer Krypte (Tier 19). 88

Abbildung 27: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit LI infizierten Darmepithelzelle. (Tier 49). Vergrößerung x 12.500 89 Abbildung 28: Durchschnittliche Ausprägung der histologischen Veränderungen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Gesamtscore für neun Darmlokalisationen: 252); unterschiedliche Buchstaben: p<0,05. 91 Abbildung 29: Korrelation zwischen dem Grad der histologischen Veränderungen (Gesamtscore für neun Darmlokalisationen) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA, n=44) und der Sektion (y= -4,3985x+35,598; r= -0,5753, p<0,001). 92 Abbildung 30: Grad der histologischen Veränderungen an den einzelnen untersuchten Darmlokalisationen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Score 28); unterschiedliche Buchstaben p<0,05. 93 Abbildung 31: Immunhistologische Befunde der Untersuchung auf LI (IH positiv (+) oder negativ (-)) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR und/oder ELISA) und dem Zeitpunkt der Sektion. 95

(12)

Tabellen und Abbildungsverzeichnis

Abbildung 32: Vergleich aller immunhistologischen Ergebnisse in Abhängigkeit von der untersuchten Lokalisation (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion. 96 Abbildung 33: Vergleich der immunhistologisch positiven Ergebnisse in Abhängigkeit von den einzelnen untersuchten Lokalisationen (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder

ELISA) und der Sektion. 97

Abbildung 34: Vergleich der Häufigkeit des LI-Nachweises mittels Immunhistologie für die untersuchten Lokalisationen an Darm (max. IH-Score pro Darmabschnitt: 6) und Lymphknoten (max. IH-Score pro Ln: 3) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05). 99 Abbildung 35: Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI- Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen (Gesamt-IH-Score max. 24) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n=45, y=-1,2522x + 9,5387; r= -0,6878, p<0,001). 100 Abbildung 36: Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI- Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen sowie in den untersuchten

Lymphknoten (Gesamt-IH-Score max. 30) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n=45, y=-1,0248x +

11,225; r= -0,6320, p<0,001). 101

(13)

Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen

A Ampere

Abb. Abbildung

ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex App Actinobacillus pleuropneumoniae

B. Brachyspira

Betr. Betrieb

BHZP Bundeshybridzuchtprogramm

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

DAB 3´3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid DNA Desoxyribonukleinsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

° C Grad Celsius

C. Campylobacter

CD Cluster of differentiation

cm Zentimeter

DE Deutsches Edelschwein DL Deutsche Landrasse E. coli Escherichia coli

EBE Essigsäure-N-butylester

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

F Fimbrientyp

FA Firma

g Gramm

GE Brennwert

ggr. geringgradig

Gr. Gruppe

h Stunde

HE Hämatoxylin-Eosin-Färbung hgr. hochgradig

Ig Immunglobulin

IFAT immunofluorescence antibody test IH immunhistologisch

(14)

Verzeichnis der Abkürzungen kDa kiloDalton

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht kl. klinisch

LI Lawsonia intracellularis Lnn. Lymphknoten

LPS Lipopolysaccharid

LsaA Lawsonia surface Antigen A

LW Lebenswoche

M-Zellen microfold Zellen

MIC minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentration

min Minuten

mg Milligramm

mgr. mittelgradig mm Millimeter ml Milliliter

Mo Monat

n Anzahl der Tiere

nm Nanometer

NE nekrotisierende Enteritis

NL Niederlande

OD optische Dichte

OM Ohrmarke

p Signifikanzniveau

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion

PCV2 porzines Circovirus Typ 2 pc VQ präzäkale Verdaulichkeit

PHE porzine hämorrhagische Enteropathie PI Prozentsatz der Inhibition

p.i. post infectionem

PIA porzine intestinale Adenomatose pos positiv

PPE porzine proliferative Enteropathie

(15)

Verzeichnis der Abkürzungen ppm parts per million

r Korrelationskoeffizient r-DNA ribosomale DNA RI Regionale Ileitis RNA Ribonukleinsäure

s Standardabweichung

S. Salmonella

SAS Statistical Analysis System serol. serologisch

ssp. Subspezies Tab. Tabelle Tierabh. Tierabholung TAE Tris-Acetat, EDTA µl Mikroliter

U/min Umdrehungen pro Minute USA United States of America

V Volt

VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten

W Wochen

WS Warthin-Starry

(16)
(17)

Einleitung

1 Einleitung

Während das klinische Krankheitsbild der porzinen proliferativen Enteropathie (Ileitis, porzine intestinale Adenomatose (PIA)) schon länger bekannt ist (BIESTER u.

SCHWARTE 1931), wurde Lawsonia intracellularis (LI) erst vor wenigen Jahren, nachdem es in Zellkultur gezüchtet und vermehrt werden konnte, als ihr Erreger beschrieben (LAWSON et al. 1993, McOrist et. al. 1995a). Der Erreger ist weltweit verbreitet und führt zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Schweineproduktion. Nach einer neueren Studie zeigen in 93-97 % aller europäischen Schweineherden Tiere eine seropositive Reaktion auf LI (HARDGE et al. 2006).

Bei dieser Erkrankung handelt es sich um einen Krankheitskomplex, der einen unterschiedlichen Krankheitsverlauf nehmen kann. Die Mehrzahl der Infektionen mit LI verläuft subklinisch. Eine Infektion kann jedoch auch eine klinisch apparente Durchfallerkrankung hervorrufen, Tierverluste beziehen sich dabei eher auf Einzeltiere und spielen eine untergeordnete Rolle. Wirtschaftliche Schäden werden hauptsächlich durch die Herabsetzung der Mastleistung und eine ungleiche Entwicklung der Mastgruppen verursacht.

Das Ziel dieser Studie war es, den subklinischen Verlauf einer Feldinfektion mit LI über den Zeitraum einer Aufzucht- und Mastperiode zu charakterisieren und mögliche pathologische Veränderungen im Darmbereich zu beschreiben.

Zur Darstellung des Verlaufs der Infektion wurden die Tiere wöchentlich klinisch untersucht, Kotproben mittels PCR auf die Ausscheidung von LI hin überprüft und Blutproben mittels ELISA auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern gegen LI kontrolliert.

Anhand der Ergebnisse der PCR und der serologischen Untersuchung wurden wöchentlich 5 Tiere selektiert und pathologisch-anatomisch, mit speziellem Augenmerk auf mögliche pathologische Veränderungen des Darms, untersucht.

Außerdem wurden die Proben histologisch untersucht und LI-Antigen immunhistologisch nachgewiesen.

Um mögliche Auswirkungen von Darmveränderungen auf die Futterverwertung feststellen zu können, wurden die Tiere mit einem Marker versetzten Futter gefüttert, und die Auswirkungen auf die Verdaulichkeit untersucht.

(18)

Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Lawsonia intracellularis

Der erste Fallbericht einer porzinen intestinalen Adenomatose wurde 1931 veröffentlicht, zu dieser Zeit war die Identität des Erregers noch unklar (BIESTER u.

SCHWARTE 1931). Erst ab 1974 wurden Anstrengungen unternommen, den Erreger zu identifizieren (GEBHART et al. 1983). Aufgrund dieser Studien wurde Campylobacter (Vibrio) sputorum ssp. mucosalis als möglicher Erreger angesehen.

Andere Autoren vermuteten aufgrund ihrer Untersuchungen Campylobacter (C.) coli, C. jejuni, C. hyointestinales oder C. mucosalis als Ursache (LAWSON et al. 1985).

Durch diese uneinheitliche Klassifizierung wurde der im Darmepithel erkrankter Schweine gefundene Erreger auch als „Ileal symbiont intracellularis“ oder

„Campylobacter-like bacterium“ bezeichnet (GEBHART et al. 1990). Allerdings konnten experimentell durch keine der genannten Campylobacter-Arten die charakteristischen Läsionen induziert werden (GEBHART et al. 1991). Die fehlende Nachweisbarkeit von Campylobacter bei einigen Feldinfektionen ließ vermuten, dass die intestinale Adenomatose durch einen anderen Erreger hervorgerufen wird (GEBHART et al. 1993).

Aufgrund der Annahme, es mit einem völlig neuen Erreger zu tun zu haben, wurden für diesen Erreger spezifische DNA-Sonden hergestellt (MCORIST et al. 1995a).

Durch Sequenzvergleiche der 16 sRNA konnte gezeigt werden, dass es sich um ein neues Genus und eine neue Spezies in der Klasse der Proteobakterien handelt (GEBHART et al. 1993). Der Erreger zeigt eine 91 %ige Übereinstimmung in der RNA-Sequenz mit dem Sulfat reduzierenden Proteobakterium Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774.

Als neue Spezies wurde das Bakterium das erste Mal 1995 als LI klassifiziert und beschrieben, nachdem seine Kultivierung in einer Rattenenterozyten-Zelllinie gelang und eine Reproduktion der Erkrankung mit diesem Keim durchgeführt werden konnte (LAWSON et al. 1993; MCORIST u. LAWSON 1993; MCORIST et al. 1995a)

(19)

Literaturübersicht

2.1.1 Morphologie

Der Erreger LI ist ein Gram-negatives, gebogenes bis sigmoides Stäbchen mit zugespitzten Enden. Die Größe beträgt 1,25-1,75 µm x 0,5-1,5 µm. Das Bakterium ist unpigmentiert, nicht sporenbildend, kapsellos mit einem einzelnen langen unipolaren Flagellum. Die Bakterienwand wird durch eine dreischichtige Umhüllung gebildet, welche von der zytoplasmatischen Membran getrennt ist (GEBHART et al. 1993).

In infizierten intestinalen Zellen befindet sich der Erreger frei im apikalen Zytoplasma.

Die Vermehrung erfolgt über eine äquatoriale Zellteilung (LAWSON et al. 1993).

Eine Eigenbeweglichkeit des Bakteriums konnte in Kulturversuchen nachgewiesen werden. Damit ist der Erreger in der Lage, chemotaktischen Reizen folgend seine Zielzellen aktiv aufzusuchen und Darmzellen in hoher Anzahl zu infizieren und für LI typische Läsionen im Darmgewebe hervorzurufen (LAWSON u. GEBHART 2000).

Die Ausbildung des Flagellums scheint stark reguliert zu sein und wurde bisher lediglich extrazellulär beschrieben, nicht aber in infizierten Zellen. Bei extrazellulär liegenden Bakterien sind zytoplasmatische Vakuolen oder zumindest ähnlich große elektronendichte Körperchen im Zytoplasma beschrieben worden, diese Strukturen fehlen bei intrazellulär liegenden Lawsonien. Eventuell handelt es sich bei diesen Strukturen um Energiereserven für das Leben außerhalb von Wirtszellen (MCORIST et al. 1993).

Kultivierungsversuche in zellfreien Medien gelangen nicht (LAWSON u. GEBHART 2000), LI zeigt ein obligat intrazellulares Wachstum. Eine Kultivierung des Erregers erfolgt unter mikroaerophilen Bedingungen bei 5-18 % O2 und einer Zellschichtdicke von 2-5 mm (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2003b).

Eine Kultivierung in embryonierten Hühnereiern wurde von JONES et al. (1993d) durchgeführt. Nach 4-5 Tagen Bebrütung konnten Schweine mit diesen Eiern infiziert werden, sie wiesen 10 bis 29 Tage post infectionem die für die porzine proliferative Enteropathie typischen Läsionen am Darm auf.

Die unreifen Enterozyten scheinen die wichtigsten Zielzellen der Lawsonien zu sein.

Weiter konnten Lawsonien in Makrophagen und in den Krypten von Tonsillen nachgewiesen werden (LAWSON u. GEBHART 2000). Infizierte Makrophagen sind in der Lamina propria betroffener Darmabschnitte und Lymphknoten zu finden.

Abgesehen vom Schwein konnten LI-Infektionen bei vielen anderen Tierspezies nachgewiesen werden (DROLET et al. 1996) Die durch LI hervorgerufenen Läsionen variieren bei den verschiedenen Spezies bezüglich Lokalisation und histologischen

(20)

Literaturübersicht

Details, allen betroffenen Tierspezies ist aber eine intrazelluläre Ansiedlung der Bakterien und eine Proliferation der Enterozyten gemein (LEBLANC et al. 1993).

Das breite Wirtsspektrum (Tab. 1) von LI birgt ein zooanthroponotisches Gefährdungspotential, eine Infektion des Menschen konnte allerdings bis jetzt nicht nachgewiesen werden (MICHALSKI et al. 2006; JACOBSON et al. 2007).

(21)

Literaturübersicht

Tabelle 1: Nachweis von LI bei verschiedenen Tierspezies mit proliferativer Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000)

Spezies Charakteristika der intrazellulären

Bakterien

Referenz

Blaufuchs

(Alopex lagopus)

IO ERIKSEN et al. 1990

Weißwedelhirsch

(Odocoileus virginianus)

27 k ea, 16 S rDNA;

Gewebe-PCR

COOPER et al. 1996 DROLET et al. 1996

Hund 27 k ea LEBLANC et al. 1993

Emu (Dromaius

novaehollandiae)

27 k ea; 16 S rDNA LEMARCHAND et al.

1997

Meerschweinchen IO ELWELL et al. 1981

Hamster

(Mesocricetus auratus)

27 k ea; Kultur;

16 S rDNA

MCORIST et al. 1987 STILLS 1991

PEACE et al. 1994 Pferd Gewebe-PCR; 27 k ea WILLIAMS et al. 1996 Rhesusaffe

(Macaca mulata)

27 k ea KLEIN et al. 1999

Schwein 27 k ea; 16 S rDNA;

Kultur

MCORIST et al. 1989 GEBHART et al. 1993 LAWSON et al. 1993 Strauß

(Struthio camelus)

16 S rDNA COOPER et al. 1996

Kaninchen

(Oryctolagus caniculus)

27 k ea; 16 S rDNA SCHOEB u. FOX 1990

Ratte IO VANDENBERGHE et

al. 1985

Abkürzungen: 27 k ea = 25-27 kDa Hüllenantigen von LI nachgewiesen durch Immunhistochemie; Kultur = Wachstum von LI in vitro; 16 S rDNA = Sequenzen der

(22)

Literaturübersicht

16 S RNA zeigen eine Übereinstimmung mit dem im Schwein nachgewiesenen intrazellulärem Erreger >96 %; Gewebs-PCR = aus Gewebsläsionen extrahierte DNA zeigt gleiche Sequenzen wie LI; IO = intrazellulär vorliegende Bakterien nur durch Silber-Färbung oder im Elektronenmikroskop nachgewiesen

2.1.2 Übertragungswege

In frühen Berichten konnte bereits eine Schwein-zu-Schwein-Übertragung in Fällen von akuter porziner hämorrhagischer Enteropathie (PHE) in Zuchtbetrieben nachgewiesen werden (ROWLAND u. ROWNTREE 1972; LOVE et al. 1977a). Eine Erregerübertragung von Schwein zu Schwein erfolgt über einen fäkal-oralen Weg.

Der ausgeschiedene Kot muss für eine Übertragung auf andere Schweine große Mengen des Erregers beinhalten (MCORIST et al. 2003).

In einer Infektionsstudie konnten auch Versuchstiere infiziert werden, wenn sie mit Schweinen, die mit einer nur geringen Dosis von LI infiziert wurden, in Kontakt gebracht wurden (JORDAN et al. 2004). Dies bestätigte die Annahme, dass Kot die Hauptquelle neuer Infektionen darstellt (GUEDES 2004).

Mechanische Faktoren wie Stiefel und Kleidung sowie der Eintrag über biologische Faktoren wie Nager und Vögel können als mögliche Vektoren nicht ausgeschlossen werden (GUEDES 2004). Neuere Studien haben gezeigt, dass bei Nagern Lawsonien im Darm vorkommen können (COLLINS et al. 1999; BEDNAR 2006).

Vermutlich dient die Maus als Reservoir für LI, und spielt bei der Verbreitung des Erregers eine entscheidende Rolle (BEDNAR 2006).

LI kann in Fäzes unter üblichen landwirtschaftlichen Bedingungen bis zu 2 Wochen bei 5-15°C infektiös bleiben (COLLINS et al. 2000a) .

In einer dänischen Studie zur Infektionsdynamik von LI in dänischen Schweineherden (5 Herden) konnte die erste Ausscheidung von LI bei Tieren vier Wochen nach dem Absetzen, bei einem mittlerem Gewicht von 18 kg gezeigt werden. Die Ausscheidung konnte mit drei Untersuchungen bei einzelnen Tieren für einen Zeitraum von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden. Die Ausscheidung erreichte ihren Höhepunkt innerhalb der fünf untersuchten Herden etwa 8 Wochen nach dem Absetzen bei einem durchschnittlichen Gewicht von 29 kg. Bei einem Gewicht von 63 kg im Alter von 14 Wochen nach dem Absetzen konnte keine

(23)

Literaturübersicht

bei einzelnen Tieren nach dem Absetzen ein positiver Antikörpertiter festgestellt werden. Diese Tiere waren jedoch 2-4 Wochen später negativ. Die erste Serokonversion konnte 6 Wochen nach dem Absetzen gezeigt werden. Im Durchschnitt serokonvertierten alle untersuchten Tiere (n=100) zwischen der 8. und 14. Woche nach dem Absetzen. Die Serokonversion lag bei den meisten Tieren etwa 2 Wochen nach der ersten Erregerausscheidung. Abgesehen von einem Tier blieben alle Tiere nach der Serokonversion bis zum Ende der Studie in Lebenswoche 22 positiv (VESTERGAARD et al. 2004).

JONES et al. (1993d) konnten LI eine Woche nach experimenteller Infektion im Kot mittels PCR nachweisen. Die Ausscheidung nahm in der 2. Woche nach der Infektion ab, hielt aber bis zu 4 Wochen an.

In einer anderen Infektionsstudie, in der nicht infiziertes Darmgewebe, sondern kulturell gewonnene Lawsonien zur Infektion genutzt wurden, zeigte sich ein stärker variierendes Ergebnis. Die Ausscheidung des Erregers war unregelmäßig und hielt länger an. Bei 2 Tieren hielt die Ausscheidung bis Woche 8-10 nach Infektion an. Bei der Sektion dieser beiden Tiere 3 Wochen nach der letzten Ausscheidung zeigten sich noch Veränderungen im Darm, die auf einen Abheilungsprozess der LI- spezifischen Veränderungen hindeuteten. Ein Nachweis im Darmgewebe mittels Immunfluoreszenz gelang zu diesem Zeitpunkt nicht (SMITH u. MCORIST 1997). Bei einer Infektionsstudie (GUEDES u. GEBHART 2003c) wurde der Erreger für einen Zeitraum von bis zu 12 Wochen intermittierend ausgeschieden. Hieraus wird ersichtlich, warum in vielen Schweine haltenden Betrieben eine stark mit LI belastete Umwelt vorliegt, welche Reinfektionen und Infektionen in verschiedenen Altersgruppen ermöglicht (MCORIST et al. 2003).

2.1.3 Epidemiologie

Verfolgt man die Literatur ist eine Zunahme der Verbreitung von LI in Schweineherden in den letzten Jahren festzustellen.

In einer Studie zur Seroprävalenz in Spanien konnte ein deutlicher Anstieg seropositiver Schweinefarmen, wie auch positiver Tiere pro Farm im Zeitraum von 2001 bis 2004 festgestellt werden (LAPUENTE et al. 2006, Abb. 1).

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Literaturübersicht

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

2001 (n=2124) 2002 (n=1779) 2003 (n=4468) 2004 (n=5149) Jahr

Pvalenz (%)

pos. Herden pos. Tiere

Abbildung 1: Serologischer Nachweis von Antikörpern gegen LI in Schweinebetrieben (Herden=400, Proben=13520) aus Spanien (Herdenprävalenz und durchschnittliche Prävalenz innerhalb der Schweineherden) (LAPUENTE et al. 2006)

Zwischen den Jahren 2001 und 2004 stieg die Prävalenz der seropositiven Schweinefarmen von 65,4 % auf 98,9 %. Die seropositiven Tiere pro Farm stiegen von 24,6 % im Jahr 2001 auf 72,1 % im Jahr 2004. Für diese Studie wurden 400 spanische Schweinefarmen untersucht. Als ein möglicher Grund für die starke Ausbreitung von LI-Infektionen wird das Verbot antimikrobieller Wachstumsförderer diskutiert (LAPUENTE et al. 2006).

Eine Studie zum Vorkommen von LI-Infektionen in deutschen Schweinebeständen zeigte eine den spanischen Ergebnissen ähnlich hohe Prävalenz. Von 694 untersuchten, über das gesamte Bundesgebiet verteilten Betrieben waren im Schnitt 81,3 % der Betriebe seropositiv. Die Verteilung über das Bundesgebiet zeigt gewisse regionale Unterschiede. Die Schwankungsbreite liegt zwischen 66,6 % in Hessen und 100 % positiv getesteten Betrieben in Sachsen (WENDT et al. 2006b). Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Altersabhängigkeit (Abb. 2).

HARTGE et. al. (2006) konnten noch einen höheren Anteil positiver Betriebe in Deutschland beschreiben. Eine Verbreitung von LI wird in dieser europaweit angelegten Studie für Deutschland in 94 % aller untersuchten Mastbetriebe und 99 % aller Zuchtbetriebe angegeben. In Spanien wurden in dieser Studie in 92 % der

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Literaturübersicht

Mastbetriebe und 98 % der Zuchtbetriebe Seroreagenten gefunden. Europaweit waren 93 % aller Schweine mästenden Betriebe seropositiv bzw. 97 % aller Zuchtbetriebe. Dieser Studie zufolge weist europaweit bereits jedes 4. Schwein im Alter von 13 Lebenswochen Antikörper gegen LI auf.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Eber (n=8) Altsauen (n=704) Jungsauen (n=826) Mast >50 kg (n=1947) Mast <50 kg (n=2129) Absetzferkel <30 kg (n=1384) Absetzferkel <15 kg (n=487) Saugferkel (n=61) gesamt (n=7546)

Tiergruppen

seropositiv (%)

Abbildung 2: Serologische Untersuchung auf Antikörper gegen LI (Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b)

2.1.4 Pathogenese

Die Infektion mit LI verursacht verschiedene Krankheitsbilder, aufgrund des lange unbekannten Erregers wurde einige Zeit angenommen, dass es sich um unterschiedliche Erkrankungen handele. Heute wird die LI-Infektion nach den unterschiedlichen Verlaufsformen in subklinisch, akut und chronisch unterschieden.

Die Dosis der aufgenommenen Bakterien und das sich entwickelnde Krankheitsbild stehen in Zusammenhang. So konnte gezeigt werden, dass die klinischen und pathologischen Erscheinungen sowie deren Dauer mit der Menge der aufgenommenen Bakterien positiv korrelieren (COLLINS u. LOVE 2007).

Allen Krankheitsbildern ist eine Proliferation unreifer Enterozyten der Kryptepithelien des Darms gemeinsam. Diese Proliferationen können als pathognomonisch für die porzine intestinale Adenomatose betrachtet werden (POHLENZ 2005). Die von diesen Veränderungen am stärksten betroffenen Bereiche des Darms sind Ileum und Colon ascendens (MCORIST u. GEBHART 1999). Den Verlauf der Infektion konnte

(26)

Literaturübersicht

GUEDES u. GEBHART (2004) in einer Untersuchung, in der die Versuchstiere zu unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion untersucht wurden, darstellen. Jejunum und Ileum waren die ersten Lokalisationen, in denen LI nachgewiesen werden konnte. Die nachfolgenden Darmabschnitte werden anscheinend durch die Ausschleusung von Bakterien aus Jejunum und Ileum infiziert. Später sezierte Tiere, welche bereits länger infiziert waren, zeigten histologische Veränderungen in den dahinter gelegenen Darmabschnitten, nicht aber in Jejunum und Ileum (GUEDES 2004).

In einer neueren Untersuchung zeigen BOUTHRUP et al. (2006) eine andere Verteilung des Erregers über den Darm. Der Erreger war in der Lage, einen weiten Bereich des gesamten Darms zu infizieren, allerdings gab es eine Präferenz für die aboralen Bereiche des Dünndarms. Das Kryptepithelium wurde nicht selektiv befallen, sondern Darmepithelzellen in allen Bereichen des Darms. Die Ausbreitung im Verlauf der Infektion schien weniger auf einer Ausschleusung der Bakterien, als auf einer aktiven Krypt-zu-Krypt Verbreitung zu beruhen (BOUTHRUP et al. 2006).

In welchem Bereich LI die Darmbarriere durchbricht, ist bislang nicht geklärt. Erste Läsionen zeigen sich jedoch immer im Bereich der Peyerschen Platten. Ob die so genannten „microfold cells“ (M-Zellen) bei der Überwindung der Darmbarriere eine entscheidende Rolle spielen, ist derzeit noch unklar (POHLENZ 2005).

Außerhalb des Darms sind bislang Antigenfunde in lokalen Lymphknoten und den Tonsillen bekannt (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2004). Im Darm ist die Infektion auf Enterozyten und Makrophagen limitiert (GUEDES 2002; GUEDES u.

GEBHART 2003a, b).

Eine Infektion mit LI scheint stark abhängig von der vorliegenden intestinalen Flora zu sein. In Infektionsversuchen mit keimfreien Schweinen gelang es nicht, diese Tiere mit in Reinkultur vorliegenden Lawsonien zu infizieren. Diese Tiere zeigten keine intrazelluläre Infektion oder extrazelluläre Besiedlung. Immunologische Reaktionen konnten ebenfalls nicht festgestellt werden. (MCORIST et al. 1993).

Hingegen konnte in keimfrei aufgezogenen Schweinen über mit Lawsonien infizierte Darmteile, die noch eine für Schweine typische unspezifizische Darmflora enthielten, eine Infektion hervorgerufen werden (MCORIST et al. 1989). Nach diesen Versuchsergebnissen wird vermutet, dass die intestinale Flora einen Einfluss hat auf die Fähigkeit von LI, in Darmzellen einzudringen. Ohne das Vorhandensein von kommensalen Bakterien ist eine Infektion nicht möglich (SMITH u. LAWSON 2001).

(27)

Literaturübersicht 2.1.5 Eindringen in die Wirtszelle

Über das Eindringen von LI in seine Zielzellen ist wenig bekannt.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Lawsonien auf der Oberfläche Ihrer Zielzellen stammen von Versuchen mit Hamstern (MCORIST et al. 1989; JASNI et al.

1994).

Diese Aufnahmen zeigen Bakterien mit ähnlicher Morphologie wie intrazellulär vorkommende Lawsonien. Allerdings gelang es nicht, die extrazellulär liegenden Bakterien mit für LI spezifischen immunologischen Techniken zu markieren. Es wurde deshalb vermutet, dass LI Phasen mit variablen Antigenstrukturen ausbildet (MCORIST u. LAWSON 1989).

Die Morphologie der Zielzellen änderte sich nach einer Infektion nur unwesentlich. Es konnte ein Verlust der Mikrovillistruktur sowie eine Verdickung und ein Aufreißen der den Bakterien zugewandten Zellwände beobachtet werden.

In Zellkulturen konnten erste intrazelluläre Bakterien bereits 10 Minuten nach dem Start des Infektions-Experiments nachgewiesen werden (LAWSON et al. 1995;

MCORIST et al. 1995b).

Das Bakterium lagert sich an die Zielzelle an und wird über membrangebundene Vakuolen eingeschlossen und in deren Zytoplasma transportiert. Die Vakuole wird wenige Zeit nach dem Eintritt in die Zelle aufgebrochen, bereits 3 Stunden danach befindet sich die Mehrzahl der eingedrungenen Bakterien frei im Zellzytoplasma (MCORIST et al. 1995b).

2.1.6 Intrazelluläre Vermehrung

Bereits 48 Stunden nach Infektion können erste Zellteilungen der Bakterien beobachtet werden (BOUTHRUP et al. 2006). Vorhandene Erkenntnisse aus Zellkulturversuchen lassen vermuten, dass die bakterielle Replikation von LI stark an die der Wirtszelle gekoppelt ist. LI besitzt einen Tropismus für Kryptzellen. Diese Zellen teilen sich und migrieren in das Epithel, um dieses zu bilden. (SMITH u.

LAWSON 2001).

SMITH und LAWSON (2001) konnten keine Bakterien auf den Zelloberflächen oder einen Transfer zwischen oder aus den infizierten Zellen beobachten. Hieraus schlossen sie, dass die Verteilung der Bakterien über den Darm ausschließlich über Teilung und Migration von infizierten Wirtszellen vonstatten geht. JENSEN et al.

(28)

Literaturübersicht

(2006a) hingegen beobachteten, dass einige Zellen eine Karyorrhexis und Ruptur der Zellmembran zeigten und dass durch diesen Riss große Mengen des Erregers ausgeschieden wurden. Diese Bakterien lagen frei in der Lamina propria oder wurden von umliegenden Makrophagen phagozytiert. Eine Verbreitung der Lawsonien zwischen den einzelnen Enterozyten konnte auch hier nur über eine Mitose der Zellen aufgezeigt werden.

LOMAX und GLOCK (1982) konnten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen Zellteilungen von Lawsonien in infizierten Makrophagen nachweisen.

2.1.7 Zellproliferation

Eine Epithelzellproliferation bei der PPE kommt ausschließlich durch infizierte Zellen zustande (MCORIST et al. 1996). Die Zellproliferation beginnt an der Basis der Krypten. Die unreifen Zellen liegen in bis zu 5 Lagen übereinander und bilden nur einen schwachen Bürstensaum aus (POHLENZ 2005). Die Zellproliferation beginnt bereits 12 bis 36 Stunden nach Infektion (BOUTHRUP et al. 2006).

Infizierte Zellen scheinen unmittelbar nach einer Infektion eine stark gesteigerte Zellteilungsrate zu erlangen. Die gesteigerte Zahl von Mitosen bewirkt eine dreimal höhere Zellpopulation als im normalen Gewebe. Dieser stimulative Effekt auf die Zellteilung der Wirtszelle ist von begrenzter Dauer und endet trotz einer länger bestehenden Infektion der Zellen (SMITH u. LAWSON 2001).

2.2 Krankheitsbilder

Die PPE bildet einen Krankheitskomplex. Sie unterteilt sich in eine akute Form, die porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE), sowie subakute bis chronische Formen (Abb. 3). Dieses sind die porzine intestinale Adenomatose (PIA), die nekrotisierende Enteritis (NE) sowie die regionale Ileitis (RI). Sie sind wahrscheinlich eine Folge der Sequenz der Ereignisse, die sich im hinteren Dünndarm, Caecum und Colon abspielen (POHLENZ 2005). Oft verläuft die Infektion aber auch subklinisch.

Makroskopische und mikroskopische Veränderungen durch eine Infektion mit LI sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

(29)

Literaturübersicht 2.2.1 Porzine intestinale Adenomatose

Die PIA ist die häufigste subakute bis chronische Form der PPE und geht der NE und RI regelmäßig voraus. Zumeist tritt sie im Alter zwischen 6-14 Wochen auf. Diese Form ist durch zwei Hauptsymptome gekennzeichnet, zum einen durch eine verringerte Gewichtszunahme und eine starke Variation der Körpergewichte innerhalb der einzelnen Mastgruppen, zum anderen durch eine Diarrhoe. Der Durchfall kann intermittierend und dünnbreiig bis wässrig sein, gelegentliche Blutbeimengungen sind möglich (POHLENZ 2005). Die makroskopischen Veränderungen stellen sich im Allgemeinen als Verdickung der Darmschleimhaut dar. Diese Verdickungen können fokal sein und treten oft als kleine umschriebene proliferierte Bezirke auf, umgeben von ansonsten unauffälligem Darmgewebe (SMITH u. LAWSON 2001). Die verdickte Mukosa formt irreguläre longitudinale oder transversale Faltungen. Diese werden als hirnwindungsartig beschrieben. Im Mesenterium sind die Blut- und Lymphgefäße gestaut. Hiermit geht ein subseröses Ödem einher, und die regionären Lymphknoten sind stark vergrößert und ödematös (BROWN et al. 2007). Bei der mikroskopischen Untersuchung steht die Proliferation unreifer Zellen in den Krypten im Vordergrund. Die Zotten der Darmschleimhaut sind verkürzt und in den Krypten sind bis zu fünffach verdickte Zelllagen zu beobachten.

Becherzellen fehlen fast vollständig (POHLENZ 2005). Die proliferativen Veränderungen werden begleitet von einer Infiltration von Lymphozyten, Neutrophilen und Histiozyten in der Lamina propria, sowie den Kryptlumina (LOMAX u. GLOCK 1982). Proliferierte und normale Krypten können in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander gefunden werden (MCORIST et al. 1993).In vielen Fällen gibt es keine Anhaltspunkte für Entzündliche Reaktionen (MCORIST u. GEBHART 1999).

Bei den proliferativen Veränderungen kann die Darmmukosa vollständig durch eine Adenomähnliche Mukosa ersetzt werden. Die Krypten sind vergrößert und verzweigen sich drüsenartig (MCORIST u. LAWSON 1993). Die mukosale Oberfläche der Darmschleimhaut flacht mit zunehmender Verlängerung der Krypten ab. Dies kann dazu führen, dass die Kryptlumina an einer vollständig zottenfreien Oberfläche offen liegen (LOMAX u. GLOCK 1982).

Die proliferierten Kryptepithelzellen nehmen eine leicht kuboidale und leicht vergrößerte Form an (JENSEN et al. 2006a). Die proliferierten unreifen Zellen zeigen im Lichtmikroskop ein basophiles Zytoplasma mit großem, oval bis länglich

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Literaturübersicht

erscheinendem, hyperchromatinen Zellkern. Ihnen fehlt ein prominenter Mikrovilli- saum (LOMAX u. GLOCK 1982). Weiter können kugelförmige, stark mit LI gefüllte Epithelzellen gefunden werden. Diese Zellen zeigen Karyorrhexis und einen Riss der Zellmembran. Durch diesen Riss werden große Mengen des Erregers aus dem Zytoplasma ausgeschleust (JENSEN et al. 2006a). Eine Hyperplasie der Enterozyten und eine Reduktion der Becherzellen können frühestens 11 Tage nach Infektionsbeginn beobachtet werden (GUEDES u. GEBHART 2004).

Beobachtungen von multinukleären Riesenzellen in mit LI infiziertem Gewebe sind selten (LOMAX u. GLOCK 1982; SEGALES et al. 2001). JENSEN et al. (2006b) hingegen warnen, multinukleäre Riesenzellen LI-Infektionen zuzuordnen und verweisen auf SIGURDARDOTTIR et al. (1994), wonach eher eine mykobakterielle Infektion für das Auftreten von Riesenzellen verantwortlich zu sein scheint. Weiterhin sind multinukleäre Riesenzellen auch bei PCV2-Infektionen zu finden (Tab. 2) (JENSEN et al. 2006b).

Während der so genannten “Erholungsphase” 7-9 Wochen p.i. sind neben den proliferierten Epithelzellen, Makrophagen, wieder auftretende Becherzellen und unveränderte Krypten zu erkennen. Viele der Kryptepithelzellen beinhalten zahlreiche apoptotische Körperchen. Im histologischen Bild erscheinen diese Körperchen als eosinophile Einschlüsse in basalen Kryptzellen. Epitheliale Zellgruppen mit apoptotischen Körperchen beinhalten keine sichtbaren Bakterien (MCORIST et al. 1996). MCINTYRE et al. (2003) beschrieben, dass es innerhalb dieser Erholungsphasen zu einem Wiederauftreten von Becherzellen in normalen Krypten mit einer anschließenden Phase der Becherzellhyperplasie kommt.

In den Ileozäkal-Lymphknoten konnten LOMAX et al. (1982) das Vorkommen von multifokalen granulomatösen Lymphadenitiden aufzeigen. Bei einem Tier wurde eine Epithelzellmetastase im Lymphknoten gefunden. Diese Epithelzellen waren unreif und bildeten irreguläre Kryptstrukturen, welche intraluminal Zelldetritus enthielten.

Diese metastatischen Zellen wiesen jedoch kein LI-Antigen auf (LOMAX et al. 1982).

Die Ähnlichkeiten zwischen einer PCV2- und einer LI-Infektion machen eine differentialdiagnostische Untersuchung notwendig. Eine Zusammenfassung der makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen (Tab. 2) von LI- und PCV2- Infektionen zeigen JENSEN et al. (2006b).

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Literaturübersicht 2.2.2 Subklinische Ileitis

Am häufigsten kommt die subklinische Ileitis vor. Zumeist sind Ferkel im Alter ab 6 Wochen betroffen (POHLENZ 2005).

Diese Form der Infektion ist definiert durch eine LI-Besiedelung des Darms mit dem Auftreten von mikroskopischen und seltener makroskopischen Läsionen sowie durch verringerte Tagesgewichtszunahmen und schlechtere Futterverwertung, ohne dass klinische Symptome zu erkennen sind (KROLL et al. 2005b). Während einige Tiere in der Gruppe ein normales Wachstum zeigen, bleiben andere deutlich in ihrer Gewichtsentwicklung zurück (MCORIST u. GEBHART 1999).

Erfahrungen aus Sektionen zeigten, dass im hinteren Ileum, im Bereich der Papilla ilealis sowie im vorderen Colon auf LI hinweisende Schleimhautalterationen zu finden sind (MCORIST u. GEBHART 1999). Histologisch sind Zellproliferationen in unterschiedlichsten Ausprägungen im Bereich der Krypten zu finden. Der Erreger kann in solchen Fällen nicht immer nachgewiesen werden.

Es kommt vor, dass zwar eine Kolonisation mit LI vorliegt, diese aber nicht schwer genug ist, um eine nachweisbare Erregerausscheidung zu erzeugen bzw. um eine Serokonversion herbeizuführen (GUEDES 2004).

2.2.3 Nekrotisierende Enteritis

Die nekrotisierende Enteritis ist gekennzeichnet durch hochgradige entzündliche bis nekrotisierende Vorgänge im Darm der betroffenen Tiere. Klinisch zeigen diese Tiere ein hochgradiges Kümmern und dünnbreiigen bis wässrigen, gelb-braunen Kotabsatz (LAWSON u. GEBHART 2000). Es treten Fibrinauflagerungen und oberflächliche Läsionen der Darmschleimhaut auf. Weiter können fokal bis großflächig gelb-braune Verkäsungen oder blutig-nekrotische Veränderungen auf der Darmschleimhaut des distalen Ileums und proximalem Colons auftreten. Die nekrotisierende Enteritis ist vermutlich die Folge der durch die PIA verursachten Läsionen und nachfolgender Besiedlung mit einer pathogenen anaeroben Dickdarm-Flora (BROWN et al. 2007).

2.2.4 Regionale Ileitis

Eine regionale Ileitis scheinen Tiere als Endstadium zu entwickeln, welche die chronische Form überlebt haben. Das Ileum erscheint verdickt und steif,

(32)

Literaturübersicht

entsprechend wird diese Form auch als „Garden-hose-gut“ (Gartenschlauch-Darm) bezeichnet. Bei gelegentlich auftretenden Todesfällen, wird das hypertrophe Ileum perforiert, die betroffenen Tiere verenden schließlich an einer daraus resultierenden Peritonitis (LOVE et al. 1977b).

Beim Eröffnen des Darmlumens werden meist lineare Ulzerationen sichtbar, die in ein Granulationsgewebe eingebettet sind. Diese Granulationen sind wandseitig von hypertropher Muskulatur umgeben. Im Granulationsgewebe finden sich Inseln von teils proliferierender, teils atrophischer Schleimhaut.

Diese Form der Lawsonien-Infektion wird heute nur noch selten gesehen. Die Tiere weisen eine stark eingeschränkte Ingestapassage auf und kümmern dementsprechend stark. Derart zurückgebliebene Tiere verlassen die Betriebe meist vorzeitig, und erscheinen nicht oder nur selten im Untersuchungsgut (POHLENZ 2005).

2.2.5 Porzine hämorrhagische Enteropathie

Die akut verlaufende porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE) kommt meist bei Tieren im Alter zwischen 4-12 Monaten vor (LAWSON et al. 1977; BROWN et al.

2007). Am häufigsten sind Tiere aus Herden mit einem hohen Hygienestatus betroffen, wenn diese naiven Tiere im Rahmen einer Remontierung in eine infizierte Herde eingeführt werden (MCORIST u. GEBHART 1999).

Die Körpertemperatur der betroffenen Tiere kann von subnormal bis erhöht variieren (POHLENZ 2005). Klinisch zeigt sich in den meisten Fällen ein schwarzer, teer- ähnlicher Kot mit nachfolgendem Durchfall.

Die erkrankten Tiere kommen nach einer kurzen Episode blutigen Durchfalls und Anämie zum Festliegen und verenden aufgrund eines hypovolämischen Schocks.

Plötzliche Todesfälle ohne auffälligen Kotbefund sind aber ebenfalls möglich. Die Hälfte der an PHE erkrankten und anämischen Tiere stirbt, die Überlebenden erholen sich zumeist nach kurzer Zeit (MACINTYRE et al. 2003).

Es wird diskutiert, dass die PHE wie eine Hypersensibilitätsreaktion mit massiver Erregerausschüttung abläuft (LAWSON et al. 1977; BROWN et al. 2007).

Bei der Sektion ist das Darmlumen mit Blutkoagula gefüllt. Die Schleimhäute sind verdickt und mit einem dünnen Fibrinfilm in Ileum, Colon oder Caecum bedeckt (WINKELMANN 1996).

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Literaturübersicht

In der Schleimhaut finden sich zahlreiche Diapedesen. Histologisch liegt das typische Bild der PPE im frühen Stadium vor, ein Zellzerfall mit Blutungen im Bereich der proliferierten Krypten dominiert (MCORIST u. GEBHART 1999). In fortgeschrittenen Fällen konnten Proliferationen auf einer Länge von bis zu 4,90 Meter vor der Papilla ilealis beobachtet werden (RÜDIGER-BÖSCH et al. 1986).

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Literaturübersicht

Tabelle 2: Vergleich der makroskopischen und histologischen

Veränderungen bei Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b)

Pathologische Veränderungen LI PCV2

Makroskopisch

Nekrotisierende Ileitis und Kolitis + +

Verdickung der Darmschleimhaut + +

Verdickung der Darmmuskulatur + +

Hämorrhagische Enteritis + +

Ödem im Mesocolon - +

Mikroskopisch

Zottenatrophie + +

Koagulationsnekrose + +

verlängerte Krypten + +

unreife proliferierte Enterozyten + -

fehlende Becherzellen + -

Histiozytose in der Lamina propria + +

Histiozytose in lymphoidem Gewebe - +

multinukleäre Riesenzellen + +

lymphozytäre Depletion in lymphoidem Gewebe

+ +

Nekrose in lymphoidem Gewebe + +

verzweigte Krypten + -

Zytoplasmatische Einschlusskörperchen - + Legende: + Veränderung kommt bei dieser Infektion vor

- Veränderung kommt bei dieser Infektion nicht vor

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Literaturübersicht PPE Porzine

Proliferative Enteropathie

klinisch subklinisch

akut Subklinische Ileitis

PIA Porzine intestinale Adenomatose

NE Nekrotisierende Enteritis PHE Porzine

hämorrhagische Enteropathie

RI Regionale Ileitis

Krypthyperplasie

epitheliale Hyperplasie

Nekrose

Fibrinauflagerungen epitheliale Hyperplasie

Granulationsgewebe Muskelhypertrophie epitheliale Hyperplasie Hämorrhagie

Nekrose

epitheliale Hyperplasie

subakut / chronisch

Abbildung 3: Differenzierung der verschiedenen Formen der durch LI ausgelösten porzinen proliferativen Enteropathie (nach SIMS u.

GLASTONBURY 1996; POHLENZ 2005)

2.3 Immunität

Die PPE ist eine Schleimhautinfektion und somit sind die lokalen, sich an der Intestinalschleimhaut abspielenden Prozesse wahrscheinlich für das Abwehrgeschehen von größter Relevanz (POHLENZ 2005).

In immunhistochemischen Untersuchungen zur Bestimmung der Lymphozytenpopulation mit der Sequenz von 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 Tagen nach erfolgter experimenteller Infektion zeigten sich einerseits eine Reduktion von T- und B- Zellen, andererseits eine erhöhte Anzahl an aktivierten Makrophagen in der Darmschleimhaut. Im Einzelnen konnte im Vergleich von Tag 14 (maximale Läsionen) mit Tag 42 p.i. (abgeheilte Läsionen) zum erstgenannten Termin eine Reduktion der CD3-positiven Zellen (Lamina propria, Zotten), der CD8-positiven

(36)

Literaturübersicht

Zellen (nur Zotten) und der B-Zellen festgestellt werden, während die Anzahl der CD4-positiven T-Zellen unverändert blieb. Am Tag drei waren erste neutrophile Granulozyten in den histologischen Schnitten zu erkennen. Aus diesen Ergebnissen wurde abgeleitet, dass bei einer Inokulation sieben Wochen alter Tiere mit Zellkulturerregern offensichtlich eine immunsuppressive „downregulation“ der adaptiven Immunantwort erfolgt. Die erhöhte Aktivität von Makrophagen und die damit potentiell verbundene exzessive Freisetzung von Zytokinen sehen die Autoren als mögliche Ursache für Endothelschäden und erhöhte vaskuläre Permeabilität bei der akuten, hämorrhagischen Verlaufsform der Erkrankung (MACINTYRE et al.

2003).

LI scheint die immunologische Antwort aktiv zu beeinflussen. Infizierte Enterozyten exprimieren weniger major-histocompatibility-complex-II-Strukturen im Vergleich zu normalem Darmgewebe (MCORIST et al. 1992). Bei schweren Infektionen fehlt eine Reaktion von CD3-positiven Lymphozyten. Hierfür scheint eine Immunsuppression verantwortlich zu sein (SMITH u. LAWSON 2001).

Basierend auf Erkenntnissen aus Infektions- und Feldversuchen liegen 1-2 Wochen zwischen Infektion und erster fäkaler Erregerausscheidung und 1-2 Wochen zwischen erstem Nachweis im Kot und Serokonversion (GUEDES u. GEBHART 2003b; VESTERGAARD et al. 2004).

Der Serumtiter fällt fortschreitend nach Erreichen eines Maximums ab. Entsprechend stehen die Dauer des möglichen Antikörpernachweises und die Höhe des Titers in einem Zusammenhang zueinander (GUEDES 2004).

Nach einer Infektionsstudie waren Tiere, welche eine LI Infektion durchgemacht hatten, bis zum Ende der Studie 10 Wochen später vor einer Reinfektion mit LI geschützt, es konnten nach erneutem Challenge keine klinischen Anzeichen oder eine Ausscheidung von LI mittels PCR nachgewiesen werden (COLLINS u. LOVE 2007).

In einer Feldstudie zur Etablierung eines ELISAs zeigte sich, dass in den untersuchten Herden, welche einer natürlichen Infektion ausgesetzt waren, der Antikörpertiter kurz nach Beendigung der Erregerausscheidung am höchsten war.

Der Titer konnte bei Tieren bis zu 22 Wochen nach dem Absetzen nachgewiesen werden. Bei den Herden kam es zu einem zweitem deutlichen Titeranstieg der LI- spezifischen Antikörper zum Ende des Versuchs. Die Autoren hielten diesen Anstieg für einen Boosterungseffekt nach Zweitkontakt mit dem Erreger (BOESEN et al.

(37)

Literaturübersicht

2005b). Zu diesem Zeitpunkt konnte bei keinem dieser Tiere, eine Erregerausscheidung gefunden werden. Die Autoren schlossen hieraus, dass die Tiere nach einer Erstinfektion vor einer Reinfektion geschützt waren (BOESEN et al.

2005b).

Zwischen der Höhe des Serumtiters und der Ausprägung von pathologischen Veränderungen konnte in einem Versuch bei Tieren 3 Wochen nach experimenteller Infektion kein statistischer Zusammenhang gefunden werden (GUEDES et al.

2002b).

In einer Studie zur Evaluierung einer Vakzine mit einem lebenden, attenuierten Isolat von LI konnte gezeigt werden, dass eine protektive Immunantwort gegen LI nicht von einer humoralen Immunantwort abhängig ist (KROLL et al. 2004b). In dieser Untersuchung waren Tiere nach Vakzination gegen eine LI Infektion geschützt, obwohl bis fünf Wochen nach Vakzination keine LI-spezifischen IgG-Antikörper mittels IFAT nachgewiesen werden konnten. In einer späteren Untersuchung mit einem LPS-ELISA der Selben Seren konnten drei Wochen nach Vakzination Antikörper gegen LI in 53% der untersuchten Tiere nachgewiesen werden (Kroll et al.

2005a).

In einem Experiment zu Evaluierung des IFAT (KNITTEL et al. 1998) konnten maternale Antikörper gegen LI bis zur sechsten Lebenswoche der Ferkel nachgewiesen werden. KROLL et al. (2005c) konnte in einer Infektionsstudie zeigen, dass maternale IgG Antikörper, welche im IFAT nachweisbar waren, einen Schutz für Ferkel bis zu einem Alter von sechs Wochen gegen eine Infektion mit LI boten.

MAUCH und BILKEI (2004) untersuchten die LI-Infektionsrate von Ferkeln in Abhängigkeit von Alter und der Anzahl der vorangegangenen Geburten der Muttersauen. Nachkommen von seropositiven Jungsauen zeigten häufiger und länger positive Serotiter in Aufzucht und Mast (5.-26. Lebenswoche (LW), Maximum 84% zur 11. LW) als Nachkommen von seropositiven Altsauen (3.-5. Wurf, Maximum 32% zur 11. LW). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen scheinen Altsauen entweder nicht in ausreichender Menge Erreger auszuscheiden, oder ihre Nachkommen sind über maternale Antikörper besser passiv geschützt (BRONSVOORT et al. 2001; BARNA u. BILKEI 2003).

(38)

Literaturübersicht

2.4 Diagnostik

2.4.1 Klinik

Eine variable aber generell kleine Gruppe von Tieren ist klinisch auffällig (Lawson et al. 1980). Viele Darmerkrankungen zeigen ähnliche Symptome wie die verschiedenen Formen einer LI-Infektion, entsprechend ist eine Diagnose immer durch eine pathologische- oder Labordiagnostische-Untersuchung abzusichern (LAWSON u. GEBHART 2000).

Bei der RI können gelegentliche Todesfälle auftreten, das hypertrophe Ileum kann perforieren und die betroffenen Tiere verenden an einer daraus resultierenden Peritonitis (LOVE et al. 1977b).

Im Verlauf der NE kann es zu hochgradigem Kümmern und dünnbreiigem bis wässrigem, gelb-braunen Kotabsatz kommen (LAWSON u. GEBHART 2000).

In einem Infektionsversuch war es nur möglich, bei 75 % der Versuchstiere ein Durchfallgeschehen zu provozieren. Der überwiegende Anteil dieser Tiere zeigte unspezifischen, dünnbreiigen oder wässrigen Kotabsatz. Nur einzelne Tiere wiesen Blutbeimengungen im Kot auf. Der Durchfall begann etwa eine Woche nach der Infektion der Tiere und nahm seinen Höhepunkt zur dritten Woche post infectionem (p.i.). Bereits 28 Tage p.i. erholten sich die Tiere. Unter Feldbedingungen sind milde Durchfallgeschehen schwer zu erkennen (GUEDES et al. 2002b).

Eine hyperplastische oder hypertrophe Enteritis kann auch ultrasonographisch diagnostiziert werden. Die Wandstärken im gesunden Dünndarm liegen bei 0,27- 0,36 cm und im Dickdarm zwischen 0,21 und 0,23 cm, während bei einer chronischen Hypertrophie oder Hyperplasie des Darms die Wandstärken zwischen 0,28-0,70 cm im Ileum und 0,30 und 0,65 cm im Dickdarm liegen (BERMÚDEZ et al.

2000).

2.4.2 Pathologie

Eine Infektion mit LI steht im direkten Zusammenhang mit einer hyperplastischen Zellproliferation der Epithelzellen (FRISK u. WAGNER 1977; ROBERTS et al. 1977;

MCORIST et al. 1989; STILLS et al. 1991; MCORIST et al. 1993).

(39)

Literaturübersicht

2.4.2.1 Makroskopische Untersuchung

Die makroskopische Untersuchung allein ist oft unergiebig und erlaubt nur eine Verdachtsdiagnose.

Die Sensitivität und Spezifität makroskopischer Läsionen liegt bei 67 % bzw. 50 %.

Eine makroskopische Untersuchung des Darms verlangt eine Bestätigung durch weitergehende diagnostische Methoden (HOLYOAKE et al. 1994; HUERTA et al.

2003). Aufgrund der schnellen Regeneration innerhalb von vier bis sechs Wochen sind zum Schlachtzeitpunkt nur noch selten Veränderungen zu finden.

Für die Untersuchung an Schlachthöfen schlagen HARDGE et al. (2004) die Untersuchung durch zwei geschulte Untersucher vor. Für diese Sichtkontrolle ist die Zeit zwischen Tötung und Untersuchung von Bedeutung. Der Untersuchungszeitraum sollte zwischen der 30. bis 45. Minute post mortem liegen, um eine Verwechslung von hyperplastischer Schleimhaut mit einer postmortalen Kontraktion der Darmmuskulatur zu vermeiden.

2.4.3 Labordiagnostische Verfahren

Für die diagnostische Absicherung einer LI-Infektion stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Derzeit kommen Antikörpernachweis im Serum, PCR in Kot und Gewebe und immunhistologische Untersuchungen in Gewebsschnitten zum Einsatz (Tab. 3).

Die verschiedenen Tests können unterschiedliche epidemiologische Aspekte klären.

Ein serologisch positiver Befund zeigt einen vorangegangenen Kontakt mit LI an, während Nachweise wie PCR oder Immunhistochemie eine derzeitig bestehende Infektion belegen (GUEDES 2004).

2.4.3.1 Indirect Immunofluorescent Antibody Test (IFAT) und Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA)

Der erste serologische Test zum Nachweis von LI war ein indirekter Immunfluoreszenztest (immunofluorescence antibody test (IFAT)) (LAWSON et al.

1988). Dieser dient dem Nachweis von IgM- und IgG-Antikörpern. In verschiedenen Experimenten zeigte sich beim Nachweis einer Infektion eine höhere Sensitivität (90 %) und Spezifität (96 %) im Vergleich zur PCR. Maternale Antikörper konnten in diesen Experimenten für eine Dauer von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden

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