Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die PCR ist eine in vitro Technik, die es ermöglicht ausgewählte DNA-Sequenzen gezielt zu vervielfältigen. Dieser DNA-Abschnitt kann separat oder auch als Teil eines komplexen DNA-Moleküles zur Verfügung stehen. Es ist nicht zwingend notwendig, die Zielsequenz selbst zu kennen. Es ist ausreichend, wenn ca. 15 bis 20 Basenpaare zweier flankierender DNA-Sequenzen bekannt sind. Komplementär zu diesen flankierenden DNA-Sequenzen können kurze gegenläufig orientierte Oligonukleotide synthetisiert werden, die dann in der folgenden zyklischen Reaktion als Startermoleküle (Primer) verwendet werden (MULLIS u. FALOONA 1987):

Im ersten Schritt wird der zu amplifizierende DNA-Abschnitt (template, Matrize) zu einzelsträngiger DNA (ss-DNA) denaturiert. Um sicherzustellen, dass komplex strukturierte genomische DNA vollständig denaturiert, wird häufig vor dem ersten Zyklus eine initiale Denaturierung (first denaturation) bei ca. 95 °C durchgeführt, die in der Regel drei bis fünf Minuten dauert. Im Zyklus wird das Reaktionsgemisch zur Denaturierung für 30 bis 60 Sekunden auf etwa 90 °C bis 94 °C erhitzt. Danach folgt der Schritt des annealing, der ebenfalls 30 bis 60 Sekunden dauert. Die annealing-Temperatur ist abhängig von der Sequenz der eingesetzten Primer. Hier hybridisieren die Primer mit der einzelsträngigen template-DNA, so dass der dritte Schritt, die Amplifikation (extension), beginnen kann. In diesem Reaktionsschritt synthetisiert eine DNA-Polymerase vom 3´-Ende der Primer aus den neuen komplementären DNA-Strang aus Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTP´s).

Diese Amplifikation findet, abhängig von der verwendeten Polymerase, bei Temperaturen von etwa 72 °C statt und benötigt in d er Regel etwa 60 Sekunden für 500 bp (ARNHEIM u. ERLICH 1992).

Diese drei Schritte werden als ein Zyklus zusammengefasst. Die in jedem Zyklus entstehenden DNA-Fragmente stehen im folgenden Zyklus wiederum als template-DNA zur Verfügung (MULLIS u. FALOONA 1987). Es sind auch einfachere Protokolle mit einer Phase der Denaturierung bei 95 °C und einer Phase des annealing sowie der extension bei 60 °C beschrieben, die zu guten Ergebnissen führen (ARNHEIM u. ERLICH 1992). In der Regel werden 20 bis 30 Zyklen der PCR durchgeführt (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Nach dem letzten Zyklus wird

synthetisierten DNA-Stränge zu vervollständigen. Diese Phase sollte etwa fünf bis 10 Minuten dauern (BANGSOW et al. 2007).

Theoretisch kommt es nach jedem Zyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA.

Dieses ist jedoch nur zu Beginn einer PCR der Fall. Mit zunehmender Zykluszahl erfolgt die Vermehrung von DNA-Strängen nicht mehr exponentiell zur Basis 2 sondern linear, bis sie in eine Plateauphase übergeht; dann werden nur noch wenig neue PCR-Produkte gebildet (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Für diese Kinetik sind mehrere Faktoren ursächlich. Der wichtigste Faktor ist die Anreicherung von PCR-Produkten. Durch die unspezifische Bindung der DNA-Polymerase an die bereits synthetisierte doppelsträngige DNA wird die weitere Amplifikation gehemmt (KAINZ 2000). Zusätzlich wird durch diese Anreicherung ein reannealing der komplementären PCR-Produkte wahrscheinlicher als ein annealing der Primer an die Matrize (ARNHEIM u. ERLICH 1992). Im Verlauf der PCR werden außerdem Primer und dNTP´s verbraucht. Durch das zyklische Erwärmen und Abkühlen kommt es zur Schädigung der Polymerase. Während der PCR können auch Verbindungen entstehen, die inhibitorische Eigenschaften besitzen. Mit dem Einbau der Desoxyribonukleotide kommt es zur Freisetzung von Pyrophosphaten, die einen negativen Einfluss auf die Reaktionskinetik haben (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).

Die Detektion von PCR-Produkten kann mittels Gelelektrophorese erfolgen. Die Amplifikate werden zusammen mit einem Längenstandard auf ein Agarosegel aufgetragen und im elektrischen Feld unter einer Gleichspannung von ca. einem Volt pro Zentimeter Länge des Gels der Größe nach aufgetrennt. Anschließend werden die DNA-Fragmente mit einem unspezifisch in doppelsträngige (ds)-DNA inter-kalierenden Farbstoff, bspw. Ethidiumbromid, gefärbt und abschließend mittels ultraviolettem (UV-) Licht sichtbar gemacht. Diese Technik erlaubt die visuelle Detektion von etwa 1 ng DNA (TIEMANN 2006, HIGUCHI et al. 1992). Weitere Verfahren zur Visualisierung von PCR-Produkten beruhen auf dem Prinzip des ELISA oder auf der reversen Hybridisierung (TIEMANN 2006, KEMP et al. 1989).

2.5.1 template

Als template für die PCR dient immer DNA. Diese DNA kann genomischen Ursprungs sein, es kann aber auch rekombinante DNA in verschiedenen Vektoren eingesetzt werden (BANGSOW et al. 2007). Die empfohlene Ausgangsmenge für genomische DNA beträgt etwa 1 bis 100 ng (MÜLLER 2001).

Soll indirekt RNA nachgewiesen werden, muss diese für die PCR zunächst durch ein Enzym (Reverse Transkriptase) in komplementäre DNA transkribiert werden (BANGSOW et al. 2007). Auch Amplifikate einer PCR können als template für eine zweite PCR eingesetzt werden; diese Methode wird dann als nested-PCR bezeichnet (DIEFFENBACH et al. 1993).

Für einen korrekten Ablauf der PCR ist die Qualität des template wichtig. In der template-Matrix dürfen keine Inhibitoren der Polymerase vorhanden sein (DIEFFENBACH et al. 1993).

Die optimale Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes beträgt zwischen 0,1 und 1 Kilobasen und wird von der Prozessivität der Polymerase bestimmt. In einer long range PCR können mittels geeigneter Enzyme und PCR-Protokolle auch längere DNA-Fragmente amplifiziert werden (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).

2.5.2 Primer

Die Auswahl der Primer bestimmt neben der Qualität des template den Erfolg einer PCR. Für ein Design der Primer sollten einige wichtige Regeln beachtet werden:

Primer sollten eine Länge von 18 bis 24 bp besitzen. Diese Grenzen sollten nur bei speziellen Fragestellungen unterschritten werden. Der Gehalt von Guanin (G)- und Cytosin-(C)-basen sollte etwa 50 % betragen (DIEFFENBACH et al. 1993). Die Anzahl der Basen bestimmt die Schmelztemperatur der Primer von der Matrize. Die annealing-Temperatur der Primer ist etwa 5 °C niedriger als der Schmelzpunkt. Die genaue annealing-Temperatur sollte immer im Versuch bestimmt werden (BANGSOW et al. 2007), da sie die Ausbeute resp. Effizienz des PCR-Ansatzes beeinflusst (RYCHLIK et al. 1990). Daneben sollten forward- und reverse-Primer dieselbe Schmelztemperatur besitzen. Um Primer-Dimere zu vermeiden, sollen

al. 1993). Außerdem sollten an diesen Enden keine drei- oder mehrfache Wiederholung von G bzw. C und auch keine Thymin-(T)-basen vorhanden sein (BANGSOW et al. 2007). Die Primersequenz selbst sollte keine mehrfachen Wiederholungen von einzelnen Nukleotiden beinhalten (ABD-ELSALAM 2003).

Die Konzentration, in der die Primer im jeweiligen PCR-Ansatz verwendet werden, muss üblicherweise empirisch bestimmt und anschließend im Versuch optimiert werden. Eine optimale Konzentration ist etwa 50 bis 500 nM (LORKOWSKI u.

THIEMANN 2006).

In einem PCR-Ansatz können gleichzeitig mehrere Primer-Paare eingesetzt werden (multiplex-PCR). Auf diese Weise ist es möglich, mehrere Genomfragmente simultan zu detektieren (CHAMBERLAIN et al. 1988). Bei der nested-PCR wird das PCR-Produkt einer vorangegangenen PCR für eine weitere Reaktion verwendet. Diesem Ansatz werden andere Primer hinzugefügt, die innerhalb des produzierten DNA-Fragmentes binden. Dadurch wird die Sensitivität und die Spezifität einer PCR erhöht (ARNHEIM u. ERLICH 1992).

Heute steht diverse Software zur Verfügung, die ein Primer-Design unterstützen kann (ABD-ELSALAM 2003).

2.5.3 Polymerase

Erste PCR-Assays wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E.

coli durchgeführt. Da dieses nicht thermostabil ist, musste nach jedem Zyklus neue Polymerase zum Reaktionsgemisch hinzugegeben werden (MULLIS u. FALOONA 1987). Die Verwendung einer thermostabilen Taq-Polymerase (isoliert aus Thermus aquaticus) vereinfachte die Durchführung der PCR. Da die PCR nun auch bei höheren Temperaturen durchgeführt werden konnte, war ein Anstieg der Spezifität, der Sensitivität und der Ausbeute der PCR festzustellen (SAIKI et al. 1988). Die Taq-Polymerase ist die heute am häufigsten verwendete DNA-Taq-Polymerase (MÜLLER 2001). Sie besitzt eine hohe Prozessivität und eine akzeptable Lesegenauigkeit. Eine 3´-5´-Exonuklease-Aktivität (proofreading) fehlt, jedoch besitzt sie eine 5´-3´-Exonuklease-Aktivität. Das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase ist breit und liegt im Bereich von 75 °C (INNIS et al. 1988, LONGLEY et al. 1990). Ein weiteres Merkmal der Taq-Polymerase ist das matritzen-unabhängige Anfügen von dNTP´s, vor allem Adenosin (A), an synthetisierte DNA-Stränge (CLARK 1988). Die

Pfu-Polymerase, isoliert aus Pyrococcus furiosus, hat eine proofreading-Aktivität und dadurch eine zehnfach höhere Amplifikationsgenauigkeit als die Taq-Polymerase (LUNDBERG et al. 1991).

Die Tth-Polymerase, isoliert aus Thermus thermophilus, ist durch die Fähigkeit gekennzeichnet, sowohl die reverse Transkription als auch die DNA-Amplifikation durchführen zu können (MYERS u. GELFAND 1991). Weitere thermostabile Polymerasen sind aus verschiedenen Bakterien isoliert worden (ARNHEIM u.

ERLICH 1992).

Mit dem Ziel eine höhere Sensitivität und Spezifität der PCR zu erreichen, wurde eine hot start Technik für die PCR entwickelt, die eine Erhitzung des Reaktionsgemisches vor der eigentlichen Amplifikation beinhaltet (D’AQUILA et al.

1991). Auf diese Weise wird eine extension von Primern, die bei niedrigen Temperaturen unspezifisch an DNA binden können, und die Bildung von Primer-Dimeren verhindert. Diese hot start-Technik wird durch den Einsatz veränderter Polymerasen vereinfacht. Diese können chemisch oder durch die Verwendung monoklonaler Antikörper zunächst inaktiviert sein. Eine Aktivierung erfolgt durch eine Erhitzung auf 95°C. (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006, S CALICE et al. 1994).

Kältesensitive Mutanten der Taq-Polymerase, die resistent gegen Temperaturen von 95 °C sind, wurden ebenfalls beschrieben (KERMEKCHI EV et al. 2003).

2.5.4 weitere Reagenzien

Die dNTP´s sind die Grundelemente des neu zu synthetisierenden DNA-Strangs (MULLIS u. FALOONA 1987). Die Nukleotide sollten dem PCR-Ansatz in äquimolaren Konzentrationen zugesetzt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines fehlerhaften Einbaus von Nukleotiden durch Überangebot einer Base während der Synthese zu verringern (INNIS et al. 1988). Die optimale Konzentration der Nukleotide ist abhängig von der Länge des PCR-Produktes, der Anzahl der Zyklen, den Primern und der Menge von zugesetztem Magnesiumchlorid (MÜLLER 2001) und liegt etwa zwischen 50 und 200 µM (INNIS et al. 1988). Des Weiteren benötigt die DNA-Polymerase für ihre enzymatische Aktivität Magnesiumionen als zweiwertige Kationen, weniger gut eignen sich Manganionen (CHIEN et al. 1976).

Natriumchlorid fördern in niedrigen Konzentrationen (40 mM resp. 60 mM) die katalytische Aktivität der Taq-Polymerase, in hohen Konzentrationen kommt es allerdings zur Inhibierung der Polymerase. Darüber hinaus ist es für die Prozessivität der Polymerase notwendig im Reaktionsansatz einen stabilen pH-Wert zwischen 7,0 und 8,0 durch die Auswahl eines geeigneten Puffersystems herzustellen (CHIEN et al. 1976). Der PCR können weitere Substanzen, bspw. Formamid oder Glycerin, zugesetzt werden, um den Ablauf der PCR positiv zu beeinflussen (LORKOWSKI u.

THIEMANN 2006).