Direkter Erregernachweis

Die ersten Nachweise der PPE waren rein deskriptiv und basierten auf einer Beschreibung von proliferativen Prozessen im Ileum. Die Prozesse konnten nach einer Hämatoxilin-Eosin (HE)-Färbung histologischer Präparate detaillierter dargestellt werden, allerdings blieb die Ätiologie ungeklärt (ROWLAND u.

HUTCHINGS 1978). Intrazelluläre Erreger konnten erstmalig mit einer Silberfärbung nachgewiesen werden. Nach einer modifizerten Ziehl-Neelsen Färbung konnten diese Erreger als säurefeste intrazelluläre Bakterien angesprochen werden (ROWLAND u. LAWSON 1986). Beide Färbemethoden sind nicht spezifisch für L.

intracellularis.

Die Kombination aus HE-Färbung, Silberfärbung sowie alcian blue-Färbung zum Nachweis von apikal in den Enterozyten gelegenen Bakterien erlaubt, zusammen mit dem Nachweis histopathologischer Veränderungen, eine relativ sichere Diagnose (DRIEMEIER et al. 2002). Die beschriebene Methode ist allerdings nur für eine Diagnostik post mortem geeignet.

Mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern (monoclonal antibody (mAb)) gegen ausgewählte Proteine der äußeren Zellmembran von L. intracellularis (MCORIST et al. 1987) konnten erstmalig spezifische Immunoassays zur Diagnostik etabliert werden. Zahlreiche Arbeitsgruppen entwickelten Antikörper gegen diverse antigene Strukturen von L. intracellularis. Heute sind mAb´s gegen ein Proteinase K-resistentes Antigen (BOESEN et al. 2005a), gegen das Lawsonia surface antigen (LSA) (MCCLUSKEY et al. 2002) und gegen Lipopolysaccharide (LPS) (KROLL et al.

2005b) verfügbar. Andere Arbeitsgruppen haben monoklonale und polyklonale Antikörper charakterisiert, die gegen spezifische outer membrane proteins (OMPs) von L. intracellularis gerichtet sind (GUEDES u. GEBHART 2003c). Die verschiedenen Antikörper werden zur Detektion von Antigen in histologischen Präparaten post mortem oder zum Nachweis von L. intracellularis intra vitam an Kotproben genutzt (MCORIST et al. 1987). Zur späteren Visualisierung müssen die

(KROLL et al. 2005a). Sensitivität und Spezifität der Methode werden im Allgemeinen als hoch eingeschätzt. In einer vergleichenden Untersuchung konnte für den indirekten IFT an Darmgewebe eine hohe Sensitivität (89 %) und eine hohe Spezifität (97 %) im Vergleich zur PCR festgestellt werden. Die Übereinstimmung der Ergebnisse von IFT und PCR wurde mit almost perfect beurteilt (kappa 0,82) (HUERTA et al. 2003). In einer anderen Untersuchung zum Vergleich von IFT an Kotausstrichen und PCR an Kotproben derselben Tiere wurden mittels PCR 8 % mehr Tiere als positiv erkannt. Die Sensitivität wurde mit 56,5 % angegeben. Darüber hinaus wurde vom Autor die hohe Belastung des Untersuchers bei der Auswertung von IFTs als Nachteil der Methode angeführt (BONITZ 2001).

Die PCR ist eine sensitive, sehr spezifische und schnelle molekularbiologische Nachweismethode. Sie ist besonders für Erreger geeignet, die nur schwer anzuzüchten sind. In 1993 wurde eine nested-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis entwickelt. Die untere Nachweisgrenze betrug 10 Erregern aus gereinigter Mukosa und 1000 Erregern pro Gramm Kot. Die Aufreinigung der DNA erfolgte durch einfache Waschschritte (JONES et al. 1993). Es wurden weitere PCR-Assays etabliert, bei denen durch zusätzliche Schritte in der DNA-Aufreinigung, Kochen und Verdünnen, der Einfluss von Inhibitoren aus Gewebe und Kot reduziert werden sollte (MCORIST et al. 1994). Die Sensitivität der PCR wurde zunächst von vielen Autoren als relativ niedrig eingeschätzt, weil diese Inhibitoren zu falsch negativen Ergebnissen führen können. In einer Studie mit PCR-Untersuchungen an Kotproben waren nur 38 % der experimentell infizierten Tiere bis 24 Tage p.i. positiv; im Gegensatz dazu erzielte eine PCR an Ileumgewebe zu 100 % positive Ergebnisse. Das Vorkommen von Inhibitoren im Kot und die intermittierende Ausscheidung des Erregers wurden als Grund für diese Diskrepanz diskutiert (KNITTEL et al. 1997). Durch die Entwicklung von Substanzen, die Inhibitoren aus Kot während der DNA-Extraktion weitestgehend durch Bindung entfernen können, und weiterentwickelte Extraktionsprotokolle ist die Sensitivität der PCR deutlich gestiegen. Die Sensitivität der PCR aus Schleimhautproben und Kot betrug in neueren Untersuchungen 94,1 % und 88,2 % (SUH et al. 2000). Vorteile der PCR sind die hohe Sensitivität und die sichere Durchführbarkeit, die auch bei hohem Probendurchsatz gewährleistet ist. Darüber hinaus ist der Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kot eine Methode, die eine intra vitam Diagnostik ermöglicht (SUH et al. 2000). In den vergangenen Jahren wurde die PCR

von zahlreichen Autoren in verschiedenen Studien zur Untersuchung der Epidemiologie der L. intracellularis-Infektion sowie zur Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika und Impfstoffen eingesetzt (DÜNSER et al. 2003, NASCIMENTO CHIRIBOGA et al. 1999, JACOBSON et al. 2005, JENSEN et al. 2000, JENSEN et al.

2005, KOYAMA et al. 2006 und weitere).

L. Intracellularis kann auch mittels multiplex-PCR, die Genomfragmente unter-schiedlicher Erreger gleichzeitig detektiert, nachgewiesen werden. Es wurden verschiedene multiplex-PCRs entwickelt, die einen schnellen Ausschluss von Differentialdiagnosen zulassen. Eine triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und Salmonella ssp. aus Kot und Darmmukosa konnte als spezifisch beurteilt werden, jedoch war die Sensitivität für S. typhimurium zehnmal niedriger als in der entsprechenden uniplex-PCR (SUH u. SONG 2005). Eine weitere triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, Serpulina hyodysenteriae und Salmonella ssp. zeigte, mit Ausnahme einer einzigen Probe, eine 100 %ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen klassisch kultureller Nachweisverfahren resp.

der histopathologischen Untersuchung (ELDER et al. 1997). In einer anderen Studie wurde die untere Nachweisgrenze bei der simultanen Detektion von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B. pilosicoli in Kotproben von Schweinen mit 10² bis 10³ Zellen pro Gramm Kot angegeben. Vergleicht man diese Ergebnisse mit dem kulturellen Nachweis von B. hyodysenteriae und B. pilosicoli resp. der uniplex-PCR von L. intracellularis ergibt sich eine Sensitivität von 97,3 % für die multiplex-PCR (LA et al. 2006). In einer duplex-PCR können L. intracellularis und Salmonella ssp parallel nachgewiesen werden. Die Sensitivität ist genau so hoch wie bei beschriebenen uniplex-PCR-Methoden (BACCARO et al. 2003). In 2002 wurde ein 5´-nuclease assay zur Detektion von L. intracellularis etabliert und mit immunhistochemischen Untersuchungsverfahren verglichen (LINDECRONA et al.

2002). Das Zielgen dieser real-time PCR war die 16S ribosomale DNA, die auch schon von anderen Autoren als Zielgen gewählt wurde (u.a. KNITTEL et al. 1998, JONES et al. 1993, ZMUDZKI et al. 2004). Mit dieser PCR-Methode ist neben dem sehr schnellen, hochspezifischen Nachweis auch eine Quantifizierung des Gehalts spezifischer Genomfragmenten möglich. Die Nachweisgrenze beträgt ein genome eqiuvalent (GE) von L. intracellularis pro PCR-tube bei einem threshold cycle (Ct)-Wert von 35,7; das entspricht 4 x 10⁴ GE L. intracellularis pro Gramm Kot. Die

war 91 %, wobei in der real-time PCR 6 % mehr Proben als positiv identifiziert wurden (LINDECRONA et al. 2002).