Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis von

In festem und halbfestem Probenmatrial wie bspw. Kot kann nicht grundsätzlich von der homogenen Verteilung eines Erregers in der Probenmatrix ausgegangen werden.

Eine inhomogene Verteilung kann jedoch dazu führen, dass bei mehrfacher Untersuchung derselben Probe unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden. Mit dem Ziel, die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben zu überprüfen, wurden verschiedene Verfahren der Homogenisierung angewendet.

Die Untersuchung wurde an Kot aus dem Enddarm eines Schweins durchgeführt.

Die Kotprobe wurde zunächst mittels real-time PCR auf den Gehalt von L.

intracellularis untersucht. Die als L. intracellularis negative beurteilte Probe wurde auf sechs Aliquots zu je 2 Gramm Kot aufgeteilt. Drei Aliquots wurden mit 100 µl einer Plasmidlösung (2,89 x 10⁷ GE, 2,89 x 10⁵ GE resp. 5,78 x 10³ GE pro µl) gemischt.

Die Proben wurden anschließend eine Minute mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre homogenisiert. Die übrigen drei Aliquots wurden ebenfalls mit je 100 µl einer Plasmidlösung (2,89 x 10⁷ GE, 2,89 x 10⁵ GE resp. 5,78 x 10³ GE pro µl) gemischt, jedoch wurde zur Verringerung der Viskosität des Probenmaterials zusätzlich 900 µl Lichrosolv^® zu jeder Probe pipettiert. Auch diese Aliquots wurden mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre eine Minute homogenisiert.

Aus den sechs Aliquots wurden jeweils dreimal 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die DNA aus den Proben wurde mit dem QIAamp^® DNA Stool Mini Kit isoliert und spezifische Genomfragmente anschließend in der real-time PCR quantifiziert (Tab.

36).

Tabelle 36: Protokoll der PCR zur Überprüfung der Homogenisierung DNA-template: präparierte Proben nicht infizierter Schweine Aufgereinigt mit: QIAamp^® DNA Stool Mini Kit

Reaktionsmix:

12,5 µl TaqMan^® universal PCR Master Mix 2x 9 µl Primer- Mix

0,8 µl Exo IPC Mix 10x 0,2 µl Exo IPC DNA 50x 2,5 µl template-DNA

PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System PCR-Protokoll: s. Tabelle 7

Modifikationen: keine

Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM

3.4 Einfluss der Lagerung von Kotproben auf den Gehalt von L. intracellularis

Genomische DNA ist in verschiedenen Probenmatrices unterschiedlich lange nachweisbar. Grundsäztlich kann die Temperatur und die Dauer der Lagerung einen Einfluss auf die Menge intakter und damit amplifizierbarer DNA nehmen. Ziel dieser Untersuchung war es, einen möglichen Einfluss der Temperatur und der Dauer einer Lagerung von Kotproben auf den Nachweis resp. die Quantifizierung von L.

intracellularis mittels real-time PCR zu überprüfen.

Die Untersuchung wurde an Kotproben natürlich infizierter Schweine aus einem bereits auf L. intracellularis positiv getesteten Bestand durchgeführt. Von 20 Schweinen wurde rektal unter Verwendung von Einmalhandschuhen Kot entnommen.

Die Proben wurden in Probengefäßen mit Kotlöffeln aus Stuhlröhren homogenisiert.

Für die weitere Untersuchung wurde zunächst mittels real-time PCR festgestellt, welchen Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis die Proben im

„frischen“ Zustand aufweisen (Tab. 37, Tag 0). Von 10 positiven Proben wurden jeweils 24 Aliquots zu je 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die Aliquots wurden entweder bei 6 °C im Kühlschrank, bei -20 °C im Gef rierraum oder bei -70 °C im Tiefkühlgefrierschrank gelagert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht (Tab. 37 und 38).

Tabelle 37: Untersuchungsschema zur Überprüfung eines Einflusses der Lagerung auf den Gehalt von GE von L. intracellularis in der Probe

frisch 6°C -20°C -70°C

Tag 0 X

Tag 1 X X X

Tag 2 X X X

Tag 3 X X X

Tag 7 X X X

Tag 14 X X X

Tag 28 X X X

Tag 56 X X X

Tag 132 X X X

X= Untersuchung der 10 aliquotierten Proben

Tabelle 38: Protokoll der PCR zur Untersuchung eines Einflusses der Lagerung von Kotproben auf den Gehalt spezifischer GE von L. intracellularis

DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine Aufgereinigt mit: QIAamp^® DNA Stool Mini Kit

Reaktionsmix:

12,5 µl TaqMan^® universal PCR Master Mix 2x 9 µl Primer- Mix

0,8 µl Exo IPC Mix 10x 0,2 µl Exo IPC DNA 50x 2,5 µl template-DNA

PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System PCR-Protokoll: s. Tabelle 7

Modifikationen: keine

Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM

3.5 Statistik

Für die statistische Auswertung erfolgte zunächst ein Export der Daten aus der Software SDS Version 1.4 als Microsoft Office Excel Comma Seperated Value File.

Die Daten wurden anschließend in Microsoft^® Office Excel 2003 SP2 importiert und in einem spread sheet organisiert. Die Testergebnisse aus vergleichenden Untersuchungen wurden mit dem Statistical Analysis System for Windows, SAS^®, Version 9.1 (SAS Inst., Cary, NC, USA) analysiert.

Die Standardkurve der PCR wurde aus den Mittelwerten einzelner Ct-Werte von Plasmidlösungen mit den Konzentrationen 10⁰ bis 10⁷ GE / µl Reaktionsvolumen erstellt. Unterschiede zwischen den mittleren Ct-Werten jeder Konzentration wurden mit einem zweiseitgen T-Test überprüft (PROC MEANS). Aus der Standardkurve wurden die Effizienz, die Wiederholpräzision, das Detektions- und das Quantifizierungslimit der real-time PCR abgeleitet.

Der Grenzwert für die Präzision liegt für bioanalytische Verfahren (für Werte oberhalb der unteren Quantifizierungsgrenze) bei maximal 15 % relative Standardabweichung vom Mittelwert für die jeweilige Konzentrationsstufe (ANON. 2001). Daraus folgt für die Präzision ein Mindestwert von 85 %. Dieser Wert wurde für die Auswertung der Präzision der real-time PCR als Grenzwert angenommen. Die Ct-Werte der Untersuchungen zur Feststellung der Vergleichspräzision wurden mit den Werten der Standardkurve verglichen. Ein Ergebnis wurde als „präzise“ bezeichnet, wenn die Abweichung des Ergebnisses in der jeweiligen Konzentrationsstufe kleiner 15 % der relativen Standardabweichung vom Mittelwert der Standardkurve war. In gleicher Weise wurden die Ergebnisse der Untersuchungen zur Vergleichspräzision anhand von Kotproben natürlich infizierter Schweine und zur Wiederholpräzision analysiert.

Der Mittelwert und die Standardabweichung wurden für jeden Versuch getrennt berechnet.

Die Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität wurde an einer 2 x 2-Felder-Tafel vorgenommen.

Die Robustheit wurde anhand eines Vergleichs der PCR-Ergebnisse vor und nach einer Bearbeitung der Proben berechnet und als prozentuale Abweichung vom

4 Ergebnisse

4.1 Etablierung und Validierung

4.1.1 Primer- und Sondendesign

Der Vergleich der Primer- und Sondensequenzen mit Genomsequenzen anderer Organismen als L. intracellularis ergaben für den forward-Primer Li-Ubi-F eine maximale Übereinstimmung von 73 % mit der Sequenz von Prochlorococcus marinus str. MIT 9312, Medicago truncatula und Carteria palmata. Das equality-(e)-value betrug 5,2. Der reverse-Primer Li-Ubi-R besitzt eine 81 %ige Übereinstimmung mit der Sequenz von Xenopus tropicalis und Nitrosomonas europaea ATCC 19718 mit einem e-value von 1,1. Die nächste höhere Übereinstimmung von 77 % der Basen wurde für die Sequenz von Pan troglodytes BAC und Homo sapiens PAC mit einem e-value von 4,2 errechnet. Die Sequenz der Sonde Li-Ubi-Probe ist zu 96 % bzw. 67 % komplementär zu einer Sequenz von Oryza sativa mit einem e-value von 0,6 und zu 64 % und einem e-value von 2,4 komplementär zu den Sequenzen von Pan troglodytes BAC, Mus musculus und Homo sapiens. Die e-values für alle anderen bekannten Sequenzen waren deutlich größer als 5,0. Eine 100 %ige Übereinstimmung der Primer- und Sondensequenzen wurde für Lawsonia intracellularis PHE/MN1-00 mit einem e-value von 0,004 angegeben.

4.1.2 Optimierung der Primer-Konzentrationen

Die erste Amplifikation spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis mit unterschiedlichen Konzentrationen der Primer wurde mittels Gelelektrophorese ausgewertet. Eine ausreichende Konzentration von Primern wurde zunächst anhand einer visuellen Beurteilung der Menge synthetisierter PCR-Produkte vorgenommen.

Die mit SYBR^® Green durchgeführten real-time PCRs zeigten beiden Versuchen die gleichen Ergebnisse (Abb. 2). Maximale ∆Rn-Werte und Ct-Werte der Amplifikationskurven wurden bei Konzentrationen von 300 nM resp. 900 nM erzielt.

Eine Konzentration von 300 nM des forward- und reverse-Primer im Reaktionsmix wurde als grundsätzlich ausreichend erachtet. Trotzdem wurde dieser Konzentration eine Sicherheitsspanne von 200 nM zuaddiert, so dass die Konzentration beider Primer für die weiteren PCR-Untersuchungen auf 500 nM festgelegt wurde. Die Spezifität der Primer konnte anhand einer Schmelzkurvenanalyse der PCR-Produkte gezeigt werden, bei der nur ein Schmelzpunkt nachweisbar war.

300/300 nM bis 900/900 nM

50/50 nM bis 50/300 nM

Abbildung 2: amplification plot zur Optimierung der Primer-Konzentration, gezeigt sind alle Kombinationen zwischen 50 und 900 nM forward- und revese-Primer bei Amplifikation spezifischer Genomfragmente von Lawsonia intracellularis MS B3903

4.1.3 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer

Die Amplifikationen von DNA der Referenzstämme mit den Primern Li-Ubi-F und –R ergaben bei einzelnen Bakterienstämmen positive Ergebnisse. Die Ct-Werte

Arcanobacterium pyogenes 38,2, für E. coli O141 K85ab 41,7, für E. coli O139 42, für E. coli O141 K85ac 41,1, für E. coli O149 38,4, für E. coli O147 44,6, für E. coli O157 K- 41,1, für E. coli O108 42,5 und für E. coli Kalb 40,9.

4.1.4 Optimierung der Sonden-Konzentration

Die Sonde Li-Ubi-Probe wurde im Reaktionsmix in den Konzentrationen 50 nM, 100 nM und 200 nM verwendet. Die Amplifikationskurven der einzelnen Proben wiesen deutliche Unterschiede in den ∆Rn-Werten und Ct-Werten auf, so dass die Sonde in der Endkonzentration von 200 nM eingesetzt wurde (Abb. 3).

200 nM

100 nM

50 nM

Abbildung 3: amplification plot zur Optimierung der Sonden-Konzentration, gezeigt sind die Konzentrationen der Sonde von 50 nM, 100 nM und 200 nM; template-DNA ist Lawsonia intracellularis MS B3903

4.1.5 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde

Die analytische Spezifität der Sonde Li-Ubi-Probe wurde in einer Konzentration von 200 nM zusammen mit den Primern Li-Ubi-F und –R in einer PCR an der DNA unterschiedlicher Referenzstämme überprüft. Ein positives Signal konnte mit DNA von Lawsonia intracellularis MS B3903 erzeugt werden. Im Gegensatz dazu wurde bei keiner anderen DNA ein positives Signal in der real-time PCR erzeugt (Abb. 4).

Dieses galt auch für solche Bakterien, die zunächst im SYBR^® Green System eine unerwünschte Amplifikation mit den Primern Li-Ubi-F und -R gezeigt haben.

Lawsonia intracellularis MS B3903

Abbildung 4: amplification plot zur Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde; die Sonde wurde in einer Konzentration von 200 nM verwendet; template-DNA sind die Referenzstämme inklusive Lawsonia intracellularis MS B3903

4.1.6 Sequenzierung

Die Sequenzierung der PCR-Produkte aus den Amplifikationen spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis, die zuvor aus Kotproben isoliert wurden, ergab in allen 10 Fällen eine Übereinstimmung von 100 % mit einer Sequenz im Genom von L. intracellularis PHE/MN1-00 (Tab. 39).

Tabelle 39: Ergebnisse der Sequenzierung Probe

Die optimale annealing-Temperatur der Primer Ubi-Clon-lang-F und –R, die zur Herstellung des für die Klonierung vorgesehenen PCR-Produktes synthetisiert wurden, ist in einer Gradienten-PCR mit anschließender Gelektrophorese überprüft worden. Die Synthese von PCR-Produkten konnte, visuell beurteilt, ab einer Temperatur von 60,3 °C in der annealing-Phase nicht weiter gesteigert werden (Abb.

5). Die annealing-Temperatur wurde für die Herstellung des PCR-Produktes empirisch auf 61,6 °C festgelegt.

In der Gelelektrophorese konnte durch den Vergleich mit einem Größenmarker gleichzeitig die Größe des Produktes bestimmt werden. Die Größe der PCR-Produkte betrug ca. 550 bp (+/- 50 bp) und lag somit nahe der zuvor berechneten Größe von 525 bp.

DNA-Leiter 56,0 56,2 56,6 57,1 57,9 58,7 59,5 60,3 61,0 61,6 61,9 62,0 NTC

annealing-Temperatur in °C

100 bp 300 bp 500 bp 800 bp

Abbildung 5: Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte nach Gradienten-PCR; template-DNA ist Lawsonia intracellularis MS B3903; Angabe der annealing-Temperaturen in °C

Die Transformation kompetenter E. coli wurde mit Vektoren durchgeführt, denen zur Ligation des Inserts zunächst 2 µl PCR-Produkt (70,0; 72,5 und 95 ng DNA pro µl) resp. 3 µl PCR-Produkt (35 ng DNA pro µl) zugegeben wurde. Nach Bebrütung der

hellblaue sowie blaue Kolonien sichtbar. Da nur für weiße Kolonien angenommen werden kann, dass die E. coli erfolgreich mit Insert tragenden Plasmiden transformiert wurden, sind nur Bakterien der weißen Kolonien in Flüssigmedium überimpft und anschließend mittels real-time PCR zur Kontrolle der erfolgreichen Transformation und Klonierung untersucht worden. Das Insert konnte in allen Klonen nachgewiesen werden (Abb. 6); zum Teil lagen so große Mengen der Plasmide mit der Zielsequenz vor, dass das real-time Gerät aufgrund der hohen Ausgangsmenge der template-DNA keine normierte und baseline-korrigierte Reporterfluoreszenz (∆

Rn) darstellen konnte.

Abbildung 6: amplification plot zur Überprüfung der Transformation kompetenter E. coli; es wurden 40 Klone überprüft, die alle die Zielsequenz trugen;

4.1.8 Verdünnungsreihe und Standard

Ein Klon (Kap. 4.1.7) wurde in 250 ml LB-Medium vermehrt, nach 12 Stunden lysiert und die Plasmide anschließend mit einem spin-kit isoliert. Die spektralphotometrisch bestimmte Extinktion der 1:10 verdünnten Plasmidlösung im Vergleich zu einem Leerwert betrug bei einer Wellenlänge von 280 nm 0,0977 (Mittelwert aus 18 Messungen). Daraus folgt, dass die Konzentration der Plasmide im Eluat etwa 1x10¹³ pro ml war. Aus dieser Lösung wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt und zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Nach vier voneinander getrennten Untersuchungen in der real-time PCR wurde aus den Mittelwerten die Standardkurve berechnet.

Die für die Erstellung der Standardkurve verwendeten Lösungen unterschiedlicher Konzentrationsstufen ergaben linear verteilte Ct-Werte, deren 95 %- Vertrauensintervall als zweifache Standardabweichung und deren Wiederholpräzision in % angegeben wurde (Tab. 40).

Tabelle 40: Ct-Mittelwerte der Verdünnungsreihe einer Plasmidlösung, 95 %-Vertrauensintervall und Wiederholpräzision

Mit einer Konzentration von 10^-2 GE / µl konnten in dieser Versuchsreihe keine reproduzierbaren Daten ermittelt werden. Die Konzentration von 1x10^-3 GE / µl Reaktionseinheit ergab einmalig einen Ct-Wert von 40,4. Dieser Wert wurde in der Standardkurve (Abb. 7) nicht aufgetragen. Die Steigung der Standardkurve resp. -gerade beträgt –3,329. Die Effizienz der real-time PCR ist somit 99,7 %. Die Linearität ist zwischen den Konzentrationsstufen 10⁷ und 10⁰ GE / µl Reaktionseinheit gegeben, so dass dieser Bereich als Kalibrierbereich festgelegt werden konnte. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR beträgt 1 GE im Reaktionsvolumen. Die obere Nachweisgrenze beträgt bei 10⁸ GE / µl Reaktionsvolumen. Konzentrationen von 10⁹ GE / µl oder mehr konnte vom real-time Gerät aufgrund der hohen Ausgangsmenge von template-DNA nicht mehr dargestellt werden.

Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 10¹ bis 10⁷ GE / µl Reaktionsvolumen möglich. Oberhalb von 10⁷ GE / µl Reaktionsvolumen steigen die Ct-Werte nicht mehr linear zur eingesetzten Menge der DNA an (Abb. 8). Ist die Konzentration der template-DNA etwas geringer als 10¹ GE / µl Reaktionsvolumen, besteht zwar ein signifikanter Unterschied zum Ct-Wert von 10⁰ GE / µl Reaktionsvolumen (p =0.0006), allerdings fehlt ein signifikanter Unterschied zwischen 10⁰ und 10^-1 GE / µl Reaktionsvolumen (p =0,11).

In einem ml Eluat aus der DNA-Isolierung beträgt die untere Nachweisgrenze rechnerisch 4x 10² GE L. intracellularis, die obere Nachweisgrenze beträgt 1x 10¹² GE. Absolut quantifizierbar sind demnach Plasmidlösungen, die eine Konzentration spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis zwischen 1x 10⁵ und 1x 10¹¹ pro ml besitzen.

Standardkurve

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8

log Konzentration (GE /µl)

Ct-Wert

a a

b

c

d

e

f

g

h

Abbildung 7: Standardkurve, berechnet aus Ergebnissen der Untersuchung einer Verdünnungsreihe von einer Plasmidlösung in GE / µl Reaktionsvolumen (4x); eingezeichnet ist die Steigung der Standardkurve und die zweifache Standardabweichung; mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnete Werte unterscheiden sich signifikant

10⁸GE / µl

10⁷bis 10¹GE / µl

10⁰GE / µl 10^-1 GE / µl

Abbildung 8: amplification plot zur Detektion des oberen Quantifizierungs-limits; dargestellt sind Plasmidverdünnungen zwischen 10⁸ und 10^-1 GE / µl Reaktionsvolumen; die Amplifikationskurve und der

∆Rn-Wert für die Konzentration von 10⁸ GE / µl weichen deutlich ab.

4.1.9 Interne Positivkontrolle

Die IPC hatte in solchen Proben, in denen L. intracellularis nicht nachgewiesen wurde, einen Ct-Wert von ca. 34. Der Ct-Wert der IPC erhöhte sich mit steigendem Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in den Proben. Wurde in Proben sehr viel der eigentlichen Ziel-DNA amplifiziert, waren PCR-Produkte der IPC nicht mehr detektierbar.

Mit dem Ziel, einen möglichen Einfluss der Amplifikation einer IPC auf die eigentliche Reaktion zu überprüfen, wurden Plasmidlösungen mit und ohne IPC quantifiziert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Ct-Werten derselben Proben

mit und ohne IPC festgestellt werden (Abb. 9). Ein Einfluss der IPC auf die Amplifikation der Zielsequenz durch eine kompetetive Reaktion konnte somit ausgeschlossen werden. Die IPC wurde in allen folgenden Versuchen zur Überprüfung einer möglichen Inhibition eingesetzt.

Die Amplifikation der IPC-DNA wurde während der weiteren Untersuchungen in jeder Probe nachgewiesen, in der spezifische Genomfragmente von L. intracellularis nicht detektiert wurden. Somit kann festgestellt werden, dass es in keiner einzigen Probe zu einer Inhibition gekommen war.

Vergleich mit / ohne IPC

0 5 10 15 20 25 30 35 40

log Konzentration (GE / µl Reaktionseinheit)

Ct-Wert

ohne IPC mit IPC

ohne IPC 11.96 26.72 36.29 36.48

mit IPC 11.99 26.86 36.83 37.19

7 3 0 -1

Abbildung 9: Vergleich der Ct-Werte von Verdünnungen einer Plasmidlösung mit und ohne IPC

4.1.10 Vergleichspräzision

Zur Vergleichspräzision wurden Verdünnungen der Plasmidlösung von drei Personen untersucht (Abb. 10). Die relative Standardabweichung der Ct-Werte des 2. und 3.

Untersuchers zu den mittleren Ct-Werten der Standardkurve betrug 2,6 % und weniger.

Vergleichspräzision Plasmide

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Log Konzentration (GE / µl Reaktionseinheit)

Ct-Wert

1.Untersucher 2. Untersucher 3. Untersucher

1.Untersucher 19.53 23.1 26.86 28.94 33.84 36.83

2. Untersucher 19.45 23.04 27.35 27.99 32.34 37.87

3. Untersucher 19.64 22.82 27.08 27.94 32.3 37.61

5 4 3 2 1 0

Abbildung 10: Ergebnisse der Untersuchung zur Feststellung der Vergleichspräzision anhand einer PCR an Plasmidverdünnungen

Die Ergebnisse der Quantifizierung von GE in verschiedenen Proben natürlich infizierter Schweine lagen bei allen drei Untersuchern innerhalb der einfachen Standardabweichung. Lediglich bei zwei Proben lag jeweils ein Ct-Wert außerhalb der einfachen Standardabweichung, jedoch innerhalb der zweifachen Standardabweichung (Abb. 11). Die relative Standardabweichung der Menge von GE zum jeweiligen Mittelwert dieser Untersuchung lag mit 23,7 % bei Probe 1 und 17,9 % bei Probe 10 oberhalb des Grenzwertes von 15 %. Die Vergleichspräzision der übrigen Proben betrug 85,4 % und mehr.

Vergleichspräzision

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Probennummer

log Quantität (GE / µl Reaktionseinheit)

1. Untersucher 2. Untersucher 3. Untersucher Mittelw ert

Abbildung 11: Vergleich des berechneten Gehaltes von GE von L. intracellularis nach Untersuchung derselben Proben durch drei Untersucher;

dargestellt ist die logarithmierte Menge von GE / µl Reaktions-einheit und die einfache Standardabweichung;

4.1.11 Wiederholpräzision

Die Ergebnisse der Untersuchung von 10 Proben natürlich infizierter Schweine zeigen, dass die berechnete Menge von GE in jeder Probe jeweils innerhalb der einfachen Standardabweichung liegt (Abb. 12). Die Wiederholpräzision beträgt zwischen 93,6 % und 98,3 %. Somit sind die Testergebnisse wiederholbar.

Wiederholpräzision

0 1 2 3 4 5 6 7

0 1 2 3 4 5 6 7

Probennummer

log Quantität (GE / µl Reaktionseinheit)

1.Wdh 2.Wdh 3.Wdh Mittelwert

Abbildung 12: Vergleich des Gehaltes von GE von L. intracellularis nach dreimaliger Untersuchung von Proben natürlich infizierter Schweine; dargestellt ist der logarithmierte Gehalt von GE und die einfachen Standardabweichungen; Proben 7 – 10 sind nicht quantifizierbar.

4.1.12 Diagnostische Sensitivität und Spezifität

Die Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität der real-time PCR erfolgte anhand einer vergleichenden Untersuchung von Proben mit der multiplex-PCR.

Die Untersuchung der nach den Ergebnissen der multiplex-PCR 150 L.

intracellularis-positiven und 150 L. intracellularis-negativen Kotproben mittels real-time PCR ergab, dass in der real-real-time PCR von den 300 Proben 81,7 % positiv waren. Lediglich vier von 150 Proben, die in der multiplex-PCR positiv waren, konnten in der real-time PCR nicht als positiv bestätigt werden. Im Vergleich beider Untersuchungsverfahren ergibt sich eine diagnostische Sensitivität von 97,3 % und eine diagnostische Spezifität von 34 % für die real-time PCR (Tab. 41). Proben, die in der multiplex-PCR negativ, in der real-time PCR jedoch positiv waren, wiesen fast ausnahmslos Ct-Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze auf (Abb. 13).

Vergleicht man umgekehrt die Ergebnisse der multiplex-PCR mit denen der real-time PCR ergeben sich für die multiplex-PCR eine diagnostische Sensitivität von 59,6 % und eine diagnostische Spezifität von 92,7 % (Tab. 42).

Tabelle 41: diagnostische Sensitivität und Spezifität der real-time PCR im Vergleich zur multiplex-PCR

multiplex-PCR positiv multiplex-PCR negativ

real-time PCR positiv 146 99

real-time PCR negativ 4 51

Diagnostische

Sensitivität: 97.3 %

Diagnostische

Spezifität: 34 %

Tabelle 42: diagnostische Sensitivität und Spezifität der multiplex-PCR im Vergleich zur real-time PCR

real-time PCR positiv real-time PCR negativ

multiplex-PCR positiv 146 4

multiplex-PCR negativ 99 51

Diagnostische

Sensitivität: 59,6 %

Diagnostische

Spezifität: 92,7 %

Vergleich von real-time PCR und multiplex -PCR

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

< E+01 E+01 E+02 E+03 E+04 E+05 E+06

Gehalt an GE / µl Reaktionsvolumen

Anzahl der Proben

multiplex-PCR negativ multiplex-PCR positiv

Abbildung 13: Vergleich der Ergebnisse von multiplex-PCR mit der real-time PCR an 300 Proben, gezeigt sind nur solche Proben, die in der real-time PCR positiv sind

4.1.13 Wiederfindungsrate

Die im Rahmen der Untersuchung zur Feststellung der Wiederfindungsrate durchgeführte Quantifizierung der Referenzlösung ergab einen Gehalt von 2 x 10⁹ GE von L. intracellularis pro ml. Anhand dieses Wertes wurde die zugegebene Menge von GE zum Kot berechnet und mit den Ergebnissen der real-time PCR verglichen (Abb. 14). Es konnte gezeigt werden, dass bei einer absolut zugegebenen Menge von 2 x 10⁷ GE im Anschluss an die Quantifizierung mit beschriebener

entspricht einer Wiederfindungsrate von 3,5 % nach der DNA-Extraktion aus Kot und Amplifikation mittels real-time PCR. Ist eine absolute Menge von 2 x 10⁵ GE dem Eluat zugegeben worden, konnte eine Menge von 3,6 x 10³ GE

“wiedergefunden“ werden. Dies entspricht einer Wiederfindungrate von 1,8 %.

Wiederfindung

1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09

2.00E+07 2.00E+05

Konzentrationsstufe (GE)

Quantität an GE / µl Reaktionsvolumen

zugegeben w iedergefunden

Abbildung 14: Wiederfindung; dargestellt sind die zugegebenen Mengen von GE von L. intracellularis mit der jeweilig wiedergefundenen Menge von GE als Mittelwert aus sieben Untersuchungen.

4.1.14 Robustheit

Die Ergebnisse der Untersuchungen an 10 DNA-Extrakten nach unterschiedlicher Herstellung des Reaktionsmixes und Behandlung der 96 well plates (s. Kap. 3.2.18) sind in Abb. 15 dargestellt. Es wurden nur quantifizierbare Proben ausgewertet.

Robustheit

-13 -9 -5 -1 3 7 11

1 2 3 4 5 6

Probennummer

% Abweichung von 1. Untersuchung

RM 12 h bei RT RM 10x einfrieren/ auftauen RM 5 Min. UV-Licht DNA L-Tips Platte fallen lassen Platte 5h stehen lassen

Abbildung 15: Ergebnisse zur Test-Robustheit; dargestellt sind die prozentualen Abweichungen der logarithmierten Menge GE / µl

Abbildung 15: Ergebnisse zur Test-Robustheit; dargestellt sind die prozentualen Abweichungen der logarithmierten Menge GE / µl

Im Dokument Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen (Seite 102-0)