Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen sowie Effizienz

Die untere Nachweis- resp. Quantifizierungsgrenze ist definiert als kleinste Menge des Analyten, die noch detektiert resp. mit ausreichender Präzision quantifiziert werden kann (ANON. 1998b). Die Nachweisgrenze einer real-time PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis wurde mit 4 x 10⁴ GE pro Gramm Kot resp. 1 GE pro Reaktion angegeben (LINDECRONA et al. 2002). In einer multiplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B.

pilosicoli wurde die Nachweisgrenze für alle drei Erreger mit 10² bis 10³ Bakterien pro Gramm Kot angegeben, wobei die Bande der PCR-Produkte bei einem Gehalt von 10² Bakterien pro Gramm Kot nach der Gelelektrophorese nur sehr schwach zu erkennen war (LA et al. 2006). Die Ergebnisse dieser Studie sind kritisch zu bewerten, da sie voraussetzen, dass nach Zugabe von 10² Erregern zu 200 mg Kot die Wiederfindungsrate der spezifischen Genomfragmente nach Extraktion der DNA mittels QIAamp^® DNA Stool Mini Kit 100 % beträgt. Diese Ausbeute ist jedoch aufgrund einer limitierten DNA Bindungskapazität der Säule im Kit nicht möglich (pers. Mitteilung Dr. Klug, Qiagen, 10.10.2007). Nur wenn in den Kotproben keine weitere DNA vorhanden gewesen wäre, hätten 100 % der zugegebenen DNA wieder isoliert werden können. Unter dieser Voraussetzung müsste die Sensitivität der PCR etwa 1-5 GE pro Reaktion betragen, was nach heutigem Kenntnisstand für eine multiplex-PCR sehr unwahrscheinlich ist. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse könnte die Bestimmung der Keimzahl mittels IFT vor der Präparation der Proben sein. Wenn mit dieser Methode nicht jede Zelle mit einem Antikörper markiert ist, wird die Anzahl der Zellen zwangsläufig unterschätzt. Darüber hinaus färbt der Vergleichsmethode zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität herangezogen wurde, beträgt 10³ GE pro ml Plasmidlösung (NATHUES 2007). Diese Plasmidlösung, die als Ausgangsmaterial diente, wurde durch die Verwendung eines

Milliliter mit 50 µl) und die Elutionslösung dann mittels PCR untersucht. Aus diesem Grund kann die Sensitivität der multiplex-PCR ebenfalls nur indirekt mit der Sensitivität der real-time PCR verglichen werden.

In einer nested-PCR zum Nachweis von L. intracellularis wurde die Nachweisgrenze mit 10³ Lawsonien pro Gramm Kot angegeben (JONES et al. 1993). Auch hier können die Ergebnisse nicht mit denen der real-time PCR verglichen werden, weil die Quantifizierung für die Bestimmung der Sensitivität der nested-PCR mit einem IFT vorgenommen wurde. Es ist mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen, dass das untere Detektionslimit der nested-PCR aufgrund der genannten Einschränkungen des IFT überschätzt wurde.

In der neu etablierten und validierten real-time PCR beträgt die untere Nachweisgrenze 1 GE / Reaktion und entspricht somit einer zuvor beschriebenen real-time PCR zum Nachweis von L. intracellularis (LINDECRONA et al. 2002).

Da in dieser Studie die DNA resp. GE der Bezugswert ist, wird kein direkter Vergleich zu anderen Methoden vorgenommen, in denen die Nachweisgrenze an mittels IFT quantifizierten Erregermengen in Kot untersucht wurde. Darüber hinaus wurde in anderen Untersuchungen auf weitere Faktoren, wie z.B. die Wiederfindung zugesetzter Ziel-DNA in Kotproben, nicht eingegangen; ein möglicher Einfluss dieses Faktors kann retrospektiv nicht eingeschätzt werden.

In der real-time PCR ist die Zunahme eines Fluoreszenzsignals die Grundlage für die Berechnung des ursprünglichen DNA Gehaltes (HIGUCHI et al. 1992, BUSTIN 2000).

Wenn die Ausgangsmenge der template-DNA zu Beginn der Reaktion bereits so hoch ist, dass die überwiegende Zahl von Sonden hybridisiert, kann es zu keinem oder einem geringen Anstieg der Fluoreszenz kommen. Aus diesem Grund gibt es für die real-time PCR auch eine obere Nachweisgrenze. Das real-time PCR-System kann in solchen Fällen keine Amplifikationskurve berechnen, da ∆Rn null oder sehr nahe null ist. In der hier entwickelten real-time PCR liegt die obere Nachweisgrenze bei 10⁸ GE/ µl Reaktionsvolumen, da ab 10⁹ GE/ µl Reaktionsvolumen eine Zunahme des Fluoreszenzsignals vom real-time Gerät nicht mehr erkannt werden konnte. Der Grenzwert entspricht einer Menge von 1x 10¹² GE pro ml Plasmidlösung. Da bei infizierten Schweinen mit einer maximalen Ausscheidung von etwa 7x 10⁸ Erregern pro Gramm Kot zu rechnen ist (SMITH u. MCORIST 1997), liegt die obere Nachweisgrenze über der zu erwartenden Erregermenge in einer Probe. In dieser

Studie betrug die maximal nachgewiesene Erregermenge in Proben natürlich infizierter Schweine etwa 5x 10⁶ GE / µl Reaktionsvolumen und war damit weit unterhalb der oberen Nachweisgrenze.

Eine exakte Quantifizierung von L. intracellularis war mit den bislang beschriebenen PCRs zum Nachweis spezifischer Genomfagmente nicht möglich resp. nicht durchgeführt worden. Konventionelle PCRs müssen im Anschluss an die eigentliche Reaktion ausgewertet werden und führen nur zu qualitativen oder semiquantitativen Ergebnissen (HIGUCHI et al. 1992). Eine bereits beschriebene real-time PCR zum Nachweis von L. intracellularis ist für eine Quantifizierung nicht validiert worden (LINDECRONA et al. 2002).

In der vorliegenden Untersuchung wurden über die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen hinaus weitere Güteparameter ermittelt, die zur Beurteilung einer quantitativen Messmethode notwendig sind. Bei der Anwendung einer solchen Methode dürfen nach allgemeiner Auffassung nur Werte zur Quantifizierung herangezogen werden, die im Kalibrationsbereich des Testes liegen. Der Kalibrationsbereich muss ein geeignetes Maß an Präzision und Linearität aufweisen (ANON. 1998b). Der Kalibrationsbereich der hier beschriebenen real-time PCR wurde an der Standardkurve berechnet und umfasst den Bereich von 10⁰ bis 10⁷ GE / µl Reaktionsvolumen. Ein ähnlicher, jedoch kleinerer Kalibrationsbereich (10⁴ bis 10⁹ Plasmide pro ml Ausgangsmaterial, das entspricht 10¹ bis 10⁶ Plasmide pro µl) wurde auch in der quantitativen real-time PCR zum Nachweis des porcinen Circovirus Typ 2 ermittelt (OLVERA et al. 2004). Die untere Quantifizierungsgrenze der real-time PCR beträgt 10¹ GE / µl Reaktionsvolumen, da sich die Ct-Werte der Konzentrationsstufen 10⁰ und 10^-1 GE / µl nicht mehr signifikant unterscheiden. Eine Zuordnung von Ct-Werten zu einem Gehalt von GE darf unter diesen Umständen nicht mehr erfolgen. Konzentrationen von mehr als 10⁷ GE/ µl Reaktionsvolumen führen zu Ct-Werten, die ebenfalls nicht mehr proportional zur eingesetzten Menge der Ziel-DNA sind. Aus diesem Grund ist auch hier die Linearität der Ct-Werte nicht mehr gegeben und bedingt somit die obere Quantifizierungsgrenze von 10⁷ GE / µl Reaktionsvolumen.

Die Effizienz einer Amplifikation hat für die Quantifizierung von Genomfragmenten mittels real-time PCR eine herausragende Bedeutung und muss für Probe und Standard gleich sein (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier beschriebenen real-time PCR ist die zu amplifizierende Sequenz in der Probe und im Plasmid für den Standard identisch, so dass eine identische Effizienz für die Reaktionen angenommen werden kann. Zu Beginn einer PCR kommt es theoretisch nach jedem Reaktionszyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Nach 3,33 Zyklen ist entsprechend eine Verzehnfachung der ursprünglichen Menge der target-DNA anzunehmen; die Effizienz einer solchen Reaktion entspräche 100 %. Die Effizienz einer real-time PCR wird aus der Steigung der Standardkurve berechnet, die idealerweise -3,33 beträgt (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier entwickelten real-time PCR beträgt die Steigung der Standardkurve -3,329. Aus diesem Wert lässt sich eine Effizienz von 99,7 % ableiten, die als ideal zu bewerten ist.