3 Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.5 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis
3.2.5.1 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in unterschiedlich erhitzten Brühwursterzeugnissen
3.2.5.1.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 75°C Wasserbadtemperatur
Für die Herstellung einer Brühwurst mit verschiedenen Konzentrationsstufen an Rindergehirnhomogenat wurde Brät für pasteurisierte Fleischerzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) und Gehirnhomogenat (Kapitel 3.1.1.1) wie folgt miteinander vermengt (Tabelle 10):
Tabelle 10: Dotierung des Brätes mit bovinem Gehirngewebe
Konzentration
im Fleischerzeugnis Einwaage an Brät Einwaage an
Rindergehirnhomogenat
0 % 100 g 0 g
0, 25 % 199,5 g 0,5 g
0,5 % 199 g 1 g
1 % 99 g 1 g
5 % 95 g 5 g
100 % 0 g 10 g
Anschließend wurden die einzelnen Brät-Rindergehirn-Gemische nochmals in der Moulinette vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der Brühwurstmasse zu gewährleisten. Dann wurde von den so vermengten Gemischen je 100 g abgewogen und jeweils separat in 200 ml Probengefäße unter Vermeidung größerer Luftblasen eingefüllt. Die 10 g natives Gehirngewebe wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten in ein Wasserbad mit 75°C Wassertemperatur verbracht. Von den so gewonnenen Produkten wurden nach Abkühlung jeweils 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen und weiterverarbeitet. Die weitere Probenentnahme fand im wöchentlichen Abstand über einen Zeitraum von 35 Tagen statt. Der hier beschriebene Versuch wurde insgesamt viermal durchgeführt. Die Dotierung einer Probe mit 0,25 % Rindergehirngewebe erfolgte nur in einer der vier durchgeführten Versuchsreihen. Bei einem dieser Versuche wurde zusätzlich ein
Probengefäß mit 100 g Brät mitgeführt, bei dem die Kerntemperatur in der Probe erfasst wurde.
3.2.5.1.2 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 95°C Wasserbadtemperatur
Das Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) wurde wie in 3.2.5.1.1 beschrieben mit verschiedenen Konzentrationen an bovinem Gehirngewebe dotiert. Die einzelnen Brät-Rindergehirn-Gemische wurden anschließend nochmals in der Moulinette vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der Brätmasse zu gewährleisten. Von diesen Gemischen wurden je 100 g abgewogen und jeweils separat in 200 ml Probengefäße unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. 10 g natives Gehirngewebe vom Kalb, die in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingefüllt wurden, dienten als Positivkontrolle. Zusätzlich wurden 100 g eines nicht mit Gehirngewebe dotierten Brätes in einem 200 ml Probengefäß mitgeführt, in das ein Temperaturmessfühler in Form eines Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der Kerntemperatur zu verfolgen. Die Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten im Wasserbad mit einer Temperatur von 95°C gebrüht. Dann wurde von den abgekühlten Brühwurstprodukten jeweils eine Probe von 100 mg zur RNA-Extraktion entnommen. Die weitere Beprobung fand im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 35 Tagen statt. Diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt.
3.2.5.1.3 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 100°C Wasserbadtemperatur
Brät für sterilisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.2) wurde mit Gehirngewebe vom Kalb wie folgt mit der Moulinette gemischt und je 100 g in 200 ml Probengefäße eingefüllt (Tabelle 11):
Tabelle 11: Dotierung des Brätes mit bovinem Gehirngewebe
Konzentration
im Fleischerzeugnis Einwaage an Brät Einwaage an
Rindergehirnhomogenat
0 % 100 g 0 g
0, 25 % 199,5 g 0,5 g
0,5 % 199 g 1 g
1 % 99 g 1 g
5 % 95 g 5 g
100 % 0 g 10 g
In dieser Versuchsreihe wurde ebenfalls zusätzlich ein 200 ml Probengefäß mit 100 g Brät ohne Gehirngewebe mitgeführt, in das ein Temperaturmessfühler in Form eines Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der Kerntemperatur zu verfolgen.
Anschließend wurden die Probengefäße in ein auf 100°C geheiztes Wasserbad gegeben und für 65 Minuten gebrüht. Von den abgekühlten Brühwursterzeugnissen wurde anschließend je 100 mg Probe für die RNA-Extraktion abgewogen. Die weitere Beprobung fand auch hier im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 28 Tagen statt. Auch diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt.
3.2.5.2 Herstellung von Vollkonserven
Auch in diesem Versuch wurde Brät für sterilisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.2) mit Gehirngewebe vom Kalb wie folgt mit der Moulinette gemischt und je 200 g in 230 ml Konservengläser eingefüllt (Tabelle 12):
Tabelle 12: Dotierung des Brätes mit bovinem Gehirngewebe Konzentration
im Fleischerzeugnis
Einwaage an Brät Einwaage an Gehirngewebe
0 % 200 g 0 g
0, 25 % 199,5 g 0,5 g
0,5 % 199 g 1 g
1 % 198 g 2 g
5 % 190 g 10 g
Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt:
A) Produktion eines einfachen Satzes an Vollkonserven mit anschließender Beprobung im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 28 Tagen. Die geöffneten Konserven wurden bei 4°C gelagert
B) Produktion eines dreifachen Satzes an Vollkonserven mit anschließender Beprobung im vier-wöchentlichen Abstand. Die Beprobung fand an Tag 0, Tag 28 und an Tag 56 statt. Die nicht angebrochenen Konserven wurden bei Raumtemperatur gelagert
Für die Beprobung wurden jeweils 100 mg einer Probe für die RNA-Extraktion abgewogen.
Zudem wurde bei beiden Versuchsansätzen jeweils eine Konserve mit 0 % bovinem Gehirngewebe mit einer Messelektrode versehen, um den Verlauf der Kerntemperatur verfolgen zu können. Die dabei ermittelten F-Werte werden folgendermaßen definiert:
C
F12110°°C [min] = FS-Werte
Bei der unter B) genannten Versuchsreihe wurden aufgrund des niedrigen Fassungsvermögens der Moulinette pro Konzentrationsstufe drei Aliquots aus der gleichen Brät-Gehirngewebe-Masse hergestellt, die anschließend gründlich miteinander vermengt wurden. Somit entstand pro Konzentrationsstufe 600 g Brät, das in drei gleiche Portionen zu 200 g geteilt und dann separat in 230 ml Konservengläser abgefüllt wurde. Nachfolgend wurden die befüllten Konservengläser in einen Korimaten verbracht und gekocht.
In das Steuerprogramm des Korimaten wurden zuvor folgende Parameter eingegeben:
1. Kerntemperatur: max. 110°C 2. Kesseltemperatur: max. 115°C 3. F-Wert (FS): 4
3.2.5.3 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in einen Leberwursterzeugnis
Leberwurstbrät (Kapitel 3.2.2) wurde mit bovinem Gehirngewebe wie folgt in der Moulinette homogen vermengt (Tabelle 13):
Tabelle 13: Dotierung der Leberwurstmasse mit Rindergehirngewebe
Konzentration im Fleischerzeugnis
Einwaage an
Leberwurstmasse Einwaage an Rindergehirnhomogenat
0 % 300 g 0 g
0, 25 % 299,25 g 0,75 g
0,5 % 298,5 g 1,5 g
1 % 297 g 3 g
5 % 285 g 15 g
Die Moulinette wurde nach der Herstellung jeder Konzentrationsstufe gründlich mit Wasser und Seifenlauge gereinigt. Die Leberwurstmasse jeweils in Walsroder Kunstdarm gefüllt und die einzelnen Konzentrationsstufen mit verschiedenfarbigen Wurstbändern gekennzeichnet.
Die Würste wurden anschließend in feste Plastikbeutel vakuum-eingeschweißt, um eine mögliche Kontamination des Kochkessels mit bovinen Gehirngewebe durch austretende Wurstmasse zu verhindern. Danach wurden die Würste im Kochkessel mit 80°C Wassertemperatur für 85 Minuten gegart. Dabei fand in den ersten 15 Minuten die Temperaturangleichung der Würste an das Wasserbad statt, während der eigentliche Garvorgang 70 Minuten dauerte. Daraufhin wurden die Würste in ein mit kaltem Wasser gefülltes Wasserbecken verbracht und während des Auskühlungsvorganges durchgeknetet, um möglichen Fettabsatz zu vermeiden. Nachdem die Würste abgekühlt waren, wurden sie über Nacht in ein Kühlhaus verbracht. Am nächsten Tag wurden die Würste für die RNA-Extraktion beprobt. Die weitere Beprobung fand im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 28 Tagen statt. Auch diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt.
3.2.5.4 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystem (PNS) auf den Nachweis boviner GFAP-mRNA in einem Brühwursterzeugnis
Bei diesem Versuch wurde Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) wie folgt mit bovinem peripheren Nervengewebe (Kapitel 3.1.1.2) vermengt (Tabelle 14):
Tabelle 14: Dotierung des Brätes mit bovinem peripheren Nervengewebe
Konzentration im
Fleischerzeugnis Einwaage an Brät Einwaage an peripheren Nervengewebe (PNS)
0 % 100 g 0 g
0, 25 % 199,5 g 0,5 g
0,5 % 199 g 1 g
1 % 99 g 1 g
5 % 95 g 5 g
Die jeweiligen Brät-PNS-Gemische wurden anschließend nochmals in der Moulinette vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des peripheren Nervengewebes in der Brühwurstmasse zu gewährleisten. Dann wurden je 100 g abgewogen und separat in 200 ml Probengefäße unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. Zusätzlich wurden bei dieser Versuchsreihe 10 g natives, bovines peripheres Nervengewebe und 10 g natives Gehirngewebe vom Kalb als Kontrollen jeweils separat in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt. Nachfolgend wurden die Probengefäße für 65 Minuten in ein Wasserbad mit 75°C Wassertemperatur verbracht und von den abgekühlten Brühwurstprodukten, dem erhitzten peripheren Nervengewebe sowie dem bovinen Gehirngewebe jeweils eine Probe von 100 mg für die RNA-Extraktion entnommen. Parallel wurde als Positivkontrolle eine Probe von 100 mg des nativen, bovinen peripheren Nervengewebes für die RNA-Extraktion gezogen.
Diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt.
3.2.6 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis porciner GFAP-mRNA
3.2.6.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 80°C Wasserbadtemperatur
Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.2.1) wurde mit porcinem, homogenisierten Gehirngewebe (Kapitel 3.1.1.1) wie folgt für die verschiedenen Konzentrationsstufen vermengt (Tabelle 15):
Tabelle 15: Dotierung des Brätes aus Schweinefleisch mit porcinem Gehirngewebe
Konzentration im
Fleischerzeugnis Einwaage an Brät Einwaage an
Schweinegehirnhomogenat
0 % 100 g 0 g
0, 25 % 199,5 g 0,5 g
0,5 % 199 g 1 g
1 % 99 g 1 g
5 % 95 g 5 g
100 % 0 g 10 g
Die einzelnen Brät-Schweinegehirn-Gemische wurden anschließend in der Moulinette vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der Brühwurstmasse zu erreichen. Von den so vermengten Gemischen wurde 100 g abgewogen und jeweils separat in 200 ml Probengefäße sowie 10 g natives Gehirngewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. Zusätzlich wurde ein Probengefäß mit 100 g Brät ohne Gehirngewebe mitgeführt, in das ein Temperaturmessfühler in Form eines Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der Kerntemperatur zu verfolgen. Die Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten in ein Wasserbad mit 75°C Wassertemperatur verbracht. Nach Abkühlung wurde von den Brühwurstprodukten jeweils 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die weitere Beprobung fand im wöchentlichen Abstand über einen Zeitraum von 28 Tagen statt. Die hier beschriebene Versuchsreihe wurde insgesamt viermal durchgeführt.